专利名称：高纯度甘草查尔酮a的制备方法
技术领域：
本发明属于医用药物、化工领域，特别涉及一种从甘草(Glycyrrhiza) 中提取分离纯化获得高纯度(〉90%)甘草査尔酮A (Licochalcone A)的方法。
背景技术：
甘草査尔酮A (Licochalcone A)是甘草中的一种査尔酮，其结构为:近年来随着对甘草査尔酮A的不断深入研究，发现其除了具有抗氧 化、清除自由基的活性外，还具有抗利什曼原虫病(尤指黑热病)、抗炎、 抗HIV、抗肿瘤、抗菌、免疫促进等功能，在食品和医药工业中有广泛的 用途。文献Biochemical and Biophysical Research Communications 2004 322 263-270报道甘草査尔酮A能抑制激素非依赖性PC-3前列腺癌细胞的增 殖，提示甘草查尔酮A有望开发成为一种新的治疗前列腺癌药物。文献 Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1999 43 793-803报道甘草査尔酮A 对寄生性疾病疟疾和利什曼原虫病(尤指黑热病)有很好的疗效。文献 Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 2002 46 1226-1230报道甘草査尔 酮A对芽孢型食品感染菌如genera Bacillus and Clostridium有较好的抑制 效果，可以作为食品添加剂延长食品保藏时间。
随着对甘草査尔酮A药理作用的研究，它的应用受到了人们的广泛关 注。然而由于甘草査尔酮A在甘草中的含量较低，因此要取得高纯度的甘草査尔酮A工艺极为繁复，成本昂贵，目前市场上所使用的甘草査尔酮A 只是含量不一的甘草査尔酮A粗品。目前国内有关的文献报道制取甘草査 尔酮A纯品的方法成本都非常昂贵，《甘草查尔酮分离纯化工艺的研究》 (宁夏工程技术，4 (4)， 2005， 363-365) —文报道了提取分离甘草查尔 酮的操作，此法用乙醇浸泡，石灰水除杂，大孔树脂粗分离后，Na2C03 溶液和乙酸乙酯反复萃取，采用聚酰胺柱层析，不同体积分数乙醇洗脱， 此后再采用硅胶柱层析，使用甲苯-氯仿-丙酮作为洗脱剂，最后结晶得到 査尔酮，该操作工艺繁杂，硅胶的使用量较大，还消耗了大量不能回收 的混合溶剂。《高速逆流色谱法分离纯化甘草査尔酮甲和胀果香豆素甲》(现代中 药研究与实践，18， 2004， 53-56) —文报道了从甘草中精制高纯度甘 草查尔酮A的方法，此法用95%乙醇超声提取，2。/。NaOH除杂，2%盐酸 沉淀得甘草査尔酮A粗品，然后采用高速逆流色谱法分离纯化甘草查尔 酮A，该法分离效果较好，但对样品的处理量有限，且对设备和溶剂系 统要求较高，也消耗了大量不能回收的混合溶剂，不适合工业化生产。以上方法都消耗了大量的吸附剂及毒性极大的有机溶剂，操作也异 常繁复，成本的昂贵限制了它们进入商品市场。从发展趋势来看，必须 开发出能规模化生产高纯度、低成本甘草查尔酮A的制备工艺。发明内容本发明提供一种高纯度甘草查尔酮A的制备方法。目的是克服现有 方法操作繁复，成本昂贵的缺陷，以适合低成本的工业化生产。本发明的高纯度甘草查尔酮A的制备方法，顺序包括(6) 提取步骤，将甘草干燥粉碎，以冷渗法、温浸法或回流法
中的一种方法，将甘草粉以溶剂提取1 3次，合并提取液；所述的提取 溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占0 — 100wt。/。;B，乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占0 — 100wtQ/o; C.丙酮与水的混合物，混合物中丙酮的含量占0 — 100wt。/。；(7) 浓縮步骤，将提取液减压浓縮，回收提取液中的有机溶剂， 将提取液浓縮至20。C时的比重为1.05 1. 15，得提取物浓縮液；(8) 萃取步骤，以有机溶剂分批萃取或采用连续流萃取提取物 浓縮液，获得有机溶剂萃取相和萃余相；所述有机溶剂为正丁醇、乙酸 乙酯、正己烷、氯仿或异戊醇中的一种；(9) 分离步骤，将有机溶剂萃取相进行减压浓缩，回收其中的 有机溶剂，得到浓縮物，浓縮物采用柱层析分离，洗脱剂由乙醇水溶液 或甲醇水溶液或丙酮水溶液组成，其中水占的比例为100—0wt。