一种抗t淋巴细胞瘤的自身t细胞疫苗及制备方法

专利名称：一种抗t淋巴细胞瘤的自身t细胞疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗，尤其是具有提高抗T淋巴瘤和其他类型肿瘤的抗T淋巴细胞瘤的自身T细胞疫苗，及其制备方法和用途。
背景技术：
自身反应性T细胞参与了自身免疫病的发生，接种未活化的自身反应性T细胞可以引起抗独特型反应，从而减少此种引起自身免疫病的自身反应性T细胞。但是，接种减活的健康自身T细胞是否可以增加抗肿瘤反应，这点还尚未明了。
众所周知，免疫系统的监视功能可以在体内抑制肿瘤的生长。但是在许多情况下，肿瘤可以通过限制有效的免疫反应而逃脱免疫系统的监视。虽然在肿瘤细胞表面也有一些肿瘤抗原被认为可以介导抗肿瘤免疫反应使肿瘤细胞暂时消失，但是体内大部分的恶性肿瘤细胞不会被免疫系统所排斥。这牵涉了多方面的原因，比如，恶性肿瘤细胞可以通过多种机制介导免疫耐受。在恶性肿瘤病人中，免疫应答及对刺激因素的反应性都显著低于正常个体。并且，由于一些抑制性细胞因子的分泌，如TGF-β、IL-10等使得恶性肿瘤细胞无法诱发有效的特异性免疫反应。因此，在研究及发展新的抗肿瘤治疗中如何提高抗肿瘤免疫应答是首要任务。近来，对于恶性肿瘤病人治疗的临床试验大都围绕在诱导抗肿瘤的特异性免疫反应中。例如，DC疫苗是肿瘤免疫治疗中最普遍的生物制剂疗法。目前多种DC疫苗被研制开发，大都是通过基因修饰或负荷肿瘤抗原以期实现用更多的抗原在体内引发较强的抗肿瘤反应的目的。然而，由于DC疫苗制备的复杂性及较高的成本使之暂时还难以真正运用到临床治疗当中。
在抗肿瘤免疫反应中，T细胞发挥了重要作用。它参与了细胞毒性杀伤作用，免疫调节及保持免疫自稳等。激活的CTL通过释放颗粒酶B或通过Fas-FasL途径介导调亡从而直接融解肿瘤细胞。并且，CD4+T细胞可以通过释放一些细胞因子而引起肿瘤细胞的免疫排斥。然而，在恶性肿瘤患者的体内T细胞的活性被下调。例如，肿瘤病人细胞在体外对丝裂原或抗原的刺激显示较低的反应性。因此，对于肿瘤治疗来说，有效生物治疗的关键就是增强抗肿瘤T细胞的功能。有证据表明，对肿瘤患者使用IL-2加INF-γ可以诱导肿瘤的消退。这些都更进一步说明，在肿瘤的生物治疗中，增强抗肿瘤T细胞反应是重中之重。
给同系动物或病人注射经照光的活化的自身反应性T细胞可能能够诱导抗独特型T细胞反应，从而在体内抑制自身反应性T细胞。但是到目前为止，国内外从未有过对于用健康活化灭活T细胞免疫接种后具有抗肿瘤的研究报道。
对于肿瘤病人，当手术切除了原发病灶以后，残余的肿瘤细胞要靠放疗或者化疗进行清除，而这两种治疗方法副作用十分严重，而且往往不能完全消灭残余肿瘤细胞。树突状细胞(DC)是体内最有效的抗原递呈细胞，可以激发强大的主动抗肿瘤免疫。但是由于肿瘤抗原性弱、肿瘤患者DC细胞功能不成熟，因而通常情况下肿瘤患者无法产生有效的主动抗肿瘤免疫。
免疫系统具有免疫监视而抑制体内肿瘤的生长。但是在大多数情况下，肿瘤细胞可以逃脱免疫监视而在体内生长。虽然肿瘤也能够表达特异性抗原，但是大多数肿瘤还是不能被免疫系统所排斥。恶性肿瘤细胞的生存与许多因素有关。如肿瘤细胞具有诱导免疫耐受的作用。在恶性肿瘤病人，免疫反应比健康人低的多。此外，恶性肿瘤细胞可以通过分泌抑制性细胞因子如TGF-β和IL-10而抑制免疫应答。因此，增强抗肿瘤免疫应答是设计和发展新型抗肿瘤治疗的关键。最近，已经发展了许多旨在提高病人的特异性抗肿瘤反应的临床试验。如树突状细胞肿瘤疫苗是最常用的肿瘤生物治疗之一。DC疫苗通过在体内诱导T细胞对肿瘤的免疫反应而达到增强抗肿瘤的目的。但是，DC细胞少，制备十分繁琐，因而限制了DC疫苗在临床上的使用。
