用于作物改良的成花诱导剂的分子工程的制作方法

专利名称：用于作物改良的成花诱导剂的分子工程的制作方法
技术领域：
本发明涉及开花时间，成花数量和/或种子产量改变了的植物，并提供生产这种植物的方法。
背景技术：
在光周期的开花植物中，开花时间是^-个重要的发育开关,它能被叶片感知的环境信号所影响。开花基因座T(flowering Locus T,FT)基因是调节开花信号途径的一个重要元件。当诱导植物开花时,产生韧皮部-移动信号称为“成花素”，成花素通过韧皮部运输流被运输至茎端分生组织(SAM)，在此成花素诱导花发育U。在拟南芥中，已经显示移动的成花素由开花基因座T(ET)基因所编码。FT特异性地在韧皮部细胞中而不在SAM3中转录成mRNA。然而，其蛋白质产物却在苗端发挥功能4_6。拟南芥FT是一个由175个氨基酸(aa)组成的23kd的球形小蛋白，与哺乳动物中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)或Raf激 酶抑制剂蛋白同源。FT属于一组六个紧密相关的蛋白，包括金鱼草(Antirrhinum)的TFLI 和 CENTRORADIALIS (CEN)。收集的证据表明拟南芥的FT蛋白7’8与它的番茄的SFT9,水稻的Hd3a10和葫芦的Cm-FTLl/211直向同源物作为非细胞自主开花信号的一个元件，这个信号通过韧皮部被运输至SAM,然而,FT mRNA在长距离成花素信号中的活动的作用仍然未知12。一旦FT存在于SAM中，它与由开花基因座D编码的bZIP转录因子、FD相互作用，以便激活成花识别基因例如 APETELA I 和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF COl。后者激活 LEAFY 并诱导开花4’6。在控制水稻FT直向同源物Hd3a的表达及IWa本身的基因中，自然遗传变异有助于耕种水稻中开花时间的多样性13。几种物种的转基因植物中FT的过表达与早花有关。US
6,225, 530描述了一种分离的多核酸编码FT多肽。Hanzawa等也描述了植物中修饰的FT和它们的表达序列14。开花时间和花(及种子)的质量是作物的产量和质量的重要方面，有必要在农业中创造新工具来控制多种植物的开花时间和数量及种子的产量。不但通过增加开花来提高植物产量,而且在某些特定植物中，期望通过延迟或完全阻止开花来提高植物产量。本发明旨在解决这些需求。FT的生物工程或通过TILLING、突变育种和FT的筛选创造新型的FT等位基因，能够为新作物If种提供有益等位基因以提1 广量，从而满足全球粮食、词料和能源的快速增加的需求。

发明内容
开花基因座T(ET)是成花信号途径的一个重要元件。已知FT与控制开花时间有关。令人惊讶地，发明人发现改变FT蛋白质的氨基酸序列也能增加花的数量和种子的产量。本发明公开FT的修饰导致单个氨基酸变化,提供了新的等位基因，该等位基因具有令人惊讶地提高作物产量的分子育种的潜能。用丙氨酸扫描方式和植物基于病毒的成花诱导系统，本发明描述了拟南芥FT蛋白的分子工程以产生修饰的FT,该FT具有改变的表型,例如增强引发开花的能力，导致更多的花及种子产量的增加。当修饰基因在植物中表达时,在FT序列中保守残基的修饰导致表型变化。因此，本发明涉及转基因植物,该转基因植物表达修饰的FT基因或多核苷酸，所述基因编码修饰的氨基酸序列，其特征在于,所述表达导致表型区别于野生型表型又区别于野生型过表达FT的植物。以在FT氨基酸序列中改变保守残基的方式修饰所述基因。本发明的另一方面涉及生产这种植物的方法。一方面，本发明涉及一种转基因植物,该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其 中，所述植物显示改变的开花分布型。具体地，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示以下表型之一a)提尚的开花能力；b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；c)不抽薹,不开花;d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下，正常抽薹及延迟开花,或者e)正常抽薹,不开花。一方面,本发明涉及一种转基因植物,该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量。另一方面,本发明涉及生产如上所限定的植物的方法,所述方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸,其中，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。进一方面，本发明涉及一种在植物中诱导提高开花及增加种子产量的方法，该方法包括在所述植物中引入且表达修饰的FT多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。