-FhCHIl,35S: -.FhCHim 35S::的导入的确弥补了查尔酮异构酶的功能，生成了相应的花色苷。
[0015]图5不同时期的半定量表达分析及其与花色苷含量的相关性分析:其中，电泳图分别为FhCHim在红花香兰雪花朵绿苞、红绿间、红苞、初开、盛开五个不同时期的半定量RT-PCR表达情况；右边的散点图为基因表达量与花色苷含量在这5个时期的相关性分析，从r值可以看出，的基因表达与花色苷生成含量是正相关的。
【具体实施方式】
[0016]在下面的具体实施例子中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
[0017]实施例1基因全长的克隆
基因全长序列的获得:根据已知的转录组测序结果，设计特异的上游引物和下游引物。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花瓣的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RT-PCR，得到基因全长序列，结果如图一。
[0018]克隆cDNA全长的特异引物和其具体PCR反应条件如下:
引物 CHIFl:TCTAATGACAACAACAACGC CHIRl: TTCTTACGACGTGATCCTTTPCR 条件:预变性 94°C 1min ；变性 94°C 30s ；退火 56°C 30s ；
延伸72°C Imin ；终延伸72°C 1min ；变性到延伸共30个循环。
[0019]引物CHIF2:TTCTGATGACAATGGTGGAG CHIR2:TTTCTCTCTGCCTCTCCATA PCR 条件:预变性 94°C 1min ；变性 94°C 30s ；退火 52°C 30s ；
延伸72°C Imin ；终延伸72°C 1min ；变性到延伸共30个循环。
[0020]引物CHIF5:CTTTCTGCTCAAAATGGGC CHIR5:CCCTCAAACTTCGTGGC PCR 条件:预变性 94°C 1min ；变性 94°C 30s ；退火 54°C 30s ；
延伸72°C Imin ；终延伸72°C 1min ；变性到延伸共30个循环。
[0021]实施例2同源性比对分析
将FhCHIs蛋白质序列和苜蓿MsaCHIl的蛋白质序列用FASTA格式表示，保存为TXT文件，再输进ClustalW2在线软件中将它们的氨基酸进行同源性比对，可以观察到它们最同源的氨基酸位置；再根据比对结果将蛋白质序列放进DNAMAN软件中，完全相同的氨基酸用深蓝色背景显示，观察MsaCHI I的四个活性位点精氨酸(Arg36)、苏氨酸(Thr48)、酪氨酸(Tyr 106)、天冬酰胺(Asnl 13)相对应的地方，FhCHI1、FhCHI2,FhCHI5是否也具有这几个氨基酸。
[0022]
实施例3不同时期的半定量表达分析及其与花色苷含量的相关性分析分别提取红花香兰雪花朵绿苞、红绿间、红苞、初开、盛开五个不同时期的RNA，逆转后得到总cDNA，再以它为模板，用3条基因各自的引物进行半定量RT-PCR，分析其表达量情况。再用SPSS软件，将基因表达量和这五个时期的花色苷积累含量一起进行相关性分析。
[0023]实施例4 35S::FhCHIU35S::FhCHI2、35S::鎮核表达载体在拟南芥t酿变体中的表达
为了验证 FhCHIl、FhCHI2、FhCHI_功能，利用克隆得到的 FhCHIl、FhCHI2、FhCHI_cDNA全长作为模板，用分别带有ZAa I取BamH I酶切位点的引物再次扩增基因开放阅读框。
[0024]分别用BamH I和EcoR I两种限制性内切酶消化上述扩增得到的DNA片段，并将其克隆进入带有35S启动子的质粒PBI121中，这样构建的重组质粒命名为35S:: FhCHI，并导入农杆菌GV3101细胞中。
[0025]将含有所述基因的农杆菌侵染拟南芥未授粉的花苞，再筛选出阳性植株，观察其表型变化是否发生补偿性改变。
[0026]实施例5转基因拟南芥的花色苷检测
将研磨的拟南芥幼苗溶于花色苷提取液中过夜放置，离心所得上清液用0.22 μ m过滤后，进行HPLC检测。
[0027]HPLC 检测:检测使用 C18 column (规格:250X4.6mm);检测条件:35°C, 520nm。
[0028]梯度洗脱条件:0min，86%A溶液 +14%B 溶液；1min, 82%A 溶液 +18%B 溶液；35min，63%A 溶液 +37%B 溶液；60min，54%A 溶液 +46%B 溶液；67min，86%A 溶液 +14%B 溶液；70min，86%A溶液+14%B溶液。(A溶液为5%甲酸，B溶液为甲醇)
检测结果如图三。检测结果表明:野生型拟南芥，有4个吸收峰；《5突变体，没有检测到明显的吸收峰；35S:..FhCHIUH..FhCHI2、H: FhCHIS^K ?狭变体中的转基因拟南芥，也有4个相应的吸收峰，只是峰面积小于野生型。进而证明35S:转基因的确弥补了突变体的查尔酮异构酶的功能，生成了相应的花色苷，因此证明我们得到的3个FhCHIs为香雪兰查尔酮异构酶。
[0029]
SEQUENCE LISTING<110>东北师范大学
东北师范大学，王丽 〈120〉三条与香雪兰花朵花色苷合成有关的查尔酮异构酶的cDNA 〈130〉- 〈140〉-
〈141〉 2015-04-10〈160〉 2<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 694
〈212〉 DNA
<213> Freesia alba
〈220〉
<221> misc_feature
〈223〉三条与香雪兰花朵花色苷合成有关的查尔酮异构酶的cDNA〈220〉
〈221〉 5，UTR〈222〉 (I)..(4)
〈220〉
〈221〉 CDS〈222〉 (5)..(691)
〈220〉
〈221〉 3，UTR〈222〉 (692)..(694)
〈400〉 I
tcta atg aca aca aca acg ctc cag cca tcg get ctg gtc ata acc aaa49
Met Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Ser Ala Leu Val lie Thr Lys151015
ctg gtg ate gcc ggc ttc ctc ttc cct ccg gcg ate aca ccg ccg ccc97
Leu Val lie Ala Gly Phe Leu Phe Pro Pro Ala lie Thr Pro Pro Pro202530
ggc gat cag ccc aca cta ttc ctc gcc ggc gca gga cag agg gga ttg145
Gly Asp Gln Pro Thr Leu Phe Leu Ala Gly Ala Gly Gln Arg Gly Leu354045
