一种定量测定植物光合生长力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量测定植物光合生长力的方法。它包括以下步骤：选第二、第三和第四完全展开叶，无损测定各叶片光合作用日变化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均净光合速率APN；随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；分别测定提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力和葡萄糖?6?磷酸脱氢酶的酶活力，依据公式计算出糖代谢中的糖酵解途径所占的份额，然后再与植物日均净光合速率相乘，则可获得植物光合生长力。本发明能快速定量植物在不同环境下光合生长力，步骤少，计算简单，测定结果具有可比性以及可靠性。
【专利说明】
一种定量测定植物光合生长力的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种定量测定植物光合生长力的方法，属于植物生理生化领域。
【背景技术】
[0002] 光合作用(Photosynthesis)，即光能合成作用，是指含有叶绿体绿色植物、动物和 某些细菌，在可见光的照射下，经过光反应和碳反应（旧称暗反应），利用光合色素，将二氧 化碳(或硫化氢)和水转化为有机物，并释放出氧气(或氢气）的生化过程。同时也有将光能 转变为有机物中化学能的能量转化过程。光合作用是一系列复杂的代谢反应的总和，是生 物界赖以生存的基础，也是地球碳-氧平衡的重要媒介。光合作用可分为产氧光合作用 (oxygenic photosynthesis)和不产氧光合作用（anoxygenic photosynthesis) 〇是绿色植 物、和某些细菌利用叶绿素，在可见光的照射下，将二氧化碳和水转化为有机物(主要是淀 粉），并释放出氧气的生化过程。对于生物界的几乎所有生物来说，这个过程是他们赖以生 存的关键，而地球上的碳氧循环，光合作用是必不可少的。
[0003] 在研究植物光合作用时，光合速率是用于表示光合作用强弱的一种表示法，又称 "光合强度"。光合速率的大小可用单位时间、单位叶面积所吸收的二氧化碳或释放的氧气 表示，亦可用单位时间、单位叶面积所积累的干物质量表示。而净光合速率(Pn)是指光合作 用产生的糖类减去呼吸作用消耗的糖类(即净光合作用产生的糖类)的速率，总光合速率是 指光合作用产生糖类的速率，净光合作用=总光合作用-呼吸作用消耗，能够直接体现植物 的光合效果。
[0004] 糖是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，它为植物的生长发育提供碳骨架和 能量。展开叶通过光合作用所累积的糖类有两个途径:叶片中累积的糖类主要有两个去向， 一个去向是通过磷酸果糖激酶催化不可逆的进入糖酵解途径，另一个是通过葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶催化不可逆的进入磷酸戊糖途径。糖酵解途径(glycolytic pathway)又称EMP途 径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中 普遍存在的葡萄糖降解的途径。在需氧生物中，糖酵解途径是葡萄糖氧化成二氧化碳和水 的前奏。糖酵解生成的丙酮酸可进入线粒体，通过三羧酸循环及电子传递链彻底氧化成二 氧化碳和水，并生成ATP，引起植物的生长。另一个去向则为磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway);磷酸戊糖途径是葡萄糖氧化分解的一种方式。由于此途径是由6-磷 酸葡萄糖(G-6-P)开始，故亦称为己糖磷酸旁路。磷酸戊糖途径可分成氧化阶段和还原阶段 两个部分，氧化阶段产生的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型辅酶II(NADPH)和 还原阶段产生的核糖-5-磷酸在植物对抗胁迫环境时都具有极其重要的作用，核糖-5-磷酸 能通过进入卡尔文循化对RuBP形成补充从而使植物在胁迫条件下光合作用能够得以维持。 因此，植物光合累积的糖类通过糖酵解途径可致植物的生长。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种定量测定植物光合生长力的方法，以克服现 有技术难以定量反映光合产物对生长的支持能力的弱点。
[0006] 本发明采取以下技术方案：一种定量测定植物光合生长力的方法，它包括以下步 骤:第一，选第二、第三和第四完全展开叶，无损测定各叶片光合作用日变化，计算出各叶片 日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均净光合速率 APN;第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混合，进 行酶液的提取;第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷 酸果糖激酶活力EA pfk;第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表 示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh;第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为EAj： = EApfk+ EAg6pdh;第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算出糖代谢 中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为PeMP = EWEAj：;第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份 额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出植物光合生长力GC，计算公式为GC = Pemp X APN。
[0007] 在第一步骤中，叶片光合作用日变化的测定，是测定在净光合速率大于0时各个时 间段的净光合速率，根据净光合速率随光合时间的变化，利用积分法获得累积净光合速率， 依据累积净光合速率，计算出各叶片日均净光合速率；
[0008] 在第二步骤中，在测定植物日均净光合速率的第二天下午15:00-16:00，取叶片进 行酶液的提取;酶液的提取方法为：取叶片组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研 磨，待液氮挥发后，加入酶提取液;把研磨后的匀浆移入离心管中，离心，取上清液冷藏待 测;其中酶提取液为HEPES 1^8-!1(：1、1%(：1230了4、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟。