进一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子或序列，所述核酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，当在植物中弓丨入所述核酸时,所述修饰导致植物改变的表型,其中，所述表型选自a)提高的开花能力；b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；c)不抽薹,不开花；d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下,正常抽薹及延迟开花,或者e)正常抽薹,不开花。另一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子或序列，所述核酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述修饰由一个或者多个以下残基的取代组成或者含有一个或者多个以下残基的取代V70、D73、R119、Rl73, D7UL67、S78 或者 Q1.40。另一方面,本发明涉及分离的核酸在植物中编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽以改变开花的数量和/或种子和/或果实的产量中的用途。本发明涉及一种修饰的植物,所述植物含有分离的核酸分子或序列，所述核酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽,其中，所述修饰由一个或者多个在表I中尤其在组II -V中被识别的残基的取代组成或者含有一个或者多个在表I中尤其在组II -V中被识别的残基的取代。


结合以下非限制性附图阐述本发明。图I拟南芥和其他种类植物的FT氨基酸序列的对比。表明了磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)域与假定的酰胺化作用位点。筛选用于修饰的各个氨基酸残基用粗体表示。表明了所有物种中保守氨基酸(注上星号的)。对于图I,编号基于拟南芥的序列的编号,在此参照拟南芥的直向同源物，当拟南芥序列比，例如水稻的直向同源物，少含有2个N端氨基酸时,必须从图I所不编号中减去两个氨基酸。图214个基于病毒的成花诱导载体的构建。(a)用于它们的构建的PVX载体和引 物序列。(b)使用引物对A和B,或C和D用于PVX/FT突变体的构建的产生两个重叠产物的重叠PCR。如前所述构建PVX/FT和PVX/mFT12。表明了基于PVX的载体的轮廓。图3FTV7M在成花诱导和种子生产中具有增强的生物活性。(a-e)观察短日照(SD)烟草(N. tabacum)马里兰州猛码(Maryland Mammoth) (MM)的不同开花表型在非诱导的长曰照(LD)下模拟接种的植物(a),或者接种PVX/mFT的植物(b)、接种PVX/F的植物(d)或接种PVX/FTV70A的植物(e)，以及在诱导SD条件下的MM植物(c)。(f, g)接种PVX/FT的SD烟草马里兰州猛犸植物上的种荚(f)或接种PVX/FTV7M的SD烟草马里兰州猛犸植物上的种荚(g)。(h)在三个单独实验中每个接种植物的种荚的平均数量的分析。表明了每个实验中使用的植物的数量(η)。当与PVX/FT对比时,所有样品的T检验(student t.-tests)显示了每个接种PVXZFTv7cia的植物的种荚的数量的显著性差异(P=O. 0002)。(i)种荚的大小。除了对照(c)的所有植物(a，b，d-g)在LD条件下生长。接种后7周(7-wpi)的照片(a-e), 12-wpi的照片(f, g)或者14-wpi的照片⑴。图4FTV7M增强成花诱导。尽管FT和FTv7m都有相似的引发植物抽薹的能力(b),但FTv7oa引起早花芽的形成并将产生更多的花(a)。6个SD烟草马里兰州猛犸植物接种PVX/mFT(mFT)、PVX/FT (FT)、PVX/FTV70A (FTv7oa)或 PVX/FTE173A (FTe173a)。在接种后 21，28 和 35 天通过茎高测定抽薹并统计花及花芽的数量。FTK173A、FT的功能缺失型突变体(表I)被用作附加对照。图5FTV7M表达的分子分析。(a-c)病毒瞬时FT RNA的检测。通过半定量RT-PCR在系统的幼叶中检测病毒瞬时FT RNA(a)和18S rRNA(b)。从模拟接种的或者接种基于PVX的基因表达载体5-wpi的植物收集的幼叶中提取总RNA样品，用无RNase活性的DNase(RNase-free DNase)预处理,并如前所述的用于RT-PCR检测12。测序RT-PCR产物以证实修饰的序列(C)。图中表明了 Ikb的DNA梯及RT-PCR产物的大小和位置。用于改变FT蛋白的氨基酸的核苷酸突变用下划线标出，(d-e) SD烟草马里兰州猛犸植物的FT蛋白的蛋白印迹分析(d)和PVX外壳蛋白的蛋白印迹分析(e)。(f)考马斯亮蓝染色的凝胶显示从模拟接种的植物或接种PVX/mFT、PVX/FT、PVX/FTvtoa或PVX/FTR173A5ipi的植物的幼叶中提取的等上样量的可溶性蛋白。表明了蛋白标记、FT和PVX CP的位置和大小。FTr173a,—种新发现的FT功能缺失型的突变体(表I)被用作附加对照。