/。，进行等 度或梯度洗脱，用薄层层析检测法或高效液相色谱法检査流出液，收集 含甘草査尔酮A的流出液，并减压浓縮此流出液，得甘草查尔酮A浓縮物；(10) 结晶步骤，将甘草査尔酮A浓縮物用有机溶剂结晶即得甘 草査尔酮A纯品，经检测其纯度不低于90%;所述的结晶有机溶剂是丙酮、 乙醇、甲醇、异丙醚、氯仿或它们的混合溶剂。所述的高纯度甘草査尔酮A的制备方法，其特征在于，所述提取步 骤中(1)所述的冷渗法为在室温下以5 20倍质量比的溶剂浸泡甘草 粉，然后以渗漉的方法进行提取；(2)所述的温浸法为在40 5(TC温度 下以5 20倍质量比的溶剂浸泡甘草粉、搅拌并保温3 6小时；(3)所 述的回流法是以5 20倍质量比的溶剂浸泡甘草粉，加热使溶剂回流并 保持回流状态1 5小时。
所述的高纯度甘草查尔酮A的制备方法，其特征在于，所述提取步 骤中，所述的提取溶剂为下述溶剂中的一种(1)甲醇与水的混合物， 混合物中甲醇的含量占40 —80wt%; (2)乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占40—80wt。/。； (3)丙酮与水的混合物，混合物中丙酮的含 量占40—80wt%。所述的高纯度甘草查尔酮A的制备方法，其特征在于(1)所述浓縮步骤为真空减压浓縮，真空度为0.01 0. 1Mpa，温度40 80。C，浓縮 液2(TC时比重为1.05 1.15; (2)所述萃取步骤，是指以1 3倍体积 比的有机溶剂萃取，萃取方式可以为搅拌萃取，室温或4 1(TC低温静置 分层，萃取次数1 3次；或采用有机溶剂连续流萃取分离机进行萃取， 萃取次数1 3次；(3)所述分离步骤中，将有机溶剂萃取液减压浓縮为 真空减压方式，真空度为0.01 0. 1Mpa，温度40 80。C;所使用的柱层 析填料为大孔径树脂、聚酰胺或葡聚糖凝胶。本发明采用优化的提取和纯化工艺，利用可重复使用的柱层析填料， 以水、醇、丙酮等无毒或低毒可回收溶剂，进行淋洗，再经一次简便无 需低温的常规结晶就能获得高纯度甘草查尔酮A;工艺简单，成本低廉、 适合工业化生产，为进一步研究甘草査尔酮A单体的药理作用提供了依 据，所得产品为橘黄色针状晶体，其中甘草査尔酮A纯度高于90X。
图1是本发明方法制备的甘草査尔酮A高效液相谱图。
具体实施方式
下面的实施案例是对本发明的进一步详细描述，但其不意味着对本
发明的任何限制。
实施例1
'称取干燥粉碎的甘草粉lKg，以20倍量的80%乙醇在室温下浸泡2h， 然后以冷渗法提取，渗漉速度为10mL/min，渗漉液减压浓縮，浓縮至比 重为1.08 (2CTC)时，用水饱和的正丁醇按l:l比例搅拌萃取3次，合 并萃取液并减压浓縮回收正丁醇，所得浓縮物以500g大孔D101树脂吸 附，乙醇水梯度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%，间隔20wt°/o， 梯度递减至Owt%，用薄层层析检测法检査流出液，收集含甘草查尔酮A的 流出液，减压浓縮得甘草査尔酮A浓縮物，再经异丙醚-丙酮结晶，得2. 82 克纯度92. 21 %的甘草查尔酮A纯品。
实施例2
称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以无水乙醇按质量比1:3和1:2回流提 取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓縮近干后加 水至比重l. 10 (2(TC)，用乙酸乙酯按l:l比例搅拌萃取3次，合并萃取 液，减压回收乙酸乙酯，所得浓縮物以500g聚酰胺吸附，乙醇水梯度洗 脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%，间隔15wt%，梯度递减至Owt%, 用薄层层析检测法检查流出液，收集含甘草查尔酮A的流出液，减压浓 縮得甘草查尔酮A浓縮物，再经乙醇-异丙醚结晶，得2.07克纯度91.82 X的甘草査尔酮A纯品。
实施例3
