专利名称：基于dr5的植物活体中生长素的原位实时测定方法
技术领域：
本发明属于植物激素检测领域，具体涉及一种基于生长素响应元件/ 饭的植物活体中生长素(吲哚乙酸)的原位实时测定方法。
背景技术：
植物激素作为微量信号分子，调节植物体几乎所有的生长发育过程。对植物激素作用机理的深入研究，不仅有利于深入揭示植物生长发育的机理等前沿科学问题，而且能够为作物遗传改良等应用领域提供强有力的理论支撑，在推动“绿色革命”、大幅度提高作物产量与品质和保证国家粮食安全方面发挥无可替代的重要作用。近年来，随着植物分子生物学和基因组学的发展，以拟南芥和水稻为代表的模式植物基因组研究不断取得突破， 使本身就处于科学前沿的植物激素研究进入了全新的快速发展阶段。与此同时，作为关键支撑技术的植物激素成分分析及检测方法已开始成为开展植物激素研究领域的限制因子之一。生长素(IAA)是最早发现的植物激素，在调节植物从胚胎发生到成熟的生长进程中起着决定性作用。由于生长素的作用具有明显的时空特异性，不同细胞间细微的生长素浓度梯度足以引起细胞发育方向的彻底改变，如决定干细胞的维持与分化或器官原基的是否发生。因此，准确掌握生长素在组织和细胞水平的原位实时分布，对于深入阐明生长素介导的生长发育过程的有关机制十分必要和迫切。1拟8年，Went通过著名的燕麦芽鞘弯曲实验而首次建立了检测植物生长素的生物测试法。除此之外，常用于测定IAA等植物激素的传统方法还有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用(GC/MS)或液-质(LC/ MS)联用、酶联免疫(ELISA)、放射免疫(RIA)等方法。这些方法各有优点，但都存在一定的局限性。其中，生物试法简单易行，能反映被测植物激素的生理活性，但不能排除植物激素类似物和拮抗物的影响，专一性和灵敏度均较低；色谱法灵敏度高、重现性好，但对待测样品需要量大、样品前处理复杂且需要昂贵的仪器设备和较高的使用维护费用；酶联免疫法和放射免疫法灵敏度较高，但抗体制备和纯化较为困难、测定周期长且很难排除植物激素前体物和结构类似物的影响。而且，酶联免疫法的重现性受环境条件影响较大，放射免疫法还存在放射性废物处理的问题。植物激素与生长发育湖南省重点实验室所研制的植物激素免疫传感测定方法是继生物试法、物理化学方法、酶联免疫与放射免疫等方法之后，在植物激素测定方法领域的重大创新与突破，如所研制的植物激素免疫传感器可以直接测定出提取液中不同植物激素含量，且结构简单、制造简便和操作方面。本发明力图建立一种IAA的植物活体内原位实时测定方法。
发明内容
本发明目的是提供一种能克服现有检测技术的不足(测定时间长、成本高、操作繁琐等)、对植物活体中生长素(吲哚乙酸)进行原位实时测定的新方法。为了解决所述技术问题，这种酶传感检测IAA的方法主要包括以下步骤来实现(1)分选GFP阴性细胞；(2)制备具有不同生长素浓度及其相应/ 饭/.·β〒诱导表达水平的细胞；(3)建立起GFP蛋白荧光强度和生长素浓度之间的数量关系；(4)基于/ 饭(生长素响应元件)和报告基因的生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时的测定。本发明方法步骤(1)中所述分选GFP阴性细胞采用以下步骤①拟南芥々Ι.·.·βν转基因植株的培养以培养的15-20天拟南芥/ 饭.^ffP转基因植株的根系为实验材料；②酶解对拟南芥/ 饭.^ffP转基因植株进行纤维素酶和果胶酶的酶解制备原生质体；③GFP阴性细胞的分选利用流式细胞仪将 GFP阳性细胞和GFP阴性细胞进行分析，收取GFP阴性细胞。本发明方法步骤(2)制备具有不同生长素浓度及其相应/ 饭.^ffP诱导表达水平的细胞(图1)。分别将GFP阴性细胞孵育在不同生长素浓度溶液中。待GFP的稳定表达后，分别取不同生长素浓度孵育过的IxlO4 个GFP阴性细胞，用液氮处理后，采用LC-MS/MS法测定细胞中生长素的实际浓度，制备得到具有不同生长素浓度的细胞。本发明方法步骤(3)建立起GFP蛋白荧光强度和生长素浓度之间的数量关系利用激光共聚焦扫描显微镜的对不同生长素浓度细胞分别进行GFP 荧光强度的测定，获得单个细胞的GFP蛋白的平均相对荧光强度。以建立起单个细胞中的生长素浓度和GFP荧光强度之间的梯度关系。本发明方法步骤(4)基于々K生长素响应元件)和报告基因的生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时的测定。对拟南芥/ 饭/.·β〒植株进行激光共聚焦扫描显微镜的扫描，并利用已经建立的生长素浓度与荧光强度之间的数量关系，进行生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时的测定。本发明的检测原理本发明检测方法是基于/ 饭是受生长素特异性诱导的启动子融合报告基因(6)中)，进一步建立起GFP荧光强度和生长素浓度之间的数量关系，结合对转基因植株的激光共聚焦显微镜观察得到的各细胞中的荧光强度图像，分析得出细胞中的IAA的浓度。本生长素测定方法的具有简便、快速、高灵敏，原位，无损伤的细胞级别活体检测的特点，有较大的创新性。本发明效果本方法拟筛选出有不同生长素浓度的 DR5: :GFP细胞；通过目前精确的LC-MS/MS方法测定生长素浓度，并进一步建立起生长素浓度与报告基因GFP的表达量之间的梯度对应关系。利用分子生物学、植物激素测定技术和高精密激光共聚焦扫描显微操作平台相结合，建立基于/ 饭(生长素响应元件)和报告基因的生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时的测定技术体系和标准化测定方法，为植物激素的测定开辟了新途径。