图6用于大麦转化的FT过表达盒的构建。用于拟南芥FT的编码序列及它的新等位基因将通过使用高保真度Pfu聚合酶、特异性引物和cDNA克隆(图Ia)作为模板进行PCR扩增，经Xhol和Spel消化，克隆到双元载体pBract211的Xhol/Spel位点以产生pBract211/FT (对照)、pBract211/mFT (对照)和 pBract21 !/FTv7oao 这三个表达盒将用于大麦转化。图7在大麦中通过基于病毒的载体的GFP表达。修饰鸭茅轻花叶病毒(CMMV)17的传染性cDNA克隆以产生用于新的亚基因组(Sg)RNA的体外生产的载体。这种新的SgRNA编码目的基因的mRNA以取代病毒外壳蛋白基因并用作蛋白质翻译的mRNA。在新构建的CMMV载体中克隆GFP编码的序列。混接CMMV基因组RNA和新的SgRNA-GFP转录体的大麦叶片组织显示通过共焦显微镜检查显露出的GFP绿色荧光(a;左边GFP荧光，中间叶绿素自体荧光；右边合并图像)。然而，在模拟接种的大麦植物中没有观察到GFP特异荧光(b)。在感染植物中GFP mRNA的病毒表达能够很容易地被RT-PCR检测到(c). Bar=IOO μ m。
图8在大麦中通过FT的分蘖和带有谷粒的穗头的提高的产量。在新构建的CMMV载体中克隆野生型拟南芥FT编码的序列。幼嫩大麦植物混接CMMV基因组RNA和SgRNA-FT或者sgRNA-GFP转录体。后者用作阴性对照。与具有GFP表达的植物相比,接种后16天后，FT的病毒表达引起提早的植物发育并增加分蘖的数量(a，b)。接种后65天后,FT-表达的大麦植物(c)比GFP-表达的植物(d)形成更多的带有谷粒的穗头(箭头所示)。图9在SD下在烟草马里兰州猛犸(丽冲FTvtoa对于成花诱导和种子产量具有增强的生物活性。模拟接种(a, e, i)或用 PVX/mFT (b，f, j) ,PVX/FT (c, g, k)或 PVX/FTV7QA(d, h, I)处理MM植物，并在25。。下12小时SI)光周期下生长。接种后35-(a-d)，56-(e-h, k, I)和84-(i, j)天拍照。模拟接种的⑴或者PVX/mFT(j)处理的植物最终开花且产生种荚。图10在SD下在烟草马里兰州猛犸(丽冲FTv7oa的病毒瞬时表达促进二次出芽和开花。用PVX/FTV70A(a，b)或PVX/FT (c,d)处理MM植物,并在25 °C下12小时光周期下生长。在引发成花腋芽和花不断发育的侧枝的发育中，FTV70A(a, b)相比FT(c，d)具有增强的功能。在接种后70天收获从初次花产生的成熟的种荚。剩余的非成熟的主种荚依附于经PVX/FT处理的植物(c，d)。接种后70天拍照。植物轮廓部分被放大以便显示腋枝和新形成的成花芽(箭头)。图1.1在SI)下在烟草马里兰州猛犸CMM冲FTvtoa的病毒瞬时表达促进二次发芽和开花。用PVX/FT或PVXZFTv7cia处理MM植物，并在25°C下12小时光周期下生长。FTv7qa的表达诱导腋枝、二次成花芽、花和种荚的进一步发育(箭头，a-c)。在植物接种后70天收获从初次花产生的成熟的种荚。接种后84天(a)或98天(b，c)拍照，植物(i, ii)的箱形断面被放大以便显示腋枝和新形成的二次成花芽与花。图12在SD下在烟草马里兰州猛犸(丽冲FTv7m提高成花诱导和种子产量。当与模拟处理或PVX/mFT处理(a, b)相比时，FT或来自PVX/FT的FTV70A或PVX/FTV7M有效诱导早抽薹和早开花。然而,经PWFTv70a处理的丽植物相比经PVX/FT (h, c)处理的显著地产生更多的花和种荚。在接种后21、28和35天通过茎高测定抽薹并统计花和成花芽的数量。在接种后70天和105天统计总的初次和二次种荚。图13FT基因的病毒瞬时表达的检测。(a)模拟接种的或经PVX/mFT (mFT)、PVX/FT(FT)或PVX/FTV7QA(V70A)处理的MM植物中病毒瞬时FT基因的RT-PCR分析。(b-d)在试验过程中，病毒瞬时FT特异性RT-PCR产物的直接测序证实重组的病毒在mFT、野生型FT (起始密码子ATG用下划线标示)中保持无义(F划线)和缺失(Δ )双重突变或者在FTV70A中保持同义突变(下划线)。(f-g)拟南芥FT蛋白和PVX CP的蛋白印迹分析。在模拟接种的丽植物或用PVX/mFT处理的植物中检测非内源或病毒瞬时FT蛋白。然而,拟南芥FT蛋白的表达在经PVX/FT或PVX/FTV7M处理的丽植物中很容易检测到(f)。病毒CP在经PVX/mFT, PVX/FT或PVX/FTV70A处理的植物中检测到,但是在模拟接种的植物中检测不到。(g).考马斯亮蓝染色的凝胶显示总的可溶性蛋白样品的等负荷。(h).表明I. Okb的DNA和蛋白标记的位置和大小。图14在SD MM烟草植物中拟南芥FT的RT-PCR病毒传递和表达。用引物PP82和PP83通过RT-PCR在两个接种的(a，b)和系统的(c，d)幼叶中检测病毒瞬时FT RNA (a, c)和 18S rRNA(b, d)[Li C，Zhang K, Zeng X,Jackson S，Zhou Y and Hong Y (2009)A ciselement within Flowering Locus T mRNA determines its mobility and facilitatestrafficking of heterologous viral RNA. J Virol 83:3540-3548]。
