专利名称：从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法
技术领域：
本发明涉及一种从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方 法，获得的代谢物用于促进黄瓜幼苗的生长，提高黄瓜幼苗对白粉病
(5^力aerat力ecs /k/j>i/7ea)的系统抗性。
背景技术：
木霉菌作为世界目前应用最为广泛的生物防治菌，其防治病害机理除具有 对病原菌重寄生、抗生作用外，还具有明显诱导宿主植物潜在抗性相关基因表 达的功能。目前已证明木霉菌可诱导黄瓜、棉花、烟草、莴苣和辣椒等作物产 生对多禾中病害如灰霉病(^9^r"s ci"erea )、炭疽病(a^7etotric/ "历
c邵s"')、 早疫病(Jharau'a s。Ja/ i)、 细菌病害(尸5"e"Gb衡朋s 5y"'"卵e JacArjTH3/751, Ja/ z^。/z im351 c湖pesWs1 ,./ 力s5"ec)J力丄orj幼e) 和病毒病
(Cucumber Green-mottle)的抗性作用，但迄今为止尚没有报导利用分子改良 木霉菌的方法，进而从转化子中分离可诱导黄瓜抗白粉病的胞外代谢物。以往 很多研究尽管证明了木霉菌活体条件下可明显诱导宿主植物潜在抗性相关基因 表达，但在实际应用中遇到一些困难(1)以单一活体木霉菌为主的诱抗剂尽 管可不断在种围和根围繁殖，产生诱导抗性代谢物，但在实际应用中活体微生 物种群和活性很易受到土壤内各种环境因素的影响，导致诱导抗性效果不稳定。
(2)由于从野生木霉菌筛选优良菌株或从拮抗木霉菌分离新的拮抗类化学物质 的难度日益增加，很少有研究报导从木霉菌分离新的具有诱导抗性功能的化合 物。因此如何通过新的分子改良技术创造突变株，进而分离具有诱抗功能的化 合物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从分子改良木霉菌分离
可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法，分离筛选具有诱导黄瓜抗白粉病的木霉胞 外代谢物，用于促进黄瓜幼苗生长，提高黄瓜幼苗对白粉病的系统抗性，为筛 选新型生物化学农药先导化合物奠定基础。
为实现这样的目的，本发明采用拮抗木霉菌限制性内切酶介导的基因整合 技术，构建木霉菌转化子，然后从木霉菌转化子中筛选具有诱导抗性功能的转 化子，最后从优选的转化子分离可诱导黄瓜抗白粉病的木霉菌胞外代谢物，该 代谢物能克服活体木霉菌诱导抗性效果不稳定的缺点，不仅能诱导抗性，还能 促进黄瓜幼苗的生长。
本发明的方法具体包括以下步骤
1. 木霉菌原生质体的制备
配制浓度为13-13. 5毫克/毫升的细胞壁裂解酶溶液用于处理木霉菌菌丝， 菌丝在细胞壁裂解酶溶液中的比例为30—40%;在26-28。C条件下振荡培养3 一4小时，获得原生质体；然后过滤，用0. 7丽aCl溶液冲洗，4。C下离心，收集 原生质体；再用山梨糖醇缓冲液冲洗，4'C下离心，重悬原生质体于山梨糖醇缓 冲液中，调节原生质体浓度至l-1.5xl()7个/毫升。
2. 质粒提取
取培养至对数生长期的细菌培养液1.5-2毫升，置于离心管中离心沉淀，用 100微升含有50-55毫摩尔/升葡萄糖、10.0-11.0毫摩尔/升乙二胺四乙酸、 20-25毫摩尔/升Tris HC1的溶液悬浮，冰浴5-10分钟，再加入200微升含有 200-250毫摩尔/升NaOH和1%SDS的溶液，置冰浴5分钟后，再加入150微升 3-4摩尔/升醋酸钾，混匀，冰浴5-10分钟。向离心管中加入与管内液体等体积
的酚氯仿异戊醇的混合物，混合物中酚氯仿异戊醇的体积比为25: 24: 1;
