6-氨基嘌呤的偶联物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嘌呤类物质6-氨基嘌呤(Adenine，腺嘌呤）偶联物的制备方法与 应用。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及的名称适用于整个说明书和权利要求书： KLH=钥孔血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin)，Sigma公司产品PBS=磷酸缓冲液（PhosphateBufferedSaline) (0.01M，pH=7. 40) Glutar=戊二酸（Glutaraldehyde)，sigma公司产品 超滤管：天津鼎国生物技术有限责任公司产品 维生素B4,即6-氨基嘌呤(腺嘌呤）的磷酸盐，是核酸的组成部分，在体内参与DNA和RNA的合成，临床上用于放射治疗、苯中毒和抗肿瘤等原因引起的白细胞减少症、急性粒细 胞减少症。因此，定量检测维生素M在生命科学中具有重要意义。现行标准《卫生部药品 标准》化学药品及制剂第一册采用《中国药典》2010年版二部附录WD氮测定法第一法测 定维生素B4的含量，操作繁琐、专属性差，而且未对含量均匀度进行控制。文献报道有关维 生素M的检测方法有毛细管电泳法、电化学法、高效液相色谱法等，这些方法存在仪器昂 贵或者灵敏度低、操作繁琐的缺点，并且需要专门技术人员，难以实现现场工作。因此，开发 一种便捷、快速且灵敏度高的方法检测维生素B4十分重要。酶联免疫检测法（ELISA)提供 了一种非常便捷的扫描方法，该法具有快速、简便、准确、不需要专门人员操作等优点，这使 得ELISA成为一种理想的可用于常规扫描的检测方法。酶联免疫检测法的核心是高质量 的抗体，大多数嘌呤类物质包括6-氨基嘌呤都为小分子有机化合物，只具有抗原性二不具 有免疫原性，称之为半抗原。所以，要实施酶联免疫检测法（ELISA)达到快速、准确、简易的 检测目的，必须要把这些化合物转化为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(为完全抗 原)。维生素M为6-氨基嘌呤的磷酸盐，其具有抗原性的主体结构是6-氨基嘌呤。本发 明涉及的6-氨基嘌呤的偶联物就是用来引发动物免疫系统产生对6-氨基嘌呤特异性的抗 体的免疫原。经检索发现，至今尚未报道有关6-氨基嘌呤免疫原合成的文献专利。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系 统产生针对6-氨基嘌呤有特异反应的抗体的免疫原，即6-氨基嘌呤的偶联物以及制备这 种免疫原的方法。
[0004] 本发明的一种6-氨基嘌呤的偶联物，由6-氨基嘌呤半抗原与产生免疫原性的载 体物质偶联构成，所述载体为优选蛋白质，蛋白质片段，合成多肽或半合成多肽。
[0005] 上述的6-氨基嘌呤的偶联物，其中所述的蛋白质为钥孔血蓝蛋白（KLH)。
[0006] 本发明所述的6-氨基嘌呤的偶联物，其结构通式（B为：
do 其中m为与一个血蓝蛋白结合的6-氨基嘌呤的个数，所述n为整数1-20KLH为血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin)，分子量范围为 45KDa_130KDa。
[0007] 上述偶联物显示出如下物化特征： (1) 外观：白色粉末固体 (2) 紫外吸收光谱：26Inm 上述的6-氨基嘌呤偶联物，其中优选n为整数1-20,KLH分子量范围为45KDa-130KDa。
[0008] 上述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法是：将6-氨基嘌呤与产生免疫原性的载体 物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物 活性不变。
[0009] 上述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法具体步骤如下： (1)溶液A的制备：将6-氨基嘌呤溶于二甲基甲酰胺（DMF)溶液中制成溶液A;溶液B的制备：将KLH溶于蒸馏水中制成溶液B，其中6-氨基嘌呤与KLH的摩尔比为200:1~400:1。