gat gtg ggg ggc aaa ctc gta att ttt acg gcc ate ggc gtg tac ctg193
Asp Val Gly Gly Lys Leu Val lie Phe Thr Ala lie Gly Val Tyr Leu 505560
gag gag tcg gcg gtc ccg tea ctc gcc ggt aaa tgg gag ggg aag gcg241
Glu Glu Ser Ala Val Pro Ser Leu Ala Gly Lys Trp Glu Gly Lys Ala657075
gcg gag gag ctc ctc gtg tcc gat cat ttc ttc egg gat ate tac acc289
Ala Glu Glu Leu Leu Val Ser Asp His Phe Phe Arg Asp lie Tyr Thr80859095
ggt cca ttt gag agg ctc aca aag gtg acc atg gtc ttg cca ctg acg337
Gly Pro Phe Glu Arg Leu Thr Lys Val Thr Met Val Leu Pro Leu Thr100105110ggc aaa gag tac tcg gat aag gtg tcc gag aac tgt gtg gcc tac tgg385
Gly Lys Glu Tyr Ser Asp Lys Val Ser Glu Asn Cys Val Ala Tyr Trp115120125
aag get gtc ggg acc tac gac aga get aaa cac gcg gcg ata gtg aag433
Lys Ala Val Gly Thr Tyr Asp Arg Ala Lys His Ala Ala lie Val Lys 130135140
cta aaa gag gtc ttt aag tcc aag acc ttt tct cat ggc gca tcg ate481
Leu Lys Glu Val Phe Lys Ser Lys Thr Phe Ser His Gly Ala Ser lie145150155
ctc ttc act cac gaa tct tct ggc tct ttg act att gga ttt ttg aag529
Leu Phe Thr His Glu Ser Ser Gly Ser Leu Thr lie Gly Phe Leu Lys160165170175
aac aac tcg atg ccc gat tct ggg ggc aca gtt ata agg agt aaa get577
Asn Asn Ser Met Pro Asp Ser Gly Gly Thr Val lie Arg Ser Lys Ala180185190
ctg tcg gag gcg ate ttg gag tct ate att ggc aag aat gga gtg tcg625
Leu Ser Glu Ala lie Leu Glu Ser lie lie Gly Lys Asn Gly Val Ser195200205
cct gca gcg aaa gaa agt ttg gcg aga cgc att tea gca cta atg aag673
Pro Ala Ala Lys Glu Ser Leu Ala Arg Arg lie Ser Ala Leu Met Lys 210215220
gaa agg ate acg tcg taa gaa694
Glu Arg lie Thr Ser225〈210〉 2〈211〉 228〈212〉 PRT<213> Freesia alba〈400〉 2
Met Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Ser Ala Leu Val lie Thr Lys Leu151015
Val lie Ala Gly Phe Leu Phe Pro Pro Ala lie Thr Pro Pro Pro Gly202530
Asp Gln Pro Thr Leu Phe Leu Ala Gly Ala Gly Gln Arg Gly Leu Asp 354045
Val Gly Gly Lys Leu Val lie Phe Thr Ala lie Gly Val Tyr Leu Glu505560
Glu Ser Ala Val Pro Ser Leu Ala Gly Lys Trp Glu Gly Lys Ala Ala65707580 Glu Glu Leu Leu Val Ser Asp His Phe Phe Arg Asp lie Tyr Thr Gly 859095
Pro Phe Glu Arg Leu Thr Lys Val Thr Met Val Leu Pro Leu Thr Gly100105110
Lys Glu Tyr Ser Asp Lys Val Ser Glu Asn Cys Val Ala Tyr Trp Lys 115120125
Ala Val Gly Thr Tyr Asp Arg Ala Lys His Ala Ala lie Val Lys Leu 130135140
Lys Glu Val Phe Lys Ser Lys Thr Phe Ser His Gly Ala Ser lie Leu 145150155160
Phe Thr His Glu Ser Ser Gly Ser Leu Thr lie Gly Phe Leu Lys Asn 165170175
Asn Ser Met Pro Asp Ser Gly Gly Thr Val lie Arg Ser Lys Ala Leu180185190
Ser Glu Ala lie Leu Glu Ser lie lie Gly Lys Asn Gly Val Ser Pro 195200205
Ala Ala Lys Glu Ser Leu Ala Arg Arg lie Ser Ala Leu Met Lys Glu 210215220
Arg lie Thr Ser 0
[0030]225
SEQUENCE LISTING
〈110〉东北师范大学
东北师范大学，王丽 〈120〉三条与香雪兰花朵花色苷合成有关的查尔酮异构酶的cDNA 〈130〉- 〈140〉 I
〈141〉 2015-04-10 〈160〉 2
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 1023
〈212〉 DNA
<213> Freesia alba
〈220〉
<221> misc_feature
〈223〉三条与香雪兰花朵花色苷合成有关的查尔酮异构酶的cDNA 〈220〉
〈221〉 5，UTR 〈222〉 (1)..(98)〈220〉
〈221〉