病毒样颗粒的纯化的制作方法_2

面可应用于纯化任何VLP及其变体。在一些实施方案中， VLP是属于杯状病毒科的病毒。在一些实施方案中，VLP是诺如病毒VLP，包括嵌合或工程 化变体。在一些实施方案中，VLP是沙波病毒VLP。
[0037] 还可以理解，本发明的方案可应用于VLP纯化，其导致活病毒传染剂被除去。在一 些实施方案中，活病毒是无包膜病毒，例如细小病毒、轮状病毒、和/或类似物。在一些实施 方案中，活病毒是有包膜病毒，例如杆状病毒、逆转录病毒、漂游病毒（errantivirus)、虫媒 病毒（arbovirus)、呼吸道合胞病毒、和/或类似物。
[0038] 此外，本发明人发现，用溶剂和/或去污剂处理是失活和除去病毒污染的有用步 骤，包括残余杆状病毒（如果VLP是使用杆状病毒表达系统生产的话）。因此，本发明的方法 可以额外或可选择地包括至少一个色谱处理，其涉及用溶剂和/或去污剂处理与包含VLP 的组合物接触的（例如色谱柱的）色谱材料，和/或在与色谱材料接触之前，向包含VLP的 组合物中添加溶剂/去污剂。随后将VLP从色谱材料上洗脱，并采用SDR Hyper-D除去残 余溶剂/去污剂。
[0039] 此外，本发明人发现，用一个或多个深层过滤器，例如硅藻土和/或合成深层过滤 器，进行深层过滤是除去残余污染核酸的有用步骤，包括杆状病毒核酸（如果VLP是使用杆 状病毒表达系统生产的话）。因此，本发明的方法可以额外或可选择地包括通过深层过滤处 理澄清任何含有VLP和残余污染核酸的溶液，从而产生纯化的深层过滤溶液。
[0040] 本发明人还发现，通过一种或多种上述处理产生的纯化溶液可有利地导致纯化溶 液与任何纯化前溶液相比，残余污染蛋白相对于VLP减少。因此，作为纯化的结果，本发明 的溶液可以显示残余污染蛋白相对于VLP减少。
[0041] 本发明人还发现，通过一种或多种上述处理产生的纯化溶液可有利地导致与任何 纯化前溶液相比，具有全长VPl亚单位的VLP的VLP水平相对增加。因此，作为纯化的结果， 本发明的溶液可以显示具有全长VPl亚单位的VLP的水平增加。
[0042] 纯化病毒样颗粒（VLP)的方法包括产生或获得含有所述VLP的细胞裂解物、培养 物上清液或滤出液。该方法还包括将裂解物、上清液或滤出液的pH调节到小于大约5的pH 值，从而产生pH被调节的溶液。该方法还包括从包含VLP的pH被调节的溶液中除去非VLP 微粒/聚集物，从而产生纯化溶液。
[0043] 在一些实施方案中，VLP生产产生了至少包含VLP的第一亚群和第二亚群以及其 他处理污染材料的细胞裂解物、培养物上清液或滤出液。在一些实施方案中，裂解物、上清 液或滤出液是批量（bulk)生产培养物，或者从批量生产培养物产生。在一些实施方案中， 裂解物、上清液或滤出液从已经通过过滤和/或离心进行了预澄清的培养物上清液获得。
[0044] 在一些实施方案中，VLP的亚群根据它们对pH处理的不同响应，根据所诱发的抗 原应答，和/或根据结构差异进行表征。因此，可以想象可能存在超过2种VLP亚群，这取 决于病毒。在一些实施方案中，所产生的VLP是诺如病毒VLP，包含具有全长VPl亚单位的 诺如病毒VLP的第一亚群，和包含具有截短的VPl亚单位的诺如病毒VLP的第二亚群。在 一些实施方案中，诺如病毒VLP是如下的一种或多种：诺如病毒基因群I VLP，诺如病毒基 因群II VLP，诺如病毒基因群III VLP，诺如病毒基因群IV VLP，和诺如病毒基因群V VLP。 在一些实施方案中，VLP是酸稳定的VLP。