[0010] (2)溶液A在搅拌条件下加入到B溶液中，得到混合液C。
[0011] (3)取41. 9微升的戊二醛加入C溶液中，在搅拌条件下室温反应4小时，得到反应 液D0
[0012] (4 )将溶液D用30KDa的超滤管超滤，超滤条件为3300转，40分钟，浓缩至1毫升 左右，再加入2毫升磷酸缓冲溶液，继续超滤80分钟，得到最终浓缩液F。
[0013] (5)将F溶液冻干，得到6-氨基嘌呤偶联物。
[0014] 在上述制备方法中，其中所述的6-氨基嘌呤与KLH的摩尔比为200:1~400:1 在上述制备方法中，其中所述的磷酸缓冲液pH为7. 40,浓度为0. 01M。
[0015] 在上述制备方法中，其中所述的戊二醛的浓度为体积百分比为25%的水溶液。
[0016] 利用本发明的技术方案，可以成功的把6-氨基嘌呤半抗原与载体蛋白特别是钥 孔血蓝蛋白（KLH)成功偶联起来，从而合成了能够在动物体内引起免疫反应，产生抗体的完 全免疫原。利用此免疫原免疫兔、鼠、鸡的等动物可以产生对6-氨基嘌呤有特异反应的抗 体，这为该偶联物用于制备6-氨基嘌呤的酶联免疫检测试剂提供了广阔的应用空间。把该 抗体堵在微孔盘内，就可以用来检测实际体系内的维生素M的含量。该方法具有简易、快 速、特异、准确的特点，用于实际样品的检测，不仅能节省大量时间，还可以用于现场操作， 从而弥补了仪器法费时间长，需要大型仪器设备支持，需要专门技术人员操作，难以现场操 作的不足。所以，半抗原6-氨基嘌呤与载体蛋白特别是钥孔血蓝蛋白（KLH)偶联物的合成 为这种快速检验法奠定了基础。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1: (1)称取20mg的KLH于IOmL圆底烧瓶中，加入2ml蒸馏水，配成KLH的溶液，即溶液 A0
[0018] (2)称取5mg维生素M于IOmL离心管中，加入ImL二甲基甲酰胺（DMF)，然后再 加入100yLlmol/L的NaOH溶液，使其溶解，得到溶液B。
[0019] (3)将溶液B在搅拌条件下逐滴加入到溶液A中，得到混合液C。取41. 9yL的戊 二醛（25%，v/v水溶液）加入C溶液中，在搅拌条件下室温反应4小时，得到反应液D。
[0020] (4)将反应液D加入到截留分子量为30KDa的超滤管中，利用离心超滤的方法将未 反应的小分子物质除去，离心条件为3300转，40分钟，将反应液浓缩至ImL左右时，再加入 2mLPBS缓冲液（pH=7. 40)，继续在同样的条件下超滤80min，得到浓缩液。
[0021] (5)冻干浓缩液得到6-氨基嘌呤(维生素B4)的偶联物。通过紫外吸收光谱确定 该偶联物在26Inm处有特征吸收峰。
[0022] 实施例2: (1)称取30mg的KLH于IOmL圆底烧瓶中，加入2ml蒸馏水，配成KLH的溶液，即溶液 A0
[0023] (2)称取5mg维生素M于IOmL离心管中，加入ImL二甲基甲酰胺（DMF)，然后再 加入100yLlmol/L的NaOH溶液，使其溶解，得到溶液B。
[0024] (3)将溶液B在搅拌条件下逐滴加入到溶液A中，得到混合液C。取41. 9yL的戊 二醛（25%，v/v水溶液）加入C溶液中，在搅拌条件下室温反应4小时，得到反应液D。
[0025] (4)将反应液D加入到截留分子量为30KDa的超滤管中，利用离心超滤的方法将未 反应的小分子物质除去，离心条件为3300转，40分钟，将反应液浓缩至ImL左右时，再加入 2mLPBS缓冲液（pH=7. 40)，继续在同样的条件下超滤80min，得到浓缩液。
[0026] (5)冻干浓缩液得到6-氨基嘌呤(维生素B4)的偶联物。通过紫外吸收光谱确定 该偶联物在26Inm处有特征吸收峰。
[0027] 实施例3: (1)称取40mg的KLH于IOmL圆底烧瓶中，加入2ml蒸馏水，配成KLH的溶液，即溶液 A0
[0028] (2)称取5mg维生素M于IOmL离心管中，加入ImL二甲基甲酰胺（DMF)，然后再 加入100yLlmol/L的NaOH溶液，使其溶解，得到溶液B。
[0029] (3)将溶液B在搅拌条件下逐滴加入到溶液A中，得到混合液C。取41. 9yL的戊 二醛（25%，v/v水溶液）加入C溶液中，在搅拌条件下室温反应4小时，得到反应液D。
