一种延迟植物开花时间基因LcFLC及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种延迟成花基因，具体涉及一种延迟植物成花时间基因LcFLC的克隆、载体构建及其应用，属于生物基因技术领域。
【背景技术】
[0002]MMXLitchi chinensis Sonn.)属无患子科蒸枝属常绿果树，是我国南方亚热带地区广泛栽培的特产果树，栽培历史悠久，种质资源丰富。荔枝栽培过程中出现的成花不稳定，是导致低产或不稳产的重要原因，因此，荔枝成花相关研究成为关注热点。
[0003]荔枝成花涉及复杂的环境因子和遗传因子。研究显示，温度是影响荔枝成花的最关键因子(Menzel et al., 1985 ；Menzel et al., 1986 ；Southwick et al., 1986)。Menzel的研究小组利用控温生长室，对荔枝成花所要求的低温强度、低温持续时间、昼夜温差等一些关注焦点问题进行过系列研究(Menzel et al., 1985 ;Menzel et al.,1986 ；Menzel et al.，1989)，结果显示低于20°C以下的温度是诱导荔枝成花的有效温度(Batten et al., 1995 ；0 Hare, 2002)。蒸枝是典型的低温诱导成花植物，如无冷凉环境，蒸枝将维持营养生长。
[0004]开花是植物从营养生长到生殖生长的重要转折，可通过多条途径调控得以实现。近年来，通过对拟南芥等模式植物如何响应环境条件以及内部成花的分子机理的研究，发现植物开花转变过程是由多因子、多途径共同控制下众多开花基因在时间和空间上顺序表达和相互作用的结果。这些途径既彼此独立，又相互关联，形成一个复杂的开花调控网络。目前，拟南芥开花受以下途径调控，包括光周期途径(Photoper1d pathway)、春化途径(Vernalizat1n pathway)、赤霉素途径(Gibberellin pathway)、自主途径(Autonomouspathway)、温敏途径(Thermosensory pathway)和年龄途径(Aging pathway) (Moon etal., 2005 ；Fornara et al., 2010 ；Srikanth et al., 2011)。其中春化途径为植物感知外部环境的低温信号诱导植物开花的现象，依赖春化途径的植株必须经过一定时期的低温才能从营养生长向生殖生长转变的。春化作用是一个受多基因协调共同作用的过程，它以改变FLOWERING LO⑶S C (FLC)染色质修饰的方式降低其水平表达，最后直接或间接调控其下游基因的表达，促进植物开花(Michaels et al., 1999 ；Sheldon et al., 2000 ；Gendall et al., 2001 ；Levy et al., 2002 ；Bastow et al., 2004 ；Sung et al., 2004)。FLC是春化途径的枢纽基因，它属于MADS-box基因家族，编码的蛋白是一个开花抑制因子(Bastow et al., 2004; Sheldon et al., 2000)。FLC表达量的降低与春化程度成正相关，与开花时间呈负相关，FLC高水平表达显著抑制植物成花，而f Ic突变体则表现为提早开花(Michaels et al., 1999 ；Sheldon et al., 2000)。总之，在拟南芥春化过程中大多数基因最终都作用于关键基因FLC，从而解除对下游FLOWERING LO⑶S T (FT)基因的抑制作用，促进开花。
[0005]目前已从多种作物中克隆得到FLC同源基因cDNA全长，如水稻的Hd3a，番茄的SFT，柑桔的CiFT等等。FLC及其同源基因在拟南芥等植物中表达可明显延迟其开花时间，但多年生植物蒸枝对于外界环境的响应不同于草本植物拟南芥，有关低温诱导蒸枝开花的调控机制和分子机理仍然不清楚。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC，并提供该基因的核苷酸序列、克隆方法、含有该基因的亚细胞定位、该基因在荔枝不同组织部位的时空表达特征，该基因具有延迟植物开花时间的功能。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述一种成花调节基因LcFLC的应用。
[0008]本发明的技术方案如下:一种从荔枝中分离得到的成花调节基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0009]所述LcFLC基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID N0.2所示，其含有MADS家族典型的结构域。
[0010]所述LcFLC基因编码氨基酸同源性与枳中PtFLC编码的氨基酸序列同源性最高，为 60.76%ο
[0011]LcFLC基因亚细胞定位特征如下:所述LcFLC基因定位在细胞核中。
[0012]LcFLC基因在荔枝不同组织部位的时空表达特征如下:所述LcFLC基因在荔枝成熟叶片、幼叶、叶芽、花穗和韧皮部中均有表达，其主要在荔枝叶片中表达，而在花穗和韧皮部中的表达量较少，表达量顺序依次为:10月份幼叶〉10月份成熟叶片〉2月份幼叶〉2月份成熟叶片〉叶芽〉花芽〉花穗〉韧皮部。
[0013]荔枝叶片中，所述LcFLC基因的表达量在低温诱导后开始迅速下降，8周时达到最低值，并一直维持在较低水平直至开花；在顶芽中，所述LcFLC基因的表达量一直维持在较低水平。