图152M转基因大麦。大麦的转化。用pBract.214-FTV7a^f化春麦，黄金的承诺(Golden Promise),比用pBract214-FT或pBract214-mFT转化的大麦产生更多的穗头。转化后2个月拍照。图164M转基因大麦。FTV70A的转基因表达显著提高了大麦的产量。从用pBract211-mFT、pBract.211-wtFT或pBract.211_FTV70A转化的单个大麦植物的穗头中统计谷粒数。将表达的FTV70A与表达的mFT大麦转化株相比较,每株系/植物的总谷粒数增加了大约85. 7%。具有零复制的任意三个转基因构建的再生植物用作“零转化对照(Nulltransformation control)”。T检验显示谷粒产量上的显著性差异存在于FTV70A-转基因株系和mFT-转基因株系之间(p=0. 017)以及存在于FTV70A-转基因株系和wtFT-转基因株系之间(P=O. 003);然而，在mFT-转基因株系和wtFT-转基因株系之间不存在显著性差异(ρ=0· 178)。图17在SD下在MM植物中FTt27a比FT产生更多的花。
具体实施例方式现在将进一步描述本发明。在以下段落中，本发明的不同方面将更加详细地阐述。除与_明确地反向表明，如此阐述的每方面可与任何其他方面结合。尤其,表明作为优选的或有益的任何特征可与任何其它特征或表明作为优选的或有益的特征结合。除非另有说明，本发明的实例将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的传统技术,属于现有技术。文献中充分解释了这些技术。Wr-方面,本发明涉及一种转基因植物,该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示以下表型之a)提尚的开花能力；b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；c)不抽薹，不开花；d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下，正常抽薹及延迟开花或者
e)正常抽薹，不开花。拟南芥FT是一个由175个氨基酸组成的球型小蛋白，与哺乳动物中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)或Raf激酶抑制剂蛋白同源。开花基因座T (FT)基因在不同种植物中高度保守。FT氨基酸序列的比对示于图I。PEBP域和酰胺化作用位点是特别保守。通过比较拟南芥FT和其直向同源物与水稻和其他物种的氨基酸序列,我们识别了 43个氨基酸,包括9个处于保守的PEBP域的氨基酸、3个处于假定的酰胺化位点的氨基酸，在119位点(R119)的精氨酸残基，在140位点(Q140)的谷氨酰胺残基和许多N-端残基，作为用于分子修饰的靶。本文描述的实验中，每个氨基酸都用丙氨酸(Ala, A)取代以产生43个不同的单个氨基酸修饰的FT蛋白(表I)。这通过使用特异引物的PCR和基于重叠PCR的突变发生实现(表3,实施例8)。然后将序列克隆到基于马铃薯病毒X (PVX)的成花诱导系统12 (图2b)。分别使用野生型FT和无义突变体mFT作为阳性和阴性对照12，短日照(SD)烟草变种MM在非诱导的长日照条件下,我们发现,通过半定量(sq) RT-PCR和蛋白印迹证实,14种FT衍生物的病毒异位表达(表I)在非诱导的长日照(LD)条件下在短日照(SD)烟草马里兰州猛犸 (丽)植物中产生5种不同的表型(表I)。表I单个氨基酸突变对拟南芥FT蛋白的生物功能的效果
组别 FT突变体表型*
IFTv68A, FTp72A, FTp77A,正常抽薹及开花
FTgi 72A, FTri74a，FTs2A3
FTi5A, FTr6a, FTpgA, FTViia,
FTs12A5 Fl1RnA5 FTd2QA5
FTp2iA, FTn23A, FTr24A
FTs25A, FTi26A, FTi 28A, FTt3IA
IIFTl67A, FTs78A, FTqi4OA,正常抽薹但延迟开花 FToieAj FTli9a5 FTf22a,
FTk29A，FTv30A
IIIFTd71a, FTys5a3 FTba, FTn4a,正常抽 但不升花FTd7a, FTL3a, FTvi4a, FTv15a,
FTdi7A5 FTv18a
WFTd73A, FTr119A, FTr173a不抽 ，不开花
VFTv7OA, FTT2 a稍早开花但增加了每个处理的植物的成花数量及种子产量*表型是对比于经PVX处理的表达拟南芥WtFT蛋白的丽植物的表型这些数据表明本文识别的不同保守的氨基酸对FT生物活性有不同的影响且不遵循理论。它们很可能通过影响FT蛋白功能的不同方面来达到效果,例如非细胞自主成花素信号和/或细胞自主成花诱导。本文所描述的本发明的不同方面如表I详细描述的利用FT多肽中的特异氨基酸的变化。具体地，表达修饰的FT核苷酸的转基因植物在本发明的范围内，该修饰的FT核苷酸编码FT多肽，与野生型序列相比,该FT多肽如在上述限定的任意突变群I至V (或直向同源物的序列中的等效突变)中所描述的具有改变的序列。根据本发明的修饰的FT多核苷酸是一种修饰的核酸序列，即，修饰的FT基因，其序列不同于野生型多核苷酸、基因或核酸序列。