离心取上清，加入2倍于上清体积的预冷无水乙醇，-2(TC放置30分钟，离心， 将沉淀溶于无菌去离子水或含10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲垸、0. 1毫摩尔/升 乙二胺四乙酸、pH8.0的TE溶液中，加入RNaseA，去除RNA，提取到质粒DNA。
3. 转化
取质粒DNA 38-42微克、10个单位/微升的限制性内切酶历'/wini0微升、 山梨醇缓冲液200微升，配制成酶一质粒混合液；将100微升原生质体悬浮液 与酶一质粒混合液混匀后，缓慢加入2毫升聚乙二醇，加入5毫升预冷的山梨 醇缓冲液，4'C下离心，弃上清，加入3毫升再生培养基，室温下放置5.5-6小 时；分别在含300微克/毫升和250微克/毫升潮霉素的培养基进行二次筛选， 并经PCR和转膜印迹检测，获得木霉菌转化子，在4。C冰箱中保存。
4、 木霉菌转化子胞外代谢物制备
将木霉菌转化子接种于PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基上，25°C下 培养6-8天，用无菌蒸馏水将孢子洗下，并配成浓度为3X107个孢子/毫升的孢 子悬浮液，在PDB (马铃薯-葡萄糖-酵母提取物)液体培养基内140—150转/分、 28°C的条件下发酵3-5天，获木霉菌转化子胞外代谢物发酵液。
5、 诱导抗性转化子胞外代谢物的筛选
取木霉菌转化子胞外代谢物发酵液对黄瓜幼苗进行浸种或灌根处理，处理 2-3天后将白粉病菌分生孢子均匀接种到黄瓜幼苗的第一片真叶上，发病后调査 病情指数，筛选出具有诱导抗性的木霉菌转化子胞外代谢物。
本发明利用限制性内切酶介导整合技术得到转化子，再进行液体发酵，并 从REMI构建的木霉菌变异株发酵液中筛选得到对黄瓜白粉病有明显诱导作用 的转化子，不仅对白粉病具有较明显的防治效果，而且防治效果比较稳定，还 能促进黄瓜幼苗的生长。
本发明为绿色分子农药创制提供了一种从木霉菌快速、高效筛选新型微生 物源农药先导化合物的有效方法。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不 构成对本发明的限定。 实施例1
1.木霉菌原生质体的制备
在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养木霉菌，用无菌水洗下孢子，然后加入 到马铃薯葡萄糖液中，在28'C和120转/分下培养18-20小时、过滤菌丝、0.7 摩尔NaCl冲洗菌丝。 配制浓度为13毫克/毫升的细胞壁裂解酶溶液用于处理木霉菌菌丝，菌丝 在细胞壁裂解酶溶液中的比例为30%;在130转/分和28'C条件下振荡培养3 小时，获得原生质体；然后过滤，用0. 7丽aCl溶液冲洗，4。C和4000转/分下 离心15分钟，收集原生质体，加入5毫升山梨糖醇缓冲液，4'C和4000转/分 下离心15分钟，重悬浮原生质体于山梨糖醇缓冲液中，调节原生质体浓度至107 个/毫升。
2. 质粒提取
取培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液于1.5毫升的离心管中，5000 转/分离心5分钟。弃上清，沉淀用100微升含有50毫摩尔/升葡萄糖、10毫 摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA)、 25毫摩尔/升TrisHCl的溶液悬浮，冰浴5_10 分钟，再加入200微升含有200m摩尔/升NaOH和1%SDS的溶液，置冰浴5分钟 后，再加入150微升3摩尔/升醋酸钾(pH4.8),混匀，冰浴5-10分钟。
向离心管中加入与管内液体等体积的酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)的混