[0014]本发明所述一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC基因应用于延迟或抑制植物的开花时间。
[0015]所述的LcFLC基因在调节拟南芥开花中的应用，具体是将LcFLC基因与pBI121载体相连后得到重组质粒，通过冻融法转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，抑制拟南芥平均开花时间延迟10天。
[0016]本发明首次从分子生物学的角度来初步了解荔枝的成花诱导机理，为以后通过目的基因在荔枝中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础，本发明对于利用基因工程来选育荔枝新品种有着重要的意义。
【附图说明】
[0017]图1为LcFLC基因克隆过程电泳图。
[0018]图2为LcFLC的氨基酸序列与其他植物的LcFLC同源序列比对。
[0019]图3为LcFLC在‘妃子笑’荔枝不同时期组织或部位的表达。
[0020]图4为LcFLC在‘妃子笑’荔枝花芽发育阶段的表达分析。
[0021]图5为pBI121-GFP和pBI121植物表达载体的结构图，其中，A:改造后的PBI121-GFP 载体，B:pBI121 表达载体。
[0022]图6为LcFLC基因的亚细胞定位，其中，第一列为荧光图片，第二列为第一列相对应的明视野，第三列为第一列与第二列的merge。
[0023]图7为LcFLC基因在拟南芥中超表达后开花的表型。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此案例。
[0025]本发明所提供的Flowering Locus C同源基因，是从蒸枝(ZiicAi chinensisSonn.)中克隆，命名为LcFLC基因，其核酸序列如SEQ ID N0.1，氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
[0026]实施例1 LcFLC基因的克隆方法及序列分析上述LcFLC基因的克隆方法及序列分析，包括如下步骤。
[0027]1.荔枝RNA的提取及检测以‘妃子笑’荔枝品种的叶片为材料，RNA的提取采用北京华越洋生物有限公司的RNAOUT试剂盒(具体方法参照说明书)，然后用DNase I(TaKaRa)消化去除总RNA中的DNA (具体方法参照说明书)。
[0028]荔枝总RNA质量和完整性检测:取I μ L RNA溶液稀释至100 μ L，用紫外核酸蛋白检测仪测定260、280和320 nm的光吸收值并计算A26Qnni/A2SQnni比值；同时取2 μ L RNA样品用1.2%的琼脂糖胶电泳检测总RNA的完整性。当A2M/A2S。的比值介于1.8-2.0之间时，28S和18S rRNA条带清晰且亮度比值在1.5-2之间时，RNA样品合格后用于下一步实验。
[0029]2.cDNA第一链的合成取2 μ g提取好的总RNA样品用于合成第一链cDNA，反应体系 20 yL，引物米用 Oligo (dT) 15，具体操作参照 MLV-Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen公司)说明书进行。
[0030]3.引物设计根据荔枝叶片转录组测序得到的相关基因序列，根据NCBI(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上其他作物同源基因的序列比对，依据引物设计的基本原则，用Primer Premier 5.0软件设计包括起始密码子和终止密码子的特异引物用于扩增LcFLC基因全长序列，扩增所用引物为如下:
正向引物 LcFLC-F: 5 ’ -AGGCAGAGTCCTATTAGAG-3 ’，
反向引物 LcFLC-R:5’ - CACGTTTGGA GTACTACACTT-3’。
[0031]4.目的基因片段的扩增和回收以cDNA作为模板，采用PrimeScript? RT-PCRKit进行PCR扩增反应，反应体系50 μ L，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测大小是否正确。在确定PCR产物中含有所需大小的目的片段后，采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，方法参照试剂盒说明书。回收后，再取5 yL PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳检测回收效果O
[0032]5.载体连接、转化和阳性克隆鉴定将目的DNA片段与克隆载体pMD18-T按照3:1的摩尔比进行连接，在16°C条件下恒温孵育过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑用通用引物Μ13和特异引物同时进行PCR检测，挑取检测呈阳性的转化子送华大基因公司测序，测序结果证实得到的为LcFLC基因的全长。LcFLC基因的ORF框为573 bp，编码191个氨基酸组成的蛋白，蛋白质分子量为47.02KDa，等电点为4.96。LcFLC基因的具体克隆过程电泳图如图1，其ORF框的核苷酸序列和氨基酸序列见图2所示。
[0033]6.cDNA片段序列的比对分析在NCBI数据库中进行BLAST比对，检索目的基因与其它物种基因的同源性，然后用MEGA4.1、Clustal X、GENEDOC和B1XM2.6软件等进行相关生物信息学分析。结果显示LcFLC属于MADS家族，含有MADS家族典型的结构域(位置为1-61)，如图2方框所示。LcFLC与枳(Poncir