称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，分别用10倍、5倍、5倍量的80°/。丙酮 水回流提取3次，第一次提取3h，第二次提取lh，第三次提取lh过滤， 合并提取液，4(TC减压回收丙酮，浓縮至比重1.05 (2(TC)，用乙酸乙酯 按1:3比例连续流萃取，浓縮萃取液，所得浓縮物以500g大孔D101树 脂吸附，乙醇水梯度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%，间隔20wt%， 梯度递减至Owt%,用薄层层析检测法检查流出液，收集含甘草查尔酮A的
流出液，减压浓縮得甘草査尔酮A浓縮物，再经异丙醚-丙酮结晶，得2. 73克纯度91. 77%的甘草査尔酮A纯品。 实施例4称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以10倍量无水甲醇在室温下进行渗漉， 渗漉速度为5ml/min，渗漉液减压浓縮近干后加水至比重1. 10 (20°C)， 用正己烷按1:1比例采用连续流萃取分离机萃取2次，合并萃取液并减 压浓縮，所得浓縮物以500g大孔AB-8树脂吸附，丙酮水梯度洗脱，其 中水占丙酮水的比例由100wt%，间隔10机％，梯度递减至0被％，用薄层层 析检测法检查流出液，收集含甘草查尔酮A的流出液，减压浓縮得甘草 査尔酮A浓縮物，再经丙酮结晶，得1.80克纯度93.70%的甘草查尔酮 A纯品。实施例5称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，分别加入质量比1:4， 1:3和1:3的水 回流提取3次，第一次保持回流状态2小时，第二、第三次分别为1.5 小时，过滤，合并滤液，减压浓縮至比重l. 15 (2CTC)，用异戊醇按l:l 比例搅拌萃取3次，合并浓縮萃取液，所得浓縮物以500g大孔XAD-7树 脂吸附，乙醇水梯度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%，间隔20wt%， 梯度递减至Owt%，用薄层层析检测法检査流出液，收集含甘草査尔酮A的 流出液，减压浓縮得甘草查尔酮A浓縮物，再经甲醇结晶，得1.17克纯 度90. 13%的甘草査尔酮A纯品。实施例6称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以无水丙酮按质量比1:5， 1:4和1:4 回流，保持回流状态2小时，过滤，提取3次，合并滤液，减压回收丙 酮，浓縮近干后加水至比重1. 15 (20°C)，用异戊醇按1:1比例搅拌萃取 3次，合并浓縮萃取液，所得浓縮物以500g聚酰胺树脂吸附，乙醇水梯 度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%，间隔20wt%，梯度递减至Owt%，
用薄层层析检测法检查流出液，收集含甘草査尔酮A的流出液，减压浓縮得甘草查尔酮A浓縮物，再经异丙醚-丙酮结晶，得2.58克纯度91.52 ^的甘草査尔酮A纯品。 实施例7称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以20倍量50 X丙酮于50'C温浸提取 3小时，提取液60。C减压浓縮至比重1.08 (20°C)，用正丁醇按1:3比例 搅拌萃取2次，合并浓縮萃取液，所得浓縮物以500g大孔D101树脂吸 附，乙醇水梯度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%，间隔10wt%， 梯度递减至Owt%，用薄层层析检测法检査流出液，收集含甘草査尔酮A的 流出液，减压浓縮得甘草查尔酮A浓縮物，再经氯仿结晶，得2.96克纯 度90. 76%的甘草查尔酮A纯品。实施例8称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以50 %甲醇按质量比1:8， 1:6和1:6 回流提取3次，合并提取液，减压回收甲醇，浓縮至比重1.12 (20°C)， 用异戊醇按1:1比例搅拌萃取3次，合并浓縮萃取液，所得浓縮物以500g 大孔AB-8树脂吸附，乙醇水梯度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%， 间隔15wt呢，梯度递减至Owt。