[0009] 在第三步骤中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk的测定方法为:磷酸果糖激酶 的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。
[0010] 在第四步骤中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh的测定方法为:葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力等于G6TOH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力。
[0011] 在第六步骤中，糖代谢中的糖酵解途径份额以百分比值来进行体现。
[0012] 在叶片日均净光合速率的计算中，累积净光合速率CPN是指在净光合速率大于0时 的整个时间段内净光合速率时数，为净光合速率对时间的积分，单位为μπιο? πΓ2^1!!，叶片 日均净光合速率LAPn则为平均每时净光合速率，计算公式为LAPn = CPn/24，第二、第三和第 四完全展开叶的叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均净光合速率APn。
[0013] 所述的HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，Tris-HCl为盐酸三羟甲基氨基甲烷，EDTA为 乙二胺四乙酸。
[0014] ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把酶提取液加入到ATP-PFK酶活分析液中，利用 紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D1;ATP-PFK酶活分析液 pH 7.8，包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、NADH、果糖-6-磷酸、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸 甘油脱氢酶和ATP; PPi-PFK酶活力的测定方法如下:把酶提取液加入到PPi-PFK酶活分析液 中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D2;PPi-PFK酶 活分析液pH7.8，包括HEPESTri S-HC、MgCl2、NADH、果糖-6-磷酸、醛缩酶、丙糖磷酸异构 酶、3-磷酸甘油脱氢酶和PPi;酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EA pfk可表示为D1+D2;所述的 PFK为磷酸果糖激酶，ATP为三磷酸腺苷，PPi为焦磷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸或还原型辅酶I。
[0015] 测定G6PDH和6PGDH的总活力的方法为:把酶提取液加入到G6PDH和6PGDH总酶活分 析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D T;G6PDH 和6P⑶Η总酶活分析液pH 7.8,包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、6-磷酸葡萄糖酸脂二钠盐、6-磷酸葡萄糖酸脂和NADPNa2;6PGDH的酶活力的测定方法 :把酶提取液加入到6PGDH酶活分析 液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D P;6PGDH酶 活分析液pH7.8，包括HEPESTris-HC、MgCl2、6-磷酸葡萄糖酸脂和NADPNa2;酶液中葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh可表不为Dt_Dp;所述的G6PDH为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6PGDH 为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，NADPNa2为氧化型型辅酶II二钠盐。
[0016] 本发明的优点如下：
[0017] 1)能快速定量不同环境下植物光合生长力，测定结果具有可比性。
[0018] 2)由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型辅酶II(NADPH)和还原型烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I (NADH)在340nm的毫摩尔消光系数均为6.22mM-Vm-1，测 出的磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力量纲相同，一个单位的葡萄 糖通过糖酵解途径消耗2个单位的NADH，而通过磷酸戊糖途径恰好生成2个单位的NADPH，因 此，用磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力代表两个途径无需归一化， 计算出的糖代谢中的糖酵解途径份额稳定可靠。
[0019] 3)本方法无需测定酶液中的蛋白质浓度，步骤少，计算简单。
[0020] 4)刚已完全展开的植物叶片，叶片中累积的糖类主要有两个去向，一个去向是通 过磷酸果糖激酶催化不可逆的进入糖酵解途径，另一个是通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化 不可逆的进入磷酸戊糖途径，其中的糖酵解途径绝大数会产生植物的生长效应，因此计算 出的植物光合生长力具有理论依据和可信性。
[0021] 5)本方法克服了现有技术难以定量反映胁迫条件下光合产物造成的生长效应的 弱点。
[0022]本发明的基本原理为：
[0023]光合速率是用于表不光合作用强弱的一种表不法，又称"光合强度"。光合速率的 大小可用单位时间、单位叶面积所吸收的二氧化碳或释放的氧气表示，亦可用单位时间、单 位叶面积所生成的糖类表示。总光合速率是指光合作用产生糖类的速率，而净光合速率 (P N)是指光合作用产生的糖类减去呼吸作用消耗的糖类（即植物累积的糖类)的速率，净光 合作用=总光合作用-呼吸作用消耗，能够直接体现植物的累积糖类效果。