本文所述的野生型是指没有被修饰的植物且优选是相同物种。文中所述的增加可以是两倍或更多，或者描述至少10-50%的增加，例如至少10%,至少20%,至少30%，至少40%,至少50%或更多。通常，为了本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指关于,例如,核酸序列、表达盒、基因构建或载体，它们含有核酸序列或用核酸序列转化的有机体并表达根据本发明的核酸序列、表达盒或载体，所有这些构建由如F之一的重组方法所引起 (a)在本发明方法中有益的编码蛋白的核酸序列，或(B)与根据本发明的核酸序列可操作地连接的基因控制序列，例如，启动子，或(c) a)和 b) 这些构建并不位于自然遗传环境中或通过重组方法进行修饰,修饰可能采用不同的形式进行,例如，取代、添加、删除、倒置或插入一个或多个核苷酸残基。自然遗传环境被认为是在原始植物或者基因组文库中出现的自然基因组或染色体位点。至于基因组文库，优选至少部分保留核酸序列的自然遗传环境。环境至少在一边侧翼核酸序列并具有序列长度至少为50bp,优选为至少500bp,特别优选为至少IOOObp,最优选为至少5000bp。当表达盒被非自然的,合成的(“人工的”)方法例如诱变处理修饰时，自然发生的表达盒-例如，如本文限定，核酸序列的自然启动子与在本发明方法中有用的编码多肽的相应的核酸序列的自然发生的结合-成为转基因表达盒。例如在US 5，565，350或WO 00/15815中描述了合适的方法。如上所述，用于本发明的目的的转基因植物如此理解为用于本发明方法的核酸并不在上述植物的基因组中的自然位点上，可能用于核酸的同源或异源表达。然而，如前所述,转基因的也意味着，当根据本发明的不同实施方式的核酸在植物基因组的自然位点上时，相对于自然序列，序列已被修饰，和/或自然序列的调控序列已被修饰。具体地，转基因植物可能是指通过方法产生的植物，所述方法并不仅仅依赖于传统的育种。植物不能随身携带“转基因”，但可以通过诱变产生。转基因的优选地理解为在基因组中的非自然位点上的根据本发明的核酸的表达，即发生的核酸的同源的或,优选地,异源的表达。本文提到优选的转基因植物。修饰的FT多核苷酸编码修饰的多肽，该修饰的多肽的氨基酸序列不同于野生型多肽。修饰的多肽含有氨基酸修饰，例如删除、添加或取代。优选地,修饰是一个或多个氨基酸在序列上的氨基酸取代。在一种优选的实施方式中，修饰由单一的氨基酸取代组成。取代可能是保守的或非保守的。在一种实施方式中，取代是指非保守的取代，即氨基酸用另一种不具有相同化学性质的氨基酸代替。最优选的是用不引起蛋白结构改变的中性氨基酸取代，例如丙氨酸(Ala, A)或苯丙氨酸(Phe, F)。不引起蛋白质结构改变的取代是优选的。例如,对于A的突变使蛋白质折叠同时影响肽的生物功能。在此特定的氨基酸的化学性质的变化对野生型功能是至关重要的,所述氨基酸的改变使突变体植物产生不同的表型。然而，基于本文提供的信息，本领域技术人员将意识到除了本文公开的用A取代外的氨基酸取代以及用其他的氨基酸取代也在本发明范围内，特别是那些能使蛋白质折叠但与天然残基具有不同性质的取代被期望有相似的效应。因此这种取代在技术人员的技术范围内。技术人员将意识到实现所需的氨基酸取代，相应的密码子必须改变，而且由于DNA的简并密码子，目标密码子的不止一个改变可能在肽中产生所需的取代。
根据本发明的植物表现出不同于野生型表型的表型。特别是,植物表现出改变的的开花型。术语开花型可以指开花的增加和/或开花时间的改变。用于本文的增加的开花被理解为每株植物增加的花数目，从而导致种子产量的增加。开花时间可能提前或延迟。例如，比表达野生型FT的植物提前I周开花。植物表现延迟开花，比表达野生型FT的植物晚一周开花。然而，发明人惊奇地发现改变FT蛋白的氨基酸序列也能够增加花和种荚的数量。同时还观察到能增加种子的产量(表1，图3)。因此,在优选的实施方式中，本发明涉及一种转基因植物,该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸,所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现增加的开花和增加的产量,即，增加的果实和/或种子的产量。本公开提供了如此修饰的实例。例如，修饰为取代并且所述取代含有或由V70的或T27的或V70和T27两者的取代组成。取代也可能是用A取代。因此，在修饰的FT多核苷酸中，编码V70和/或T27的密码子可能转变为编码A (GOT, GCC, GCA, GCG)的密码子。植物进一步显示改变的开花时间。用于本公开的氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。如图I所示 的数量。因此，在拟南芥FT氨基酸序列中的V70是保守PEBP域(YTLVMVDH)VPSPSNPHLREYL)中的第二 V残基。由于在其他物种中FT氨基酸序列可能含有更少或更多的氨基酸(最典型的，I到2个附加或减少的氨基酸)，在氨基酸序列中第二个保守V残基的位置可能不是70,但是可能是69、71或72。在一些实施例的植物种类中根据本发明的目标残基的位置如图I所示。换句话说，根据本发明的这方面的一种实施方式，修饰是取代并且所述取代含有或由PEBP域中的第二保守V的取代组成,该PEBP域包括以下序列或者其至少90%同源的序列YTLVMVDPDVPSPSNPHLREYL。在另一实施方式中，在大约27位置上的N端残基被修饰。所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO. 44和45所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。