T细胞在抗肿瘤免疫中具有十分重要的作用。T细胞介导的细胞杀伤和免疫调节作用具有维持免疫平衡的作用。活化的杀伤性T细胞(CTL)可以通过释放粒酶或通过Fas-FasL途径而介导肿瘤细胞的裂解。此外，CD4+T细胞也能够通过分泌细胞因子而介导抗肿瘤免疫。DC疫苗也必须通过活化T细胞才能达到抗肿瘤免疫。然而，肿瘤病人体内活化的T细胞表达下调。如肿瘤病人体内的T细胞对丝裂原或抗原刺激反应是降低的。因此，增强T细胞的抗肿瘤作用是提高抗肿瘤生物治疗的关键。许多证据已经表明，通过联合使用IL-2和IFN-γ能够在有效提高抗肿瘤作用，在某些病人甚至导致肿瘤消退。因此，增强T细胞功能是抗肿瘤生物治疗的关键。

发明内容
本发明的目的在于提供一种具有提高抗T淋巴瘤的自身变构细胞接种疫苗。
本发明是利用健康的减活的自身活化T细胞作为疫苗。
该疫苗能加强免疫增生的能力，并能有效的抵御淋巴细胞的激活诱导凋亡(AICD)，从而更好的抑制肿瘤细胞的增长。
在本发明中，我们证明了用正常灭活的自体T细胞皮下接种后，可以在体内诱导T细胞的活化，并在体外引起T细胞的强烈增殖。更为重要的是，此种免疫增强了抗肿瘤反应，在接种了T淋巴瘤的小鼠体内可使肿瘤生长抑制。其中CD4+T细胞可通过分泌大量的细胞因子如白介素、肿瘤坏死因子、γ干扰素等提高患者的肿瘤免疫力、CD8+T细胞则可以直接识别杀伤表达肿瘤抗原的癌细胞、NK对肿瘤细胞的杀伤力也增强，从而达到抑制肿瘤细胞的目的。因此，本法制备的自体T细胞对于手术切除的肿瘤患者，有助于预防复发及消除残余的癌细胞；对于无法手术治疗的患者，能使瘤块缩小，阻止其转移和扩散，提高生存率。是良好的辅助治疗肿瘤的方法，可用于临床的肿瘤辅助治疗。
以下结合附图及实例详述本发明。


图1自身T细胞免疫反应引起的T细胞增殖。对照组和免疫的C57小鼠的脾脏细胞在包含10％的FCS的培养基中培养，培养中加入ConA(2μg/ml)作为阳性对照。用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入来测量细胞增殖。标记的培养基表示在培养基中包含10％FCS。标记的ConA表示在培养基中含有ConA。
图2由自身T细胞免疫反应引起的T细胞活化与增殖。脾脏细胞在包含10％FCS的培养基中培养24小时，1×106的细胞被CD3，CD4，CD8以及CD62L的羊抗鼠抗体标记，用流式细胞仪进行检测。开放的和黑色的条带表示从免疫组和对照组中分离出来的细胞。A免疫组和对照组中增殖的T细胞亚群。B用CD62L作为激活标志对T细胞进行活性分析。
图3体外免疫组小鼠脾脏细胞的抗AICD反应。在包含10％FCS的培养基中培养48小时后用Annexin-V plus-PI双标记检测脾脏细胞凋亡，并用流式细胞仪进行分析。只有Annexin-V+/PI-的细胞被认为是凋亡细胞。分析凋亡的T细胞亚群，细胞被Annexin-V，PI和CD4或CD8抗体标记同时发生。A在对照组(左)和免疫组(右)中设门分析调出的凋亡抑制细胞。B培养48小时后凋亡细胞的百分比。C培养48小时后T细胞亚群凋亡情况。开放条带代表对照组凋亡细胞百分比。黑色条带代表免疫组小鼠脾脏细胞百分比。
图4在不同的时间点分析免疫组和对照组小鼠Fas和FasL的转录。免疫组和对照组小鼠脾脏细胞在包含10％FCS的培养基中培养0小时，24小时，48小时，72小时，96小时，抽提RNA并用real-timePCR检测mRNA水平的Fas和FasL的翻译。在同一个样本中Fas表达用内源性GAPDH的表达进行标准化，用免疫组小鼠的ΔCT值和内参(GAPDH)的差异来计算表达。计算Fas/FasL基因的相对表达以及表达2-ΔΔCT。A对照组和免疫组中的Fas表达。B对照组和免疫组中的FasL表达。