合物，10000转/分离心10分钟。吸取上清，重复抽提2-3次。
吸取上清，加入2倍于上清体积的预冷无水乙醇，混匀，_20匸放置30分钟，
10000转/分离心10分钟，弃上清，将沉淀溶于适量的无菌去离子水或TE溶液 (10毫摩尔/升三(羟甲基)氨基甲垸pH8.0， 0. l毫摩尔/升乙二胺四乙酸)中，
此为含有少量RNA的DNA溶液。
向上述溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升左右，
37 。C温育30-60分钟，去除RNA。
采用紫外分光光度计测定法进行质粒定量。限制性内切酶历V7offl与37'C酶
切2小时，通过电泳确定质粒纯度和浓度。
3. 转化
质粒4o微克、限制性内切酶历'/7oiiiio微升ao个单位/微升)、山梨醇缓
冲液200微升，配制成酶一质粒混合液。IOO微升原生质体悬浮液与酶一质粒混 合液混匀后，缓慢加入2毫升聚乙二醇，加入5毫升预冷山梨醇缓冲液，4'C下 2000转化/分离心15分钟，弃上清，加入3毫升再生培养基，室温下放置6小 时。分别在含300微克/毫升和250微克/毫升潮霉素的培养基进行二次筛选，
转化子在4'C冰箱中保存。
根据抗潮霉素基因序列，设计引物进行PCR检测，以质粒为模板和潮霉素和 氨苄青霉素的基因序列为探针，转膜印迹检测转化子。经PCR和Southern blot 检测为突变株的转化子，再经7代以上培养表现稳定遗传的转化子制成硅胶粒保 存，用于诱导抗性转化子的筛选。
4、 木霉菌转化子胞外代谢物制备
将木霉菌转化子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养基组分为马铃
薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克、水1000毫升。25°C下培养6天，使 菌落表面产生大量分生孢子，用无菌蒸馏水将孢子洗下，并配成浓度为3X107 个孢子/毫升的孢子悬浮液，在马铃薯-葡萄糖-酵母提取物培养基内培养，培养 基组分为马铃薯200克、葡萄糖20克、酵母提取物15克。接菌量为每100 毫升培养基接种5毫升孢子悬浮液，在140转/分、28°C的条件下发酵3天，然 后过滤去除菌丝，得到木霉菌转化子胞外代谢物发酵液。
5、 诱导抗性转化子胞外代谢物的筛选
申绿64黄瓜种子在70%酒精中浸25-35秒，无菌水漂洗3遍，放入大培养 皿中并用滤纸保湿，28'C催芽22-26小时(露白)播种。土壤为温室育苗土，使 用前将育苗土置于165'C烘箱干热灭菌1小时。播种后，将黄瓜幼苗置于温室中 生长。待黄瓜生长至一叶一心期(约12天)，将木霉菌转化子胞外代谢物发酵 液稀释一倍，对黄瓜幼苗进行灌根处理，每株10-15毫升，处理2天后将白粉病 菌分生孢子均匀接种到黄瓜幼苗的第一片真叶上，5天后发病，调査病情指数， 筛选出具有诱导抗性的木霉菌转化子胞外代谢物。
结果表明，本发明的木霉菌转化子胞外代谢物能明显促进黄瓜幼苗生长、 提高黄瓜幼苗对白粉病的系统抗性，对白粉病相对防治效果在70%以上。
实施例2
l.木霉菌菌株原生质体的制备
在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养木霉菌，用无菌水洗下孢子，然后加入 到马铃薯葡萄糖液中，在28i:和120转/分下培养19-22小时、过滤菌丝、0.7
摩尔NaCl冲洗菌丝。
配制浓度为11毫克/毫升的细胞壁裂解酶溶液用于处理木霉菌菌丝，菌丝 在细胞壁裂解酶溶液中的比例为40%;在130转/分和26'C条件下振荡培养4 小时，获得原生质体；然后过滤，用0. 7丽aCl溶液冲洗，4'C和4000转/分下 离心15分钟，收集原生质体，加入5毫升山梨糖醇缓冲液，4'C和4000转/分 下离心15分钟，重悬浮原生质体于山梨糖醇缓冲液中，调节原生质体浓度至1. 5 Xl()7个/毫升。