[0024]糖是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，它为植物的生长发育提供碳骨架和 能量。展开叶通过光合作用所累积的糖类有两个途径:一个去向是通过磷酸果糖激酶催化 不可逆的进入糖酵解途径，另一个是通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化不可逆的进入磷酸戊 糖途径。糖酵解途径(glycolytic pathway)又称EMP途径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸 并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。在需 氧生物中，糖酵解途径是葡萄糖氧化成二氧化碳和水的前奏。糖酵解生成的丙酮酸可进入 线粒体，通过三羧酸循环及电子传递链彻底氧化成二氧化碳和水，并生成ATP，引起植物的 生长，也即是展开叶将光合作用所累积的糖类岐化到糖酵解途径可导致植物的生长。
[0025]对限速酶活力的研究是研究葡萄糖代谢途径的基本手段。限速酶的酶活力能够代 表该途径进行葡萄糖代谢的活跃程度。磷酸果糖激酶(PFK)是此糖酵解途径的限速酶，而葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径的限速酶，而磷酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)酶活力的比值可以代表葡萄糖代谢在糖酵解途径和磷酸戊糖途径之间 的分配情况。
[0026] 当生物体内的葡萄糖通过糖酵解途径进行代谢生成甘油时，会消耗生物体内的还 原性辅酶I(NADH)，而还原性辅酶I(NADH)的消耗能够通过吸光度的变化来进行测量，即可 以通过测定一定波长下吸光度的变化来测量糖酵解途径关键酶PFK的酶活力。而在生物体 内的葡萄糖通过磷酸戊糖途径进行代谢时，会在生物体内生成还原性辅酶II(NADPH)，同样 NADPH的增加也能够通过吸光度的变化来进行测量，即也可以通过测定一定波长下吸光度 的变化来测量磷酸戊糖途径关键酶G6TOH的酶活力。
[0027] 生物体酶液的提取。取0. lg的生物组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研 磨，待液氮挥发后，加入lmL酶提取液，其中含有50mM HETOS Tris-HCl(pH 7.8)，3mM MgCl2，lmM EDTA，lmM二硫苏糖醇和ImM苯甲基磺酰氟。把研磨后的匀浆移入离心管中，在4 。(:下，12000g离心20min，取上清液冷藏待测。
[0028] PFK的总活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。ATP-PFK酶活力的测定方法 如下，把200yL酶提取液加入到1.8mLATP-PFK酶活分析液中以测定ATP-PFK的酶活，ATP-PFK 酶活分析液包括50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，2.5mM MgCl2,0.1mM NADH，5mM果糖-6-磷 酸，2unit mL的醛缩酶，lunit mL丙糖磷酸异构酶，2unit mL 3-磷酸甘油脱氢酶和ImM ATP; PPi-PFK酶活力的测定方法如下，把200yL酶提取液加入到1.8mL PPi-PFK酶活分析液 中以测定PPi-PFK的酶活，PPi-PFK酶活分析液包括50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，2.5mM MgCl2,0.1mM NADH，5mM果糖-6-磷酸，2unit mL的酸缩酶，lunit mL丙糖磷酸异构酶，2unit mL 3-磷酸甘油脱氢酶和ImM PPi。利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液的光吸 收，以测量反应混合液中NADH氧化为NAD+的速率的变化情况。
[0029] G6PDH酶活的值等于G6PDH和6P⑶Η总酶活值减去6PGDH酶活值。首先测定G6PDH和 6Ρ⑶Η(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶）的总活力，把200yL酶提取液加入到1.8mL G6PDH和6Ρ⑶Η总 酶活分析液中以测定G6TOH和6PGDH的总酶活。G6PDH和6Ρ⑶Η总酶活分析液包括50mM HEPES Tris_HCl(pH 7.8)，3.3mM MgCl2,0.5mM 6-磷酸葡萄糖酸脂二钠盐，0.5mM 6-磷酸葡萄糖 酸脂和〇. 5mM NADPNa2。把200yL酶提取液加入到1.8mL 6PGDH酶活分析液中以测定6PGDH的 酶活。6PGDH酶活分析液中包括50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，3.3mM MgCl2,0.5mM 6-磷 酸葡萄糖酸脂和〇.5mM NADPNa2。利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液的光吸 收，以测量反应混合液中NADP+还原为NADPH的速率的变化情况。
[0030] 酶活力的计算公式见式（1)，其单位为nmol mirTVgdpr。
[0031](1)
[0032] ΔΑ73仕测疋的?日」Δ
tUin)円反奴糸轨仕测定波长的吸光值的变化；
[0033] VE为测定的酶液加入的体积(yL);
[0034] 为所用的底物的微摩尔消光系数，可由底物的标准曲线求出。
[0035] CPr为酶液的蛋白浓度(g Γ1或yg ml/1)。
[0036] NADPH和NADH在340nm的毫摩尔消光系数均为6.22mM-Vm-S其微摩尔消光系数即 0.00622μΜ-V-1，其意义即在lcm的光路中1. ΟμL?〇1 L-1浓度的NADPH或NADH其在340nm的吸光 值为0.00622。
[0037] 由以上的方法和式（1)，可以计算出PFK酶活力为EApfk，G6PDH酶活力为EAg6pdh，同时 假设生物体内参与葡萄糖代谢的代谢途径的关键酶的总活性为ΕΑ Σ，除糖酵解途径和磷酸 戊糖途径之外参加葡萄糖代谢的各途径的限速酶活力为EAd%，且各途径的限速酶的活力 代表了该途径进行葡萄糖代谢的活跃程度。则糖酵解途径在葡萄糖代谢中的占比Pemp可表 示为：
[0038] PEMP = EAPfk/(EAPfk+EAg6pdh+EAeise) X100% (2)
[0039] 在式(2)中，因为EAeise的占比很小，且我们只研究PFK和G6PDH的酶活力关系，在此 我们对其忽略。所以，糖酵解途径在葡萄糖代谢中的占比Pemp可表示为：
[0040] PEMP = EAPfk/(EApfk+EAg6pdh) X100% (3)