图5免疫组小鼠T细胞高表达GADD45β。免疫组小鼠T细胞在包含10％FCS的培养基中培养，GADD45β的表达用real-time PCR和Western blot进行检测。在0小时，2小时，8小时，16小时，24小时，48小时抽提RNA进行real-time PCR检测。在同一个样本中GADD45β表达用内源性GAPDH的表达进行标准化.。用免疫组小鼠的ΔCT值和内参(GAPDH)的差异来计算表达。计算GADD45β基因的相对表达以及表达2-ΔΔCT。
图6对于肿瘤威胁的免疫保护作用。将小鼠分为两组，每组5只。对照组(n＝5)接受1×106的EL-4细胞接种而不接种稀释的自身T细胞。免疫组五只小鼠在接种1×106的EL-4细胞之前每五天免疫三次，另外在第5天和第10天时免疫两次。在肿瘤细胞接种后每两天测量一次肿瘤体积，当肿瘤体积达到2.0cm3时停止观察。处死小鼠获得血清做细胞因子和NK CTL检测。AEL-4细胞接种后肿瘤体积与时间的关系。B免疫组与对照组细胞因子的表达。C免疫组与对照组的NK细胞的细胞毒性。D免疫组与对照组的CTL细胞的细胞毒性。
具体实施例方式
一、材料和方法老鼠雌性C57/B1/6鼠购自于上海试验动物中心，中国科学院。饲养于无菌环境，于4～8周龄使用；制备自体活化T细胞于完全必需培养基DMEM10％小牛血清，10mMHEPES，50uMβ巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，50IU/ml青链霉素；使分离纯化的脾细胞(3×106/ml)用2ug/mlConA(VectorLaboratories，Burlingama，CA)刺激72小时。收集细胞，PBS(PH7.4)洗涤三次。接着用特异性抗体包被的磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)通过阴选纯化T细胞。所得T细胞纯度大于92％。纯化后的T细胞经照光仪使用3000rad照光，作为后续免疫接种所用的自体活化T细胞。
用照光自体T细胞免疫的最佳试验条件分别用1×106(lower dose)，5×106(middle dose)and 10×106(high dose)三种不同T细胞量进行免疫。纯化的T细胞经3000rad照射后和100ulPBS腹腔注射入小鼠体内，并另外单独皮下注射100ulPBS。同样的方法每隔五天注射一次，共三次。对照用同样方法注射200ulPBS。第三次注射五天后，收集小鼠脾脏细胞。
增殖试验简单说来，新鲜分离的脾脏细胞(2×105per well)于含有三倍完全DMEM的培养板中加ConA或者不加ConA(2ug/ml)置于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。在收集细胞前的16-18小时加入1uCi[3H]脱氧嘧啶胸苷。用以测定CPM值。T细胞增殖的能力通过[3H]脱氧嘧啶胸苷的参入来决定。刺激指数(SI)(免疫鼠T细胞的CPM值/未免疫鼠的CPM)用来反应对于丝裂原的反应能力。