2. 质粒提取
取培养至对数生长期的细菌培养液2毫升，置于离心管中，5000转/分离 心5分钟。弃上清，沉淀用含有55毫摩尔/升葡萄糖、11毫摩尔/升乙 二胺四乙酸(EDTA)、 20毫摩尔/升Tris HC1的溶液悬浮，冰浴5_10分钟，再 加入200微升含有250毫摩尔/升NaOH和1%SDS的溶液，置冰浴5分钟后，再 加入150微升4摩尔/升醋酸钾(pH4.8)，混匀，冰浴5-10分钟。
向离心管中加入与管内液体等体积的酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)的混
合物，10000转/分离心10分钟。吸取上清，重复抽提2-3次。
吸取上清，加入2倍于上清体积的预冷无水乙醇，混匀，_20°(^放置30分 钟，10000转/分离心10分钟，弃上清，将沉淀溶于适量的无菌去离子水或TE 溶液(10毫摩尔/升三(羟甲基)氨基甲垸pH8.0， 0. l毫摩尔/升乙二胺四乙酸) 中，此为含有少量脂A的DNA溶液。
向上述溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升左右， 37。C温育30-60分钟，去除RNA。
采用紫外分光光度计测定法进行质粒定量。限制性内切酶历Vwffl与37'C酶 切2小时，通过电泳确定质粒纯度和浓度。
3. 转化
质粒38微克、限制性内切酶历'/7dlI10微升(10个单位/微升)、山梨醇缓 冲液200微升，配制成酶一质粒混合液。IOO微升原生质体悬浮液与酶一质粒混 合液混匀后，缓慢加入2毫升聚乙二醇，加入5毫升预冷山梨醇缓冲液，4'C下 2000转化/分离心15分钟，弃上清，加入3毫升再生培养基，室温下放置5. 5
小时。分别在含300微克/毫升和250微克/毫升潮霉素的培养基进行二次筛选， 转化子在4'C冰箱中保存。
根据抗潮霉素基因序列，设计引物进行PCR检测，以质粒为模板和潮霉素 和氨苄青霉素的基因序列为探针，转膜印迹检测转化子。经PCR和Southern blot 检测为突变株的转化子，再经7代以上培养表现稳定遗传的转化子制成硅胶粒 保存，用于诱导抗性转化子的筛选。
4、 木霉菌转化子胞外代谢物制备
将木霉菌转化子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养基组分为马铃
薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克、水1000毫升。25°C下培养6天，使 菌落表面产生大量分生孢子，用无菌蒸馏水将孢子洗下，并配成浓度为3X107 个孢子/毫升的孢子悬浮液，在马铃薯-葡萄糖-酵母提取物培养基内培养，培养 基组分为马铃薯200克、葡萄糖20克、酵母提取物15克。接菌量为每100 毫升培养基接种5毫升孢子悬浮液，在150转/分、28°C的条件下发酵5天，然 后过滤去除菌丝，得到木霉菌转化子胞外代谢物发酵液。
5、 诱导抗性转化子胞外代谢物的筛选
山东密刺黄瓜种子在70%酒精中浸30-35秒，无菌水漂洗3遍，放入大培养 皿中并用滤纸保湿，28'C催芽24小时(露白)播种。土壤为温室育苗土，使用 前将育苗土置于165'C烘箱干热灭菌1小时。播种后，将黄瓜幼苗置于温室中生 长。待黄瓜生长至一叶一心期(约12天)，将转化子发酵液稀释一倍，对黄瓜 幼苗进行灌根处理，每株10毫升，处理3天后将白粉病菌分生孢子均匀接种到 黄瓜幼苗的第一片真叶上，5天后发病，调査病情指数，筛选出具有诱导抗性的 木霉菌转化子胞外代谢物。
