06] 为了产生期望百分比的聚集，蔗糖与壳聚糖的合适比值可以根据指导加以确定。 含有质量比范围为大约2:1-大约10:1的蔗糖与壳聚糖的冻干前混合物在冻干后可以产生 大约50 % -100 %的完整病毒抗原（即0 % -50 %的聚集抗原），这取决于冻干前溶液的浓 度。0:1的蔗糖与壳聚糖质量比会产生少于30%的完整诺如病毒抗原（即大于70%的聚 集抗原）。同时省略蔗糖和壳聚糖并且仅适用膨胀剂如甘油，将产生少于10%的完整抗原 (即大于90%的聚集抗原，这取决于冻干前溶液浓度）。使用这些指导，技术人员可以调节 冻干前混合物中蔗糖与壳聚糖的质量比和浓度，以获得产生最佳免疫应答所需的期望量的 聚集。
[0107] 疫苗可以按照与剂量制剂相容的方式给药，并且给药量是治疗有效的和致免疫 的。而且，实现疫苗佐剂效果的各种方法是已知的，并可以和本文公开的VLP组合使用。
[0108] 可以使用多种宿主表达载体系统表达VLP多肽。这些宿主表达系统代表了可用于 产生VLP多肽从而生成VLP的媒介。
[0109] 在哺乳动物宿主细胞中，可以使用大量基于病毒的表达系统。此外，可以选择宿主 细胞株，其调节插入序列的表达，或者以特定的期望方式修饰和加工基因产物。这些蛋白产 物修饰对于VLP的产生或者VLP多肽的功能或者额外的多肽如佐剂或额外抗原的功能可能 是重要的。不同的宿主细胞对蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性且特异的机 制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达外来蛋白的正确修饰和加工。为此， 可以使用具有用于适当加工初级转录物，基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主 细胞。
[0110] 本发明的某些方面包括与VLP制备物有关的额外抗原，并能够是任何能够引发免 疫应答的物质。在一些实施方案中，抗原可以是任何变应原。变应原包括，但不仅限于，细 胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖偶联物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、 小分子、脂质、糖脂、和碳水化合物。
[0111] 通过参考下面的非限制性实施例可以对本发明有更好的理解。如在本说明书中使 用的，除非另外明确指出，否则单数形式"一"、"一个"和"该"包括复数的参考物。当上述 方法和/或图表（schematic)指示某些按照特定次序发生的事件和/或流程图时，某些事 件和/或流程图的次序可以被修改。例如，通过低PH处理执行的VLP处理可以被执行用于 在疫苗制造过程期间产生的任何处理中间产物，包括但不仅限于，批量生产培养物、澄清的 生产培养物、色谱洗脱级分、色谱流过/清洗级分、超滤/渗滤（diafiltration)保留级分、 和/或处理级分滤出液。
[0112] 此外，某些事件在可能的情况下可以在平行的处理中被同时执行，也可以被顺次 执行。 实施例
[0113] Sf9 培养
[0114] Sf9昆虫细胞的常规培养在烧瓶中在27°C和环境空气饱和状态下执行。Sf9细胞 经过多次传代培养，用于杆状病毒扩增和VLP产生。Sf9培养物的常规计数使用自动细胞计 数仪（T4Cellometer，Nexcelom Bioscience)执行。
[0115] 重组杆状病毒
[0116] 重组杆状病毒的产生是通过使用Cellfectin按照制造商的使用说明将转化载体 和线性杆状病毒DNA共转染到贴壁（adherent)的Sf9昆虫细胞中，随后进行噬斑纯化和额 外轮次的杆状病毒扩增。然后，收获重组杆状病毒作为通过低速离心获得的上清液级分。将 所得的重组杆状病毒调节成10% DMSO终产物（v/v)，分成等份，并保存于-80°c。用于VLP 生产的冷冻杆状病毒的扩增如上所述地执行。
[0117] VLP 生产
[0118] 诺如病毒VLP的生产使用一次性Wave生物反应器执行。对于生物反应器生产，将 Sf-900II无血清培养基无菌转移到Wave生物反应器中，并接种培养物。一旦到达合适的细 胞密度，向生物反应器培养物中无菌添加重组杆状病毒，并在上述条件下温育表达培养物。 生物反应器培养物通常在传染后4-6天收获，这取决于活细胞的密度。
[0119] 除了诺如病毒VLP之外，生产培养物的产生可以通过用含有沙波病毒VPl亚单位 的重组杆状病毒传染。可选择地，生产培养物的产生可以用含有诺如病毒VPl亚单位的重 组杆状病毒传染，其已经被工程化在表面暴露的环区内含有外来氨基酸和/或抗原（嵌合 诺如病毒VLP)。
[0120] 生物反应器收获