流式细胞术分析细胞表面分子为了研究T细胞活化及亚群分型情况，将细胞体外孵育在含10％FCS的完全培养基中24小时，收集细胞并用HBSS缓冲液洗涤两次，1×106细胞用特异性羊抗鼠的CD3，CD4，CD8及CD62L抗体染色，并用流式细胞仪检测。对于Fas及FasL的分析，培养的细胞分别于24、48、72、96及120小时收集，并用HBSS缓冲液洗涤两次，1×106细胞用特异性羊抗鼠的Fas、FasL染色，并用流式细胞仪检测。简单说来，将细胞重悬在含有1％BSA及0.1％叠氮化纳的PBS中，和标记有FITC或PE的抗体或同种对照抗体在冰上共孵育30分钟。Fas、FasL抗体购自BDBioscience。样品分析所用仪器为FACS CaliblerTM(Becton Dickinson，San Jose，CA)。
调亡试验调亡细胞用FITC标记的Annexin V及PI染色，并通过流式细胞仪检测。对于T细胞亚群中调亡的检测来说，脾细胞同时要用Annexin V，PI及抗CD4或CD8抗体(Cy5标记)标记。未免疫鼠及免疫过鼠的细胞培养在含10％FCS的完全培养基中并于48小时检测调亡。调亡细胞的数量用Annexin V+/PI-表示。调亡细胞的百分比通过Annexin V+/PI-细胞数与总细胞数之比计算。
实时PCR检测mRNA表达细胞分别培养24，48，72小时并收集。细胞用HBSS缓冲液冲洗两次，细胞总RNA用迷你试剂盒从1×106细胞沉淀物中提取出来。基因组DNA在cDNA合成之前用不含RNA酶的DNA酶消化以利于RNA纯化。RNA保存在-80度。针对每一个RNA样本使用Sensiscript RT试剂盒合成第一条链cDNA。使用任意六聚物引导cDNA的合成。FAS，FASL，和GADD45β的mRNA表达用SYBR Green主要的混合物的实时PCR确定的。热循环条件包括一个起始保持在50度两分钟，然后95度十分钟，接下来的两步PCR程序包括40个循环的95度十五秒和60度六十秒。通过ABI-7900定量PCR检测系统收集和定量分析数据。小鼠β肌动蛋白基因用来做内源性控制，以标准化每个样本的RNA的量的差异。PCR的引物对如下所述Fas，5’-GCAGAAAGTCCAGCTGCTCC 3’-TTCTGCGACATTCGGCTTTT和FasL，5’-CACAACCACTCCCACTGCC 3’-CAGAGCCACCAGAACCATGAMouse GADD45β5’-CCTGGCAGAAATCGCTATGAA和3’-TGGAGTAGTTTTGAGTGTGGAAGGMouseβ-actin 5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’和5’-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAG A-3’.
肿瘤生长抑制测定在这项研究中使用小鼠淋巴细胞瘤细胞系EL-4。C57B1/6小鼠分成两组。控制组没免疫的小鼠皮下接种1×106EL-4肿瘤细胞。免疫接种组C57小鼠在接种0.5×106EL-4肿瘤细胞前免疫三次。每天测定肿瘤体积。在这组中，每周注射活化的T细胞直到控制组小鼠死亡。
NK细胞毒性测定YAC-1细胞，一种髓细胞性白血病细胞系，在加入了10％胚牛血清的RPMI-1640完全细胞培养基中培养。细胞悬液洗三次，并重新在RPMI-1640悬浮，作为所有试验的靶细胞。单个脾细胞从自然和免疫的小鼠中获取作为效应细胞。NK的细胞毒性的细胞毒性用乳酸脱氢酶释放试验来估价。总之，在测定缓冲液中的5×104恒量的靶细胞，加入到96个圆孔底的培养平板。在研究中效应细胞对效应靶细胞的数目的比例为40∶1，20∶1，10∶1，5∶1。在37度5％CO2中培育四个小时后，100μL上清液转到相应的平底微量滴定平板。随后，加入100μL乳酸脱氢酶混合物。随后，在37度孵育五分钟后，在全自动定量绘图酶标仪上吸光度为490nm时检测。细胞毒性按照如下公式计算，吸光毒性＝(试验测得-效应细胞自然释放-靶细胞自然释放的LDH量)/(靶细胞最大释放-靶细胞自然释放LDH量)×100。