结果表明，本发明的木霉菌转化子胞外代谢物能明显促进黄瓜幼苗生长、 提高黄瓜幼苗对白粉病的系统抗性，对白粉病相对防治效果在72%以上。
权利要求
1、一种从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法，其特征在于包括如下步骤1)配制浓度为13-13.5毫克/毫升的细胞壁裂解酶溶液用于处理木霉菌菌丝，菌丝在细胞壁裂解酶溶液中的比例为30-40％；在26-28℃条件下振荡培养3-4小时，获得原生质体；然后过滤，用0.7MNaCl溶液冲洗，4℃下离心，收集原生质体；再用山梨糖醇缓冲液冲洗，4℃下离心，重悬原生质体于山梨糖醇缓冲液中，调节原生质体浓度至1-1.5×107个/毫升；2)取培养至对数生长期的细菌培养液1.5-2毫升，置于离心管中离心沉淀，用100微升含有50-55毫摩尔/升葡萄糖、10.0-11.0毫摩尔/升乙二胺四乙酸、20-25毫摩尔/升Tris HCl的溶液悬浮，冰浴5-10分钟，再加入200微升含有200-250毫摩尔/升NaOH和1％SDS的溶液，置冰浴5分钟后，再加入150微升3-4摩尔/升醋酸钾，混匀，冰浴5-10分钟；向离心管中加入与管内液体等体积的酚氯仿异戊醇的混合物，混合物中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；离心取上清，加入2倍于上清体积的预冷无水乙醇，-20℃放置30分钟，离心，将沉淀溶于无菌去离子水或含10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、0.1毫摩尔/升乙二胺四乙酸、pH8.0的TF溶液中，加入RNase A，去除RNA，提取到质粒DNA；3)取质粒DNA 38-42微克、10个单位/微升的限制性内切酶HindIII10微升、山梨醇缓冲液200微升，配制成酶-质粒混合液；将100微升原生质体悬浮液与酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入2毫升聚乙二醇，加入5毫升预冷的山梨醇缓冲液，4℃下离心，弃上清，加入3毫升再生培养基，室温下放置5.5-6小时；分别在含300微克/毫升和250微克/毫升潮霉素的培养基进行二次筛选，并经PCR和转膜印迹检测，获得木霉菌转化子，在4℃冰箱中保存；4)将木霉菌转化子接种于PDA固体培养基上，25℃下培养6-8天，用无菌蒸馏水将孢子洗下，并配成浓度为3×107个孢子/毫升的孢子悬浮液，在PDB液体培养基内140-150转/分、28℃的条件下发酵3-5天，获木霉菌转化子胞外代谢物发酵液；5)取木霉菌转化子胞外代谢物发酵液对黄瓜幼苗进行浸种或灌根处理，处理2-3天后将白粉病菌分生孢子均匀接种到黄瓜幼苗的第一片真叶上，发病后调查病情指数，筛选出具有诱导抗性的木霉菌转化子胞外代谢物。
全文摘要
本发明涉及一种从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法，利用限制性内切酶介导的基因整合技术，通过制备木霉菌菌株原生质体及进行质粒提取，构建木霉菌转化子，继而将转化子培养、发酵，并从发酵液中筛选出具有系统诱导黄瓜抗白粉病的木霉转化子胞外代谢物。本发明的木霉菌转化子胞外代谢物能克服活体木霉菌诱导抗性效果不稳定的缺点，不仅对白粉病具有较明显的防治效果，还能促进黄瓜幼苗的生长，为绿色分子农药创制提供了一种从木霉菌快速、高效筛选新型微生物源农药先导化合物的有效方法。
文档编号C12N1/15GK101186882SQ20071017260
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月20日 优先权日2007年12月20日
发明者刘力行, 屈中华, 捷 陈 申请人:上海交通大学