[0030] (4)将反应液D加入到截留分子量为30KDa的超滤管中，利用离心超滤的方法将未 反应的小分子物质除去，离心条件为3300转，40分钟，将反应液浓缩至ImL左右时，再加入 2mLPBS缓冲液（pH=7. 40)，继续在同样的条件下超滤80min，得到浓缩液。
[0031] (5)冻干浓缩液得到6-氨基嘌呤(维生素B4)的偶联物。通过紫外吸收光谱确定 该偶联物在26Inm处有特征吸收峰。
【主权项】
1. 一种6-氨基嘌呤的偶联物，由6-氨基嘌呤半抗原与产生免疫原性的载体物质偶联 构成，所述载体为优选蛋白质，蛋白质片段，合成多肽或半合成多肽。2. 如权利要求1所述的6-氨基嘌呤偶联物，其中所述的产生免疫原性的载体物质是钥 孔血蓝蛋白。3. 如权利要求2所述的6-氨基嘌呤偶联物，其结构通式如（齡：其中m为与一个血蓝蛋白结合的6-氨基嘌呤的个数，所述n为整数1-20 KLH为血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin)，分子量范围为 45KDa_130KDa。4. 上述偶联物显示出如下物化特征： (1 )外观：白色粉末固体 (2 )紫外吸收光谱：261nm〇5. 如权利要求3所述的6-氨基嘌呤偶联物，其中n为整数1-20,KLH分子量范围为 45KDa-130KDa〇6. 如权利1~4任一项所述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法，其特征是将6-氨基嘌呤 与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物， 并保持该偶联物的生物活性不变。7. 如权利5所述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法，该方法步骤如下： 溶液A的制备：将6-氨基嘌呤溶于二甲基甲酰胺（DMF)溶液中制成溶液A;溶液B的 制备：将KLH溶于蒸馏水中制成溶液B，其中6-氨基嘌呤与KLH的摩尔比为200:1~400:1; 溶液A在搅拌条件下加入到B溶液中，得到溶液C; 取一定量的戊二醛加入C溶液中，在搅拌条件下室温反应4小时，得到溶液D; 将溶液D用30KDa的超滤管超滤，超滤条件为3300转，40分钟，浓缩至1毫升左右，再 加入2毫升磷酸缓冲溶液，继续超滤80分钟，得到最终浓缩液F; 将F溶液冻干，得到6-氨基嘌呤偶联物。8. 如权利6所述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法中，其中所述的6-氨基嘌呤与KLH 的摩尔比为200:1~400:1。9. 如权利6所述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法中，其中所述的磷酸缓冲液pH为 7.40，浓度为0.01]?。10. 如权利6所述的6-氨基嘌呤偶联物的制备方法中，其中所述的戊二醛的浓度为体 积百分比为25%的水溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种通式（？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？）的6-氨基嘌呤（Adenine，又称腺嘌呤，其磷酸盐为维生素B4）的偶联物，由6-氨基嘌呤半抗原与产生免疫原性的载体物质钥孔血蓝蛋白构成，其中n为与一个钥孔血蓝蛋白结合的6-氨基嘌呤的个数，n为整数1-20，KLH为钥孔血蓝蛋白，分子量范围为45KDa-130KDa。本发明还公开了所述的偶联物的合成制备方法，将6-氨基嘌呤与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明具有方法简便、快速、特异、准确的特点，为用所述偶联物制备维生素B4或6-氨基嘌呤其他衍生物的酶联免疫试剂提供了广阔的应用空间。（Ⅰ）。
【IPC分类】C07K14/795, C07K1/10
【公开号】CN105085670
【申请号】CN201510522477
【发明人】郗日沫, 王玉芬, 孟萌, 尹永梅, 李小刚, 张丽沙, 宋兆瑞, 董亚庆, 许坤, 龙浩
【申请人】天津三箭生物技术有限公司, 南开大学, 李小刚
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月24日