/Q，用薄层层析检测法检查流出液，收集含甘 草査尔酮A的流出液，减压浓縮得甘草查尔酮A浓縮物，再经异丙醚-丙 酮结晶，得2.64克纯度93. 10X的甘草查尔酮A纯品。实施例9称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以5倍量40%乙醇于5(TC温浸提取6小 时，过滤，滤液减压回收乙醇，浓縮至比重l. 10 (2CTC)，用乙酸乙酯按 1:1比例搅拌萃取3次，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，所得浓縮物以 500g聚酰胺吸附，乙醇水梯度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt%， 间隔10wty。，梯度递减至0wt9&，用薄层层析检测法检査流出液，收集含甘 草查尔酮A的流出液，减压浓縮得甘草査尔酮A浓縮物，再经氯仿结晶， 得2. 12克纯度90. 17%的甘草査尔酮A纯品。 实施例10称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以80%甲醇按质量比1:8， 1:6和1:4 回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压回收甲醇，浓縮至 比重L10(2(TC)，用正丁醇按l:l比例搅拌萃取3次，合并萃取液，减 压回收正丁醇，所得浓縮物以500g聚酰胺吸附，乙醇水梯度洗脱，其中 水占乙醇水的比例由100wt%，间隔20wt。/。，梯度递减至Owt96,用薄层层析 检测法检査流出液，收集含甘草查尔酮A的流出液，减压浓缩得甘草査 尔酮A浓縮物，再经乙醇-异丙醚结晶，得2.02克纯度92. 12%的甘草査 尔酮A纯品。实施例11称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以40%丙酮按质量比1:8， 1:6和1:6 回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压回收丙酮，浓縮至 比重I.IO (20°C)，用乙酸乙酯按l:l比例搅拌萃取3次，合并萃取液， 减压回收乙酸乙酯，所得浓縮物以500g大孔XAD-7树脂吸附，乙醇水梯 度洗脱，其中水占乙醇水的比例由100wt。/。，间隔15机％，梯度递减至(kt%， 用薄层层析检测法检查流出液，收集含甘草查尔酮A的流出液，减压浓 縮得甘草査尔酮A浓縮物，再经甲醇-氯仿结晶，得2.21克纯度90.84 X的甘草査尔酮A纯品。实施例12称取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以8倍量40 %甲醇在45"C下温浸3小 时，过滤，重复1次，合并滤液，滤液减压浓縮至比重1.08 (20°C)，用 氯仿按1:1比例搅拌萃取3次，浓縮萃取液，所得浓縮物以500g S印hadex LH-20分离，60%甲醇水溶液洗脱，用薄层层析检测法检查流出液，收集 含甘草査尔酮A的流出液，减压浓縮得甘草查尔酮A浓縮物，再经异丙 醚-丙酮精制，得2.52克纯度92.52X的甘草査尔酮A纯品。经高效液相
色谱(HPLC)测得谱图如图1所示。 HPLC条件固定相HypersilC-18柱流动相甲醇2%乙酸二6: 4检测波长282 nm 流速1.0 ml/min 进样量10 (ll tR= 14.022 min 含量=92.521870%。
权利要求