[0121] 为了收获，通过添加 HCl将生物反应器培养物调节到pH-3. 0,然后在室温下搅拌 温育2h。然后，通过添加咪唑将培养物调节到pH-5· 0 (Norwalk)或pH-6· 0 (Consensus)，然 后通过低速离心使之澄清。生物反应器的最终澄清通过过滤离心后的上清液执行。在下一 单元操作之前，将所得收获材料（条件培养基）保存在环境室温<24h，或者保存于4°C< 1 周。
[0122] 为了收获含有沙波病毒或嵌合诺如病毒VLP的批量生产培养物，通过研究评估 在pH-2. 5处理30min-48h时间段后的污染物去除和VLP回收。被证明最有利于结构完整 的VLP的回收和除去处理污染物的条件将被用于放大规模的处理。适合于本目的的工程 化VLP，包括嵌合变体的列表可以在概括性见于PCT专利申请系列号PCT/US2011/022094 和美国实用专利申请（utility application)系列号 13/023,363 中，PCT/US2011/022094 于2011年1月21日提出申请，题目为"Calicivirus病毒样颗粒上的靶向异源抗原 呈递(Targeted Heterologous Antigen Presentation on Calicivirus Virus-Like Particles)"，13/023,363于2009年8月10日提出申请，题目为"包含用于增强交联反应 性的Composite衣壳蛋白氨基酸序列的病毒样颗粒（Virus-Like Particles Comprising Composite Capsid Amino Acid Sequences for Enhanced Cross Reactivity)，',本文弓|用 它们的全部内容作为参考。
[0123] 阳离子交换捕获色谱
[0124] 诺如病毒VLP的阳离子交换（CE)捕获色谱使用Sartobind S囊室（capsule)执 行。为了纯化，用乙酸（pH-5· 0)平衡囊室（capsule)，并加载条件培养基（彡I. 5g VLP总）。 然后，用乙酸（pH-5. 0)清洗囊室，直至流过液在280nm(A28CI)的光吸收<200mAU。然后用乙 酸（pH-5. 0)、1% Triton X-KKK0. 2%磷酸三丁酯使囊室饱和，并清洗。经过此次柱上溶剂 /去污剂处理之后，用乙酸（pH-5.0)以lOOmL/min的速度清洗囊室，直至A 28(l〈50mAU。诺如 病毒VLP的洗脱用乙酸（pH-5. 0)和NaCl执行。将VLP洗脱级分收集在一次性瓶或生物处 理袋（bioprocess bag)中。
[0125] 通过阳离子交换色谱纯化Consensus VLP如上所述地执行，只是在所有处理缓冲 液中使用乙酸（pH-6. 0)代替乙酸（pH-5. 0)。
[0126] 羟基磷灰石（HA)捕获色谱
[0127] Norwalk VLP的羟基磷灰石（HA)捕获色谱使用250mL柱床体积CHT陶瓷羟基磷 灰石柱（BioRad)执行。为了纯化，用MES (pH-6.0)平衡囊室（capsule)，并加载条件培养 基（彡250mg VLP总）。然后，用MES (pH-6. 0)清洗囊室，直至流过液在280nm (A28tl)的光吸 收〈20011^1然后用]\^5(?!1-6.0)、1%1'1^〇11乂-100、0.2%磷酸三丁酯使囊室饱和，并清 洗。经过此次柱上溶剂/去污剂处理之后，用MES(pH-6.0)以70mL/min的速度清洗囊室， 直至A 28Q〈50mAU。诺如病毒VLP的洗脱用IOOmM磷酸钠（pH-6. 8)进行清洗，并用400mM磷 酸钠（pH-6.8)进行VLP洗脱。将VLP洗脱级分收集在一次性瓶或生物处理袋（bioprocess bag)中。
[0128] 对于使用柱上溶剂/去污剂处理的沙波病毒或嵌合诺如病毒VLP的色谱，通过研 究评估能够使VLP高效结合并从色谱基质上洗脱的缓冲液条件（pH和离子强度），色谱基质 包括，但不仅限于，阳离子交换柱、羟基磷灰石柱、疏水相互作用柱、尺寸排阻柱、阴离子交 换柱、混合模式柱、或亲和柱。对于被证明最有利于回收结构完整的VLP并除去处理污染物 的条件，将按照与上面列出的相似的方式执行VLP处理（包括溶剂/去污剂处理）。
[0129] VLP 表征
[0130] 纯化后，通过一系列分析方法分析诺如病毒VLP的纯度。SDS-PAGE分析使用 NuPAGE梯度凝胶执行。最终的PAGE凝胶用Imperial Protein Stain染色或银染色。通过 标准的菌斑分析对生产培养物的低pH处理和捕获色谱步骤期间的柱上溶剂/去污剂处理 进行杆状病毒失活评估。
[0131] Norwalk VLP结构完整性分析通过使用尺寸排阻色谱（SEC)和透射电子显微镜 (EM)对纯化产物进行分析。对于SEC，将纯化的Norwalk VLP进行稀释，并在Superose 6 柱上进行分析。对于EM分析，将VLP在L-组氨酸（pH-6. 5)、氯化钠中稀释，点播于铜细网 (mesh grid)上，并用2%乙酸双氧铀染色。