[0045] 本发明的方法包括调节裂解物、上清液或滤出液的pH，以便将VLP与处理污染物 和异常形成的VLP样结构分离。处理污染物可以包括，但不仅限于，多糖，残余污染蛋白如 宿主细胞蛋白，残余污染核酸如宿主细胞核酸，脂质，介质成分，活传染剂如活宿主细胞病 毒（例如杆状病毒），和类似物，以及任何前述污染物的组装物或聚集物。异常形成的VLP 样结构可以是任何与期望的VLP结构不同的VLP结构，所述不同是基于其对环境条件（例 如pH处理或温度）的不同响应，所诱发的抗原应答，结构差异，分离模式（例如色谱、沉淀 或过滤），和/或类似情况。
[0046] 在一些实施方案中，裂解物、上清液或滤出液的pH被调节到小于大约5,从而产生 pH被调节的溶液。在一些实施方案中，裂解物、上清液或滤出液的pH被调节到小于大约 4. 5,小于大约4,小于大约3. 5,小于大约3. 4,小于大约3. 3,小于大约3. 2,小于大约3. 1， 小于大约3,小于大约2. 9,小于大约2. 8,小于大约2. 7,小于大约2. 6,小于大约2. 5,小于 大约2,小于大约1.5,小于大约1，和其间的全部范围/亚范围。
[0047] 裂解物、上清液或滤出液的pH通过本领域技术人员已知的任何方法进行调节。在 一些实施方案中，pH通过向裂解物、上清液或滤出液添加一种或多种导致酸化的试剂而加 以调节。酸化剂的实例可以包括：盐酸、乙酸、硫酸和磷酸。所添加试剂的pH、体积和组成 可以被合适地选择，这是本领域已知的。
[0048] 在一些实施方案中，裂解物、上清液或滤出液pH调节和/或处理的时间为大约30 分钟。在一些实施方案中，裂解物、上清液或滤出液pH调节和/或处理的时间为大约1小 时，大约2小时，大约3小时，大约4小时，大约5小时，大约10小时，大约15小时，大约20 小时，大约25小时，大约30小时，大约35小时，大约40小时，大约45小时，大约46小时， 大约47小时，大约48小时，和其间的所有范围和/或亚范围。
[0049] 在一些实施方案中，裂解物、上清液或滤出液包括VLP的第一亚群和第二亚群，如 早前所讨论的，并且调节裂解物、上清液或滤出液的PH导致第一和第二亚群不均匀分布。 在一些实施方案中，pH处理导致在pH被调节的溶液中形成微粒和/或聚集物，VLP的第二 亚群基本上发现于所得微粒/聚集物中，而VLP的第一亚群保留在pH被调节的溶液的体积 内。在一些实施方案中，例如本文中纯化的诺如病毒基因群II VLP，第二亚群包括含有截短 的VPl蛋白的VLP，相比之下，第一亚群包含具有全长VPl蛋白的VLP。
[0050] 在一些实施方案中，纯化VLP的方法进一步包括将非VLP微粒/聚集物从pH被调 节的溶液中除去，从而产生纯化溶液。在一些实施方案中，除去包括，但不仅限于，一种或多 种如下的处理：离心、沉淀、絮凝、沉降和过滤。在一些实施方案中，分离至少涉及离心，以除 去微粒/聚集物。
[0051] 在一些实施方案中，除去非VLP微粒/聚集物包括将VLP的第二亚群从pH被调节 的溶液中分离，从而产生纯化溶液，其中纯化溶液基本上保留VLP的第一亚群。换言之，微 粒/聚集物包括VLP的第二亚群。这样，选择除去非期望的VLP亚群可以在收获处理的早 期阶段实现，即在培养物澄清期间。
[0052] 在一些实施方案中，除去/澄清通过一个或多个过滤处理完成。合适的过滤包括， 但不仅限于，深层过滤、膜过滤、化学过滤、和/或类似方法。在一些实施方案中，至少一个 过滤处理是使用一个或多个深层过滤器的深层过滤。深层过滤可以指任何采用多孔过滤器 /过滤介质的过滤处理。合适的深层过滤器包括，但不仅限于，硅藻土深层过滤器、合成深层 过滤器、和/或类似物。使用深层过滤器的好处包括容易操作和可以获得一次性材料，避免 了重复使用装置（reused equipment)所要求的清洁确认。在一些实施方案中，也可以任意 地采用一种或多种额外的过滤处理，例如使用亚微米过滤器。