在三个单独的实验中分析生物功能和FTv7cia蛋白工程的表达之间的联系。模拟接种的或用携带突变的非翻译的FTmRNA的PVX/mFT处理的SI)画烟草植物在长日照下保持生长(图3a，b),而阳性对照植物(图3c)和用能表达正常的FT蛋白的PVX/FT处理的丽植物都开花(图3d)。通过对比，尽管FT和FTv7oa都有诱导丽烟草抽薹的相似的能力(图4b) JSFTv7m的病毒瞬时表达引发了早成花芽的形成并开花(图4a)，并导致每个接种植物的花数量得明显增加(图3e)。不断发现表达FTv7m但并不表达FT的MM烟草植物具有显著提高的种荚数量(图3f-h)。种荚数量的增加并没有导致种荚大小变小(图3i)。因此，用PVX/FTvtoa#理的植物的种子产量的总千重比用PVX/FT处理的植物的种子产量的总千重高约30%。而且，发现从PVXZFT5a处理的植物收集来的种子与正常的MM烟草种子相比有相同的种子萌发活力。植物接种后21天也表现出早花，这比植入表达野生型FT的重组病毒的植物大约早I周(图4)。而且,与野生型FT表达的植物大约40朵花/每株相比,该植物还具有增加花数的特性，大约72朵花/每株(图4)。因此，根据本发明的优选方面之一，植物显示种子生产或种子产量的增加，其中，所述增加是大约10%到大约50%或更多，例如大约30%。开花的增加可能是10%到大约50%或更多。在另一种实施方式中，本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现不抽薹，也不开花。在一种实施方式中，取代包括或由在残基D73、R119或R173处的氨基酸的取代组成。取代可能是用A取代。如上所述，用于本公开的目标保守氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。在73位置的保守D是保守PEBP域中的第一个D。在173位置的保守R是酰胺化位点中的第一个R残基。也可能用到上述列出的突变的组合。所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO. 41和43所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。在另一种实施方式中,本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现由不包括Y85H的氨基酸修饰提供的正常抽薹和延迟开花。在一种实施方式中,取代包括或由在残基L67、S78、Q140、G16、L19、F22、K29或V30处的氨基酸取代组成。在优选实施方式中，取代包括或由在残基L67、S78或Q140处的氨基酸取代组成。取代可以是用A取代。如上所述,用于本公开的目标保守氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。例如,L67在PEBP域中指定第一个保守的L, S78在PEBP域中指定第二个保守的S并且Q140在配体结合位点 中与Y85位置相近的外环中指定保守的Q。也可能用到上述列出的突变的组合。所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO. 23和30所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。在另一种实施方式中，本发明涉及一种植物,该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现正常抽薹但不开花。在一种实施方式中，取代包括或由在残基D71、Y85、N13、N4、D7、L9、V14、V15、D17或V18处的氨基酸取代组成。在一种实施方式中，取代包括或由在残基D71或Y85处的氨基酸取代组成。取代可以是用A取代。D71在PEBP域中指定与V残基(用于拟南芥序列的V70)毗邻的第一个保守的D。如上所述，用于本公开的目标保守氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。例如,Y85对着PEBP域的N端指定第二个保守的Y。也能用到上述列出的突变的组合。所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO. 31和40所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。在另一方面,本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸,所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述修饰是取代,所述取代由列于表I的一个或多个下述残基处的取代组成或选自列于表I的^-个或多个下述残基处的取代，尤其是列于组II -V中的,最优选是在组V中的。在一种实施方式中，取代是用A取代。在一种实施方式中，修饰是取代，并且所述取代由在V70和/或T27处的取代组成或选自在V70和/或T27处的取代，例如V70A和/或T27A。在^-种实施方式中,植物也含有调控序列。该调控序列调控所述植物中多核苷酸的表达。该序列可能是启动子序列，例如内源启动子或驱动基因组成型过表达的启动子。