[0041 ]由于测定时间△ t、酶液加入的体积、所用的底物的微摩尔消光系数εμΜ以及酶液的 蛋白浓度相同，所以无论是磷酸果糖激酶的酶活力还是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力都 可以以单位体积单位时间吸光度变化值表示其活力，它们的比值更是如此。
[0042]由于第二、第三和第四完全展开叶中净光合速率(Ρν)所积累的糖类岐化到糖酵解 途径可导致植物的生长，因此可以通过计算糖类岐化到糖酵解途径的速率，获取植物光合 生长力。也就是依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率ΑΡν，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0043] 由于光合作用所累积的糖类是用于一天的生长，而累积净光合速率CPN是指在净 光合速率大于〇时的整个时间段内净光合速率时数，在一天的其他时期没有光合产物的积 累，因此，叶片日均净光合速率LAPn则为平均每时净光合速率，计算公式为LAP N = CPN/24。
【具体实施方式】
[0044] 本发明的实例:它包括以下步骤：
[0045] 第一，选取待测植株，选第二、第三和第四完全展开叶，无损测定各叶片光合作用 日变化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物 日均净光合速率APn;
[0046] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中〇. 1 g进行酶液的提取；
[0047]第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EAPfk;
[0048] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0049] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0050] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0051 ]第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0052] 实施例1
[0053] 第一，选取对照环境中的构树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；使用 进口 LI-6400XT便携式光合测量系统仏1-〇?，1^11(3〇111，呢，1^4)测定各叶片光合作用日变 化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均 净光合速率APn;
[0054] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中〇. 1 g进行酶液的提取；
[0055] 第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EAPfk;
[0056] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0057] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0058] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0059] 第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0060] 实施例2
[0061 ]第一，选取胁迫环境1中的构树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片;使用 进口 LI-6400XT便携式光合测量系统仏1-〇?，1^11(3〇111，呢，1^4)测定各叶片光合作用日变 化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均 净光合速率APn;
[0062] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中〇. 1 g进行酶液的提取；
[0063] 第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EApfk;
[0064] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0065] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0066] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0067] 第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0068] 实施例3
[0069]第一，选取胁迫环境2中的构树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片;使用 进口 LI-6400XT便携式光合测量系统仏1-〇?，1^11(3〇111，呢，1^4)测定各叶片光合作用日变 化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均 净光合速率APn;
[0070] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0071] 第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EApfk;
[0072] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0073] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0074] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0075] 第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0076] 实施例4
[0077]第一，选取对照环境中的桑树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片;使用 进口 LI-6400XT便携式光合测量系统仏1-〇?，1^11(3〇111，呢，1^4)测定各叶片光合作用日变 化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均 净光合速率APn;