[0053] 在一些实施方案中，在这一步骤之后，VLP第一亚群与残余污染蛋白的比值被增加 至少大约2倍。在一些实施方案中，VLP第一亚群与残余污染蛋白的比值被增加至少大约3 倍，至少大约4倍，至少大约5倍，至少大约10倍，至少大约15倍，至少大约20倍，至少大 约50倍，至少大约75倍，至少大约100倍，和其间的所有数值。
[0054] 在一些实施方案中，在过滤之后，至少大约50 %的残余污染核酸被从裂解物、上清 液或滤出液中除去。术语"残余污染核酸"能够包括，但不仅限于，宿主细胞核酸、宿主细胞 病毒的核酸、生产病毒（即用于产生VLP)的核酸，和/或类似物。在一些实施方案中，至 少大约55 %的残余污染核酸，至少大约60 %的残余污染核酸，至少大约61 %的残余污染核 酸,至少大约62 %的残余污染核酸，至少大约63 %的残余污染核酸，至少大约64 %的残余 污染核酸，至少大约65 %的残余污染核酸，至少大约66 %的残余污染核酸，至少大约67% 的残余污染核酸，至少大约68 %的残余污染核酸，至少大约69 %的残余污染核酸，至少大 约70 %的残余污染核酸，至少大约75 %的残余污染核酸，至少大约80 %的残余污染核酸， 至少大约85 %的残余污染核酸，至少大约90 %的残余污染核酸，至少大约91 %的残余污 染核酸，至少大约92 %的残余污染核酸，至少大约93 %的残余污染核酸，至少大约94 %的 残余污染核酸，至少大约95 %的残余污染核酸，至少大约96 %的残余污染核酸，至少大约 97 %的残余污染核酸，至少大约98 %的残余污染核酸，至少大约99 %的残余污染核酸，至 少大约100%的残余污染核酸，和其间的全部数值，被从裂解物、上清液或滤出液中除去。
[0055] -般地，VLP在特定处理步骤之后的纯化程度可以通过VLP浓度与任何其他成分 浓度的比值变化进行测量（相对于裂解物、上清液或滤出液）。例如，可以计算VLP浓度与 传染剂浓度之间的比值，VLP浓度与残余污染蛋白之间的比值，和/或VLP浓度与宿主细胞 处理污染物之间的比值。
[0056] 在一些实施方案中，纯化VLP包括，在将VLP第二亚群从pH被调节的溶液中除去 之后，从纯化溶液分离VLP的第一亚群。在一些实施方案中，将VLP第一亚群从纯化溶液中 分离包括任何合适的分离处理，例如离心（如连续流）、沉淀、相分离、切向流过滤、缓冲液 交换方法，和/或类似方法。在一些实施方案中，将VLP第一群从纯化溶液分离包括使用一 种或多种色谱处理。每一个色谱处理可以独立地选自下组，但不仅限于，羟基磷灰石色谱、 疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、混合模式色谱、和亲和色谱。离子交换色 谱可以是阴离子交换色谱或阳离子交换色谱。
[0057] 在一些实施方案中，在这一步骤之后，VLP第一亚群与残余污染蛋白的比值被增加 至少大约2倍。在一些实施方案中，VLP第一亚群与残余污染蛋白的比值被增加至少大约 3倍，至少大约4倍，至少大约5倍，至少大约10倍，至少大约15倍，至少大约20倍，至少 大约50倍，至少大约75倍，至少大约100倍，和其间的所有数值。在一些实施方案中，在此 步骤之后，至少大约50%的残余污染核酸被从裂解物、上清液或滤出液中除去。术语"残余 污染核酸"能够包括，但不仅限于，宿主细胞核酸、生产病毒核酸、病毒核酸、细菌核酸、真菌 核酸，来自其它可能与本文所述系统和方法有关或无关的生物体的核酸，和/或类似物。