[0132] 结果
[0133] 生物反应器生产一为了开发一种用于生产VLP的可放大规模方法，将Sf9培养物 在Wave生物反应器中生长，使用本领域众所周知的技术用重组杆状病毒进行感染。
[0134] 生物反应器收获一在诺如病毒VLP生产之后，生物反应器培养物含有高水平的活 杆状病毒（?10 7_108pfu/mL)，其在VLP制造期间必须被失活和清除。通过研究确定生产 培养物的低PH处理是否代表了收获期间的一个可行步骤。如表1所示，研究中实现了高 水平杆状病毒（AcNPV)失活（对于Norwalk VLP处理>51og1(l，对于Consensus VLP处理 Mlogltl)，其中生产培养物在室温下在pH〈3. 5下温育lh。表1还证明，实现了高水平的逆转 录病毒（A-MLuV)失活（对于 Norwalk VLP 处理 >71og1(l，对于 Consensus VLP 处理 >61og1(l)。 相反，通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱对生产培养物进行分析的结果证明，在生产培养物的 低pH处理之后，Norwalk和Consensus VLP仍保持可溶并且结构完整。在生产期间，在诺 如病毒VPl亚单位中普遍观察到N端蛋白裂解切割。除了清除显著水平的Sf9宿主细胞蛋 白质外，还证明通过批量培养物的低pH处理还选择性除去了含有截短的VPl的VLP(图IA 和 1B)。
[0135] 表I. Norwalk和Consensus批量生产培养物通过低pH处理使有包膜病毒失活
【主权项】
1. 一种纯化病毒样颗粒（VLP)的方法，包括： 产生或获得含有所述VLP的细胞裂解物、培养物上清液或滤出液（filtrate); 将所述裂解物、上清液或滤出液的pH调节到小于大约5的pH值，从而产生pH被调节 的溶液；和 从pH被调节的溶液除去非VLP微粒（particulate)/聚集物（aggregate),从而产生包 含所述VLP的纯化溶液。
2. 权利要求1的方法，其中该VLP至少包含VLP的第一亚群和第二亚群。
3. 权利要求2的方法，其中所述除去非VLP微粒/聚集物包括从pH被调节的溶液中除 去VLP的第二亚群，其中纯化溶液基本上保留VLP的第一亚群。
4. 权利要求3的方法，进一步包括在从pH被调节的溶液中除去VLP的第二亚群从而产 生纯化溶液之后，从纯化溶液中除去VLP的第一亚群。
5. 权利要求4的方法，其中细胞裂解物或培养物上清液/滤出液的VLP是诺如病毒 (norovirus) VLP，其中第一亚群包括具有全长VP1亚单位的诺如病毒VLP，并且其中第二亚 群包括具有截短的VP1亚单位的诺如病毒VLP。
6. 权利要求4的方法，其中VLP第一亚群与残余污染蛋白的比值被增加至少大约2倍。
7. 权利要求3的方法，其中VLP第一亚群与残余污染蛋白的比值被增加至少大约2倍。
8. 权利要求1的方法，其中所述pH调节被执行大约30分钟至大约48小时的时间。
9. 权利要求1的方法，其中VLP包含酸稳定的VLP。
10. 权利要求1的方法，其中裂解物、上清液或滤出液的被调节pH小于大约3。
11. 权利要求1的方法，其中裂解物、上清液或滤出液的被调节pH小于大约4。
12. 权利要求1的方法，其中所述除去通过一种或多种如下类型的处理执行：离心、沉 淀、絮凝（flocculation)、沉降（settling)和过滤。
13. 权利要求12的方法，其中所述除去包括通过深层过滤（depth filtration)，随后 进行额外的过滤使pH被调节的溶液澄清，从而产生纯化溶液。
14. 权利要求1的方法，其中所述纯化的结果使至少大约65%的残余污染核酸从裂解 物、上清液或滤出液中被除去。
15. 权利要求1的方法，其中所述纯化的结果使至少大约98%的残余污染核酸从裂解 物、上清液或滤出液中被除去。
16. 权利要求1的方法，进一步包括使用一种或多种色谱处理将VLP的第一亚群与纯化 溶液分离，每一个色谱处理均独立地从下组中选出：羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、 尺寸排阻色谱、离子交换色谱、混合模式色谱、和亲和色谱。
17. -种用于纯化病毒样颗粒（VLP)的方法，包括： 产生或获得含有VLP的细胞裂解物、培养物上清液或滤出液；和 使用多步色谱处理纯化VLP，其中该多步色谱处理的至少一个色谱处理包括： 使裂解物、上清液或滤出液与色谱材料接触，其中VLP与所述色 谱材料结合； 用溶剂和/或去污剂处理色谱材料；和 在所述处理后，将VLP从色谱材料洗脱。
18. 权利要求17的方法，