图1是本发明具有不同IAA浓度及其相应/ 饭.·.·秀导表达水平的细胞制备过程图。
权利要求
1.基于/ 饭的植物活体中生长素的原位实时测定方法，其特征在于包括以下步骤(1) 分选GFP阴性细胞以拟南芥々I.^ffP转基因植株根系为材料进行酶解制备原生质体，利用流式细胞仪将GFP阳性细胞和GFP阴性细胞进行分析，收取GFP阴性细胞；(2)制备具有不同生长素浓度及其相应/ 饭.^ffP诱导表达水平的细胞分别将GFP阴性细胞孵育在不同生长素浓度溶液，待GFP的稳定表达后，用液氮处理后，采用LC-MS/MS法测定细胞中生长素的实际浓度，制备得到具有不同生长素浓度的细胞；(3)建立起GFP蛋白荧光强度和生长素浓度之间的数量关系利用激光共聚焦扫描显微镜的对不同生长素浓度及其相应诱导表达水平细胞分别进行GFP荧光强度的测定，进而建立起单个细胞中的生长素浓度和GFP荧光强度之间的梯度关系；(4)基于々K生长素响应元件)和报告基因的生长素的无创伤原位、实时的测定对拟南芥/ 饭.^ffP植株进行激光共聚焦扫描显微镜的扫描，并利用已经建立的生长素浓度与荧光强度之间的标准曲线，进行生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时测定。
2.根据权利要求1所述的检测植物样品中IAA含量的方法，其特征包括(1)中所述实验材料为在MS固体培养基上培养7天后，转入MS液体培养基中培养8-15天拟南芥转基因植株的根系；(1)中所述制备拟南芥/ 饭//ffP原生质体取50株拟南芥的根一切成0.5 - Imm长的小段一浸没于3 mL酶溶液(1.5% Cellulase Onozuka RS, 1% cellulysin, 0. 1% pectolyase Y-23，10 mMKCl, 10 mMCaCl2,2mM MgCl2, 2mM MES, pH 5.6)中一60 rpmJ8° C振荡30-50 min - 200目细胞筛过滤一洗液清洗200 g离心 5min —洗液稀释沉淀一冰上静置保存；(1)中所述利用流式细胞仪(Beckman Coulter, EPICS ALTRA)将拟南芥/ 饭.·.·β〒转基因植株根尖原生质体依照GFP阳性和GFP阴性进行分选，选定IOOym喷嘴，488 nm蓝光激发，鞘液压力为20 psi，以野生型拟南芥根尖原生质体作为阳性对照同时基于完整的原生质体具有较高的前向角(forwardscatter，FSC) 和侧向角(side scatter, SSC)比值的原则建立分选门，分选得到大量GFP阴性细胞；(2) 中所述分别取出IxlO5个GFP阴性细胞，孵育在不同生长素浓度溶液中；生长素浓度拟定为 10_12 g. L—1，10_n g · L—1，10_1CI g · L—1，10_9 g · L—1，10_8 g · L—1，10_7 g · L—1，10_6 g · L—1，10_5 g -Γ1,10_4 g ·Ι^，通过激光共聚焦扫描显微镜，待GFP的稳定表达后，分别取不同生长素浓度孵育过的IxlO4个GFP阴性细胞，用液氮处理，采用LC-MS/MS法测定生长素的实际浓度， 制备得到具有不同生长素浓度及相应/ 饭/.·β〒诱导表达水平的细胞；(3)中所述用激光共聚焦扫描显微镜以488nm波长激发光进行扫描，择每个细胞为ROI (感兴趣区域)，然后利用激光共聚焦扫描显微镜配套软件FV10-ASW1. 1和Image-Pro Plus 6. 0，进行GFP荧光强度的测定，得到生长素浓度和GFP荧光强度之间的标准曲线；(3)中所述通过激光共聚焦扫描显微镜以488nm波长激发光对拟南芥/ 饭.^ffP植株根系进行扫描，获得各个部位细胞的相应GFP荧光强度，同时根据步骤(3)得到生长素浓度和GFP荧光强度之间的标准曲线，进行生长素的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时测定。
全文摘要
本发明具体涉及一种基于生长素响应元件DR5的植物活体中生长素(吲哚乙酸)的原位实时测定方法。(1)分选GFP阴性细胞；(2)制备具有不同生长素浓度及其相应DR5::GFP诱导表达水平的细胞；(3)建立起GFP蛋白荧光强度和生长素浓度之间的数量关系；(4)基于DR5(生长素响应元件)和报告基因的生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时的测定。本发明有益的效果是实现了游离态生长素的单细胞级别的高灵敏、超微量、无创伤原位、实时的测定。
文档编号C12Q1/02GK102268470SQ20111011105
公开日2011年12月7日 申请日期2011年4月30日 优先权日2011年4月30日
发明者李合松, 王若仲, 肖浪涛, 黄志刚 申请人:湖南农业大学