根据本发明的过表达是指转基因在高于由内源启动子驱动的表达的水平表达。例如,可以使用强启动子如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)、水稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子或任何能增强表达的启动子进行过表达。也可以使用诱导型启动子,例如压力诱导型启动子,例如RubisCO小亚基启动子，或乙烯、丙烯、类固醇或乙醇反应启动子或热休克启动子。还设想是异位表达，即在组织中正常不表达的基因表达。或者,通过使用转录或翻译增强子或激活子可以实现增强的或增加的表达,并可以把增强子整合到基因中以进一步增强表达。当技术人员将能选择合适的能够驱动基因充分表达以导致产生修饰蛋白的启动子时，不考虑限制该列表。本发明也延及本文所描述的修饰植物的收获部分，例如,不限于种子、叶子、果实、花、茎、根、根茎、块茎和鳞茎,收获部分包括编码修饰的FT多肽的重组核酸。本发明进一步涉及来自植物的收获部分，例如千燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质，的衍生产物，优选直接衍生产物。在另一方面,本发明涉及一种生产本文所述的植物的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸,其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。在一种实施方式中，本发明也涉及生产能长出更多花和具有增加的果实或种子产量的植物的方法,该植物包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸,其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。更确切地说，修饰的FT多核苷酸编码修饰的多肽，其中，用其 它氨基酸取代V70或T27或它们两个。在另一方面,本发明涉及一种在植物中增加开花和种子产量的方法。该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。优选地，修饰的FT多核苷酸编码修饰的多肽,其中，用其它氨基酸取代V70和/或T27。含有本文所描述的修饰的FT多核苷酸序列的序列可进一步含有选择标记，该选择标记可能与异源核酸序列，即可操作地连接到启动子的结构基因，相关。本文所使用的术语“标记”是指编码特征或表型的基因,该特征或表型允许选择或筛选含有标记的植物或植物细胞。该标记基因可能是抗生素抗性基因，借以利用适当的抗生素从未转化的细胞中筛选转化的细胞。或者，标记基因可能是抗除草剂基因。本领域技术人员了解合适的标记。技术人员将意识到进行本发明的方法，用含有有利的序列的载体转化植物。本文已公开如此的载体。植物基因工程的本领域技术人员已知可以使用的载体的构建细节。在本发明中利用的异源核酸序列能够,例如，使用Ti质粒,根诱导(Ri)质粒或植物病毒载体例如PVX引入植物细胞中。根据本发明的植物的转化，即通过异源核酸序列的引入的宿主植物的基因型的改变,本质上可以以植物分子生物学的本领域技术人员已知的各种方式进行。转化的实例包括感染农杆菌，例如通过用转化的根癌农杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。在本领域技术人员已知的合适条件下,转化的植物细胞生长形成枝、根并进一步发育成植物。另外的例子是使用病毒载体的转染，例如本文所述的PVX载体系统，电穿孔或粒子轰击。本发明并不限于所列出的方法,技术人员可以使用适合的系统。已识别许多拟南芥的同源物和直向同源物,这些非限制的选择示于下表2。
权利要求
1.一种转基因植物,所述转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中,所述植物表现以下表型之-- a)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量； b)提1 的开花能力； c)不抽薹，不开花； d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下,正常抽薹及延迟开花,或者 e)正常抽薹，不开花。
2.根据权利要求I所述的植物，其中，所述植物表现提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量。
3.根据权利要求2所述的植物,其中，所述修饰包括在PEBP域中第二个保守V残基处的氨基酸取代，或由在PEBP域中第二个保守V残基处的氨基酸取代组成。
4.根据权利要求3所述的植物，其中,所述保守V残基是V70或同源位置上的V。
5.根据权利要求2所述的植物,其中，所述修饰包括在T27或者同源位置上的氨基酸取代或由在T27或者同源位置上的氨基酸取代组成。
6.根据权利要求I所述的植物，其中，所述植物表现不抽薹和不开花。
7.根据权利要求6所述的植物，其中，所述修饰包括选自在一个或多个以下残基D73、Rl 1.9或R173处的取代的氨基酸取代或由选自在一个或多个以下残基D73、R119或R173处的取代的氨基酸取代组成。
8.根据权利要求I所述的植物，其中，所述植物在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下表现正常抽薹及延迟开花。