在 一些实施方案中，至少大约55%的残余污染核酸，至少大约60%，至少大约61%，至少大约 62%，至少大约63%，至少大约64%，至少大约65%，至少大约66%，至少大约67%，至少 大约68%，至少大约69%，至少大约70%，至少大约75%，至少大约80%，至少大约85%， 至少大约90%，至少大约91%，至少大约92%，至少大约93%，至少大约94%，至少大约 95 %，至少大约96 %，至少大约97 %，至少大约98 %，至少大约99 %，至少大约100 %，和其 间的全部数值的残余污染核酸，被从裂解物、上清液或滤出液中除去。
[0058] 本发明人还发现，溶剂和/或去污剂处理步骤可用于将活病毒传染剂（例如杆状 病毒）从VLP制备物中纯化除离。如早前提到的，溶剂和/或去污剂可以在与色谱柱接触 之前添加到VLP制备物中，和/或能够在与色谱柱接触之前添加到批量溶液中，和/或能够 在与VLP制备物接触之后添加到色谱柱中。因此，尽管本文出于简化的目的通过柱上溶剂/ 去污剂处理进行的描述，但是应当理解，这些可能性的每一个均在本发明的范围内。在这些 实施方案中，本发明方法包括产生或获得含有VLP的细胞裂解物、培养物上清液或滤出液， 和使用多步色谱处理纯化VLP。多步色谱处理中的至少一个色谱处理包括使裂解物、上清液 或滤出液与色谱材料接触，其中VLP与所述色谱材料结合。至少一个色谱处理还包括用溶 剂和/或去污剂处理色谱材料。至少一个色谱处理进一步包括在处理后将VLP从色谱材料 上洗脱。
[0059] 在一些实施方案中，至少一个色谱处理还包括用溶剂和/或去污剂处理色谱材 料。在一些实施方案中，色谱材料是色谱柱，并且处理包括用溶剂和/或去污剂的柱上处理 或清洗。可以采用任何合适的溶剂和/或去污剂。在一些实施方案中，溶剂是有机溶剂，并 且包括但不仅限于，如下的一种或多种：磷酸三丁酯（TnBP)。在一些实施方案中，去污剂包 括，但不仅限于，如下的一种或多种：Triton X-100、辛基酚环氧乙烧冷凝物（octylphenol ethyleneoxide condensate)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（polyoxyethylene sorbitan monooleate)、和胆酸钠，和其各种组合。组合物实例包括：非离子去污剂（包括Triton X-100和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯），两性离子去污剂（包括CHAPS和Zwittergent 3-12))和离子去污剂（包括胆酸钠和二甲基二（十八烷基）溴化铵）。
[0060] 在一些实施方案中，溶剂和/或去污剂包括至少大约0.01 %去污剂（w/v)，至少 大约0. 1 %,至少大约0. 2%，至少大约0. 3%，至少大约0. 4%，至少大约0. 5%，至少大约 1 %,至少大约2%，至少大约3%，至少大约4%，至少大约5%，至少大约10%去污剂（w/ v)，和其间的所有数值。在一些实施方案中，溶剂和/或去污剂包括至少大约0. 01 %溶剂 (w/v)，至少大约0. 1%，至少大约0. 2%，至少大约0. 3%，至少大约0. 4%，至少大约0. 5%, 至少大约1%，至少大约2%，至少大约3%，至少大约4%，至少大约5%，至少大约10%溶 剂（w/v)，和其间的所有数值。在一些实施方案中，溶剂和/或去污剂额外地含有通用的生 物缓冲液（例如，乙酸、柠檬酸、组氨酸、磷酸、Tris、和/或类似物）和/或盐（例如，氯化 钠、氯化钾、氯化镁、和/或类似物）。