1.高纯度甘草查尔酮A的制备方法，顺序包括(1)提取步骤，将甘草干燥粉碎，以冷渗法、温浸法或回流法中的一种方法，将甘草粉以溶剂提取1～3次，合并提取液；所述的提取溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt％；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占0-100wt％；C.丙酮与水的混合物，混合物中丙酮的含量占0-100wt％；(2)浓缩步骤，将提取液减压浓缩，回收提取液中的有机溶剂，将提取液浓缩至20℃时的比重为1.05～1.15，得提取物浓缩液；(3)萃取步骤，以有机溶剂分批萃取或采用连续流萃取提取物浓缩液，获得有机溶剂萃取相和萃余相；所述有机溶剂为正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、氯仿或异戊醇中的一种；(4)分离步骤，将有机溶剂萃取相进行减压浓缩，回收其中的有机溶剂，得到浓缩物，浓缩物采用柱层析分离，洗脱剂由乙醇水溶液或甲醇水溶液或丙酮水溶液组成，其中水占的比例为100-0wt％，进行等度或梯度洗脱，用薄层层析检测法或高效液相色谱法检查流出液，收集含甘草查尔酮A的流出液，并减压浓缩此流出液，得甘草查尔酮A浓缩物；(5)结晶步骤，将甘草查尔酮A浓缩物用有机溶剂结晶即得甘草查尔酮A纯品，经检测其纯度不低于90％；所述的结晶有机溶剂是丙酮、乙醇、甲醇、异丙醚、氯仿或它们的混合溶剂。
2. 如权利要求1所述的高纯度甘草查尔酮A的制备方法，其特征在 于，所述提取步骤中(1)所述的冷渗法为在室温下以5 20倍质量比 的溶剂浸泡甘草粉，然后以渗漉的方法进行提取；(2)所述的温浸法为 在40 5(TC温度下以5 20倍质量比的溶剂浸泡甘草粉、搅拌并保温3 6小时；(3)所述的回流法是以5 20倍质量比的溶剂浸泡甘草粉，加热 使溶剂回流并保持回流状态1 5小时。
3. 如权利要求1或2所述的高纯度甘草査尔酮A的制备方法，其特征在于，所述提取步骤中，所述的提取溶剂为下述溶剂中的一种(1)甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占40_80wt%; (2)乙醇与水的 混合物，混合物中乙醇的含量占40 — 80wt。/。； (3)丙酮与水的混合物， 混合物中丙酮的含量占40—80wt%。
4. 如权利要求1或2所述的高纯度甘草查尔酮A的制备方法，其特 征在于(1)所述浓縮步骤为真空减压浓縮，真空度为0.01 0. 1Mpa， 温度40 80。C，浓縮液2(TC时比重为1.05 1. 15; (2)所述萃取步骤， 是指以1 3倍体积比的有机溶剂萃取，萃取方式可以为搅拌萃取，室温 或4 10。C低温静置分层，萃取次数1 3次；或采用有机溶剂连续流萃 取分离机进行萃取，萃取次数1 3次；(3)所述分离步骤中，将有机溶 剂萃取液减压浓縮为真空减压方式，真空度为0. 01 0. lMpa，温度40 8CTC;所使用的柱层析填料为大孔径树脂、聚酰胺或葡聚糖凝胶。
5. 如权利要求3所述的高纯度甘草査尔酮A的制备方法，其特征在 于(1)所述浓縮步骤为真空减压浓縮，真空度为0.01 0. 1Mpa，温度 40 80°C，浓縮液2CTC时比重为1.05 1. 15; (2)所述萃取步骤，是指 以1 3倍体积比的有机溶剂萃取，萃取方式可以为搅拌萃取，室温或4 l(TC低温静置分层，萃取次数1 3次；或采用有机溶剂连续流萃取分离 机进行萃取，萃取次数1 3次；(3)所述分离步骤中，将有机溶剂萃取 液减压浓縮为真空减压方式，真空度为0.01 0. 1Mpa，温度40 8(TC; 所使用的柱层析填料为大孔径树脂、聚酰胺或葡聚糖凝胶。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度甘草查尔酮A的制备方法，其工艺步骤为首先，将甘草粉碎，以冷渗、温浸或回流提取法，将甘草粉以溶剂提取1～3次；合并提取液，减压浓缩；然后用有机溶剂萃取，减压浓缩萃取液并回收有机溶剂，所得浓缩物采用柱层析分离，用水、乙醇、甲醇、丙酮或它们的混合溶液洗脱，收集含甘草查尔酮A的流出液，此流出液经浓缩及有机溶剂结晶即可获得高纯度甘草查尔酮A。本发明工艺路线简单，步骤少，所使用的溶剂、柱填料和洗脱液都能循环使用，是一种低成本、高纯度、易于放大、循环型的制备工艺，所得产品甘草查尔酮A为桔黄色针状晶体，其纯度不低于90％。
文档编号C07C45/00GK101117311SQ20071005252
公开日2008年2月6日 申请日期2007年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者余龙江, 叶玉平, 崔永明, 敖明章, 梁晓荣 申请人:华中科技大学;新疆昆仑神农有限公司