9.根据权利要求8所述的植物，其中，所述修饰包括在一个或多个以下残基L67、S78、Q140、G16、L19、F22、K29或V30处的取代的氨基酸取代或由选自在^-个或多个以下残基L67、S78、Q140、G16、L19、F22、K29或V30处的取代的氨基酸取代组成。
10.根据权利要求I所述的植物，其中，所述植物表现正常抽薹,不开花。
11.根据权利要求K)所述的植物,其中，所述修饰包括在一个或多个以下残基D71、oY85、13、N4、D7、L9、V14、V15、D17或V18处的取代的氨基酸取代或由选自在一个或多个以下残基D71、oY85、13、N4、D7、L9、V14、V15、D17或V18处的取代的氨基酸取代组成。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的植物，其中,用中性氨基酸进行氨基酸取代。
13.根据权利要求12所述的植物，其中，用丙氨酸进行氨基酸取代。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的植物,其中，FT多核苷酸可操作地与调控序列连接。
15.根据权利要求14所述的植物，其中，所述调控序列是启动子。
16.根据权利要求1-15中任意一项所述的植物,其中，植物是单子叶或双子叶植物。
17.根据权利要求16所述的植物,其中,所述植物是农作物植物。
18.根据权利要求17所述的植物，其中，所述植物选自玉米，小麦，水稻，高粱，大豆，甘蔗，甜菜，牧草,草坪草，柳枝稷，芒,土豆，番爺,大麦，豌豆,豆，蚕豆，棉花，生菜，向日葵，芸苔属植物，例如油菜籽、芸苔或花椰菜，或紫花苜蓿,或杨树。
19.根据权利要求1-18中任意-一项所述的植物,其中，所述修饰的FT多核苷酸是修饰的内源多核苷酸。
20.根据权利要求1-18中任意-一项所述的植物,其中，所述修饰的FT多核苷酸是修饰的外源多核苷酸。
21.从权利要求1-20中任意一项所述的植物获得的植物组织或收获的材料。
22.—种生产权利要求1-20中任意一项所述的植物的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸,其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。
23.一种提高植物开花能力和种子和/或果实产量的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。
24.根据权利要求23所述的方法,其中，所述修饰包括在残基V70或T27或它们两者位置上的氨基酸取代或由在残基V70或T27或它们两者位置上的氨基酸取代组成。
25.—种分离的核酸，所述核酸编码修饰的多肽，该修饰的多肽含有氨基酸修饰，其中，当在植物中引入所述核酸时，所述修饰导致改变的表型,其中，所述表型选自 a)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量； b)提高的开花能力； c)不抽薹，不开花； d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下，正常抽薹及延迟开花,或者 e)正常抽薹,不开花.
26.一种分离的核酸,所述核酸编码修饰的多肽,该修饰的多肽含有氨基酸修饰,其中，所述修饰包括一个或多个以下残基T27、V70、D73、R119、R173、D71、L67、S78、Q140或G16、L19、F22、K29 或 FTV30 的取代或由一个或多个以下残基:T27、V70、D73、R119、R173、D71、L67、S78、Ql40 或 Gl6、LI9, F22、Κ29 或 FTV80 的取代组成。
27.根据权利要求25或26所述的分离的核酸,其中,所述修饰包括在残基V70或Τ27或它们两者位置—t的取代或由在残基V70或T27或它们两者位置上的取代组成。
28.根据权利要求26或27所述的分离的核酸，其中,用A取代氨基酸。
29.—种载体，该载体含有权利要求25-28中任意一项所述的核酸。
30.权利要求25-28中任意一项所述的核酸或权利要求29所述的载体在提高植物开花能力和/或种子和/或果实产量中的用途。
31.—种植物,该植物含有权利要求25-28中任意一项所述的核酸或权利要求29所述的载体。
32.一种生产表现改变的表型的植物的方法,改变的表型选自 a)提筒的升花能力； b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量； c)不抽薹，不开花； d)正常抽薹及延迟开花 e)正常抽薹，不开花 所述方法包括诱变植物种群并为了所述表型筛选来自所述种群的子代,鉴定表现所述表型的植物并筛选所述植物以得到在FT基因座上的一个或多个点突变。
全文摘要
一种植物，该植物含有修饰的FT多核苷酸，该FT多核苷酸表达修饰的多肽，该植物表现改变的开花时间、成花数量和/或增加的种子产量。公开了赋予不同表型的不同突变体序列。
文档编号C07K14/415GK102791729SQ201180012324
公开日2012年11月21日 申请日期2011年3月7日 优先权日2010年3月5日
发明者S·杰克逊, 李春阳, 洪益国 申请人:华威大学, 植物生物科学有限公司