[0078] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中〇. 1 g进行酶液的提取；
[0079] 第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EApfk;
[0080] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0081] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0082] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0083] 第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0084] 实施例5
[0085]第一，选取胁迫环境1中的桑树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片;使用 进口 LI-6400XT便携式光合测量系统仏1-〇?，1^11(3〇111，呢，1^4)测定各叶片光合作用日变 化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均 净光合速率APn;
[0086] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中〇. 1 g进行酶液的提取；
[0087] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EApfk;
[0088] 第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0089] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0090] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0091 ]第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0092] 实施例6
[0093]第一，选取胁迫环境2中的桑树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片;使用 进口 LI-6400XT便携式光合测量系统仏1-〇?，1^11(3〇111，呢，1^4)测定各叶片光合作用日变 化，计算出日均净光合速率，取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均 净光合速率APn;
[0094] 第二，随后，在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混 合，取其中〇. 1 g进行酶液的提取；
[0095] 第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖 激酶活力EApfk;
[0096] 第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6_磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh;
[0097] 第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算公式为ΕΑΣ = EApfk+EAg6pdh;
[0098] 第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;
[0099] 第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp乘以植物日均净光合速率APn，计算出 植物光合生长力GC，计算公式为GC = PempXPn〇
[0100] 本发明的实施效果如下：
[0101] 分别将构树和桑树分成三个处理组培养，三个处理组分别是对照组（l/2Hoagland 营养液）、胁迫组l(l/2Hoagland营养液+80g L-^EGeOOO)和胁迫组2(l/2Hoagland营养液+ 30mM NaHC03)。分别在培养1，3,5,7天后通过LI-6400XT便携式光合测量系统（LI-⑶R， Lincoln，NE，USA)测定植物日均净光合速率APn，分别在培养2、4、6、8下午15:00-16:00取叶 片测定植株叶片中磷酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的活性，然后计算 出植物光合生长力GC，其结果如下表所不(表1)。
[0102]从表1的数据可看出，虽然在对照环境下桑树的光合生长力与构树的差异不大，但 是，在两种胁迫环境下，构树的光合生长力都大于桑树的，表明构树适应于相关逆境，与其 在该逆境下光合生长力强有关;这是构树比桑树更适应喀斯特环境的事实是相吻合的；构 树高浓度的重碳酸盐对光合作用的影响显著小于对植物光合生产力的影响，这或许是解释 光合速率与生长不匹配的一个重要原因。另外，从表1的数据还可以看出，两种植物对高浓 度的碳酸氢钠的耐性都强于模拟干旱逆境(胁迫1)，也就是说，与岩溶干旱逆境相比，这两 种植物更适应高浓度的重碳酸盐。同时，也可以看出，利用本发明获取的植物光合生长力的 方法简单可靠，能够很好地说明在不同环境条件下植物光合能力的强弱。
[0103] 表1桑树和构树在不同处理条件下不同时间的植物光合生长力
[0104]
【主权项】
1. 一种定量测定植物光合生长力的方法，其特征在于:它包括以下步骤:第一，选第二、 第三和第四完全展开叶，无损测定各叶片光合作用日变化，计算出各叶片日均净光合速率， 取上述三个叶片日均净光合速率的平均值代表该株植物日均净光合速率APn;第二，随后， 在第二天取上述已测过日均净光合速率的叶片各一片，剪碎充分混合，进行酶液的提取;第 三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力 EApfk;第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh;第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的 酶活力EA g6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活性ΕΑΣ，计算公式为EAj： = EApfk+EAg6pdh;第六，依 据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算出糖代谢中的糖酵解途 径份额Pemp，计算公式为PEMP = EApfk/EAj：;第七，依据糖代谢中的糖酵解途径份额ΡΕΜΡ乘以植 物日均净光合速率ΑΡν，计算出植物光合生长力GC，计算公式为GC = Pemp X ΑΡν。2. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:在第一步骤中， 叶片光合作用日变化的测定，是测定在净光合速率大于〇时各个时间段的净光合速率，根据 净光合速率随光合时间的变化，利用积分法获得累积净光合速率，依据累积净光合速率，计 算出各叶片日均净光合速率。3. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:在第二步骤中， 在测定植物日均净光合速率的第二天下午15:00-16:00，取叶片进行酶液的提取;酶液的提 取方法为:取叶片组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研磨，待液氮挥发后，加入酶 提取液;把研磨后的匀浆移入离心管中，离心，取上清液冷藏待测；其中酶提取液为HEPES 1^8-!1(：1、1%(：1230了六、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟。4. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:在第三步骤中， 酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk的测定方法为:磷酸果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶 活力加上PPi-PFK酶活力。5. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:在第四步骤中， 酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh的测定方法为:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活 力等于G6TOH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力。6. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:在第六步骤中， 糖代谢中的糖酵解途径份额以百分比值来进行体现。7. 根据权利要求2所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:在叶片日均净光 合速率的计算中，累积净光合速率CPN是指在净光合速率大于0时的整个时间段内净光合速 率时数，为净光合速率对时间的积分，单位为μ molπΓ 2^1!!，叶片日均净光合速率LAPn则为平 均每时净光合速率，计算公式为LAPn = CPn/24，第二、第三和第四完全展开叶的叶片日均净 光合速率的平均值代表该株植物日均净光合速率APn。8. 根据权利要求3所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:所述的HEPES为 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，Tr i s-HCl为盐酸三羟甲基氨基甲烷，EDTA为乙二胺四乙酸。9. 根据权利要求4所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于:ATP-PFK酶活力 的测定方法如下，把酶提取液加入到ATP-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm 处测定反应混合液中5min的吸光度的变化Dl; ATP-PFK酶活分析液pH 7.8，包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、NADH、果糖-6-磷酸、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油脱氢酶和ATP; PPi-PFK酶活力的测定方法如下:把酶提取液加入到PPi-PFK酶活分析液中，利用紫外分光 光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D2;PPi-PFK酶活分析液pH 7.8， 包括HEPES 1^8-!1(：、1%(：12、嫩0!1、果糖-6-磷酸、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油脱氢 酶和PPi;酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EA pfk可表示为D1+D2;所述的PFK为磷酸果糖激酶， ATP为三磷酸腺苷，PPi为焦磷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I。10.根据权利要求5所述的一种定量测定植物光合生长力，其特征在于：测定G6PDH和 6PGDH的总活力的方法为:把酶提取液加入到G6TOH和6PGDH总酶活分析液中，利用紫外分光 光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D T;G6PDH和6P⑶Η总酶活分析液 pH 7.8,包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、6-磷酸葡萄糖酸脂二钠盐、6-磷酸葡萄糖酸脂和 NADPNa2; 6PGDH的酶活力的测定方法:把酶提取液加入到6PGDH酶活分析液中，利用紫外分 光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化Dp;6PGDH酶活分析液pH 7.8， 包括HEPES Tris-HC、MgCl2、6-磷酸葡萄糖酸脂和NADPNa2;酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的 酶活力EA g6pdh可表示为Dt-Dp;所述的G6PDH为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6PGDH为6-磷酸葡萄糖 酸脱氢酶，NADPNa 2为氧化型型辅酶II二钠盐。
【文档编号】G01N21/63GK105973851SQ201610404611
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】吴沿友, 姚凯, 饶森, 张开艳, 赵丽华, 王瑞, 陆叶, 杭红涛, 李海涛, 刘丛强
【申请人】中国科学院地球化学研究所