CTL细胞毒性测定在这项测定中，EL-4，一种小鼠淋巴母细胞在10％FCS RPMI-1640完全培养基中培养。细胞悬液用PBS洗涤三次，并在RPMI-1640重新悬浮作为靶细胞。CD8+T细胞从新鲜的用Dynol beads阴性选择的脾细胞。CTL的细胞毒活性用乳酸脱氢酶释放试验评估，如在以上的NK测定。一系列的效应细胞与效应靶细胞之比为10∶1，5∶1，2.5∶1和1.25∶1，操作步骤如同以上的NK测定一样。
ELISA测定细胞因子血清从免疫的和自然的处死的小鼠中获取。血清样本中细胞因子(IL-12，IL-10，IL-4和TNF-α含量)用ELISA法测定。简述之，微量滴定板用小鼠单克隆抗体覆盖在4度下过夜，在室温下用含3％牛血清白蛋白的PBS封闭2小时，并用含0.02％ Tween 20的PBS洗涤。每个样本和它的对照加入临近的孔并在4度下培养过夜。冲洗四次后，加入适当的生物素检测抗体，并培养2个小时。板冲洗四次，并用稀释为1∶2000的抗生物素蛋白接合的辣根过氧化物酶培养2个小时。在柠檬酸盐缓冲液中的0123％四甲基联苯胺0.008％H2O2作为底物。颜色的变化可通过2N H2SO4中止。光密度用ELISA酶标仪在450nm测定，细胞因子的浓度可计算。
统计分析组之间的增殖和肿瘤体积的不同由Mann-Whitney U试验检测。一个学生的测定用来分析组间的不同，做单向方差分析决定在使用配对或不配对的学生T TEST检验是否存在显著的差异。P值小于0.05被认为有显著统计学意义。
结果一、自体T细胞免疫诱导的T细胞自发性增殖活性增强。
为检测是否自体T细胞免疫可增强T细胞反应，从免疫的C57小鼠中获取的新鲜的脾细胞在10％FCS，带有ConA或不带有ConA完全的DMEM中培养。细胞增殖在培养后72小时测定。结果显示，从免疫的小鼠中获取的脾细胞，在没有其它的刺激物的情况下，在10％FCS完全的培养基中呈高水平自发增殖。对照，用PBS处理的小鼠的脾细胞不显示自发增殖。在免疫的和未免疫小鼠中有显著不同。然而，从免疫的或未免疫小鼠获取的脾细胞用ConA刺激后的增殖水平没有显著不同。
为了评估是否免疫接种诱导抗TCR抗体，TCR抗体在体外可调节T细胞增殖，免疫过的小鼠取出的血清加入从免疫和天然的小鼠中的脾细胞，然后，在体外培养三天。测量增殖情况，结果显示，从免疫的小鼠中获得的血清不能启动T细胞的增殖。不论细胞用免疫的或是未免疫小鼠的血清共同培养，都没有增殖。而且，我们分析免疫小鼠的CTL的细胞毒性作用，结果显示当CTL用CD4T细胞培养未发现细胞毒性。这表明，免疫既不能诱导足量的可参与TCR抗TCR抗体和活化T细胞增殖，也不能诱导抗TCR的杀伤。
二、自体T细胞免疫诱导T细胞在体内扩增和活化。
为确定是否T细胞在免疫后增殖，T细胞亚群用特异抗体标记后，经流式细胞仪分析。结果显示来自免疫小鼠的CD3+T，CD4+T，CD8+T高于未免疫小鼠，表明用自体T细胞免疫能刺激T细胞数量在体内扩增。而且，为表明是否增殖的T细胞被免疫接种活化，实施抗CD62L抗体染色测定。结果表明，从免疫小鼠获取的CD62L阳性的T细胞高于同样情况的未免疫小鼠细胞的五倍。两组的细胞计数有显著差异。这些结果表明，用未被照射的自身T细胞的免疫能增加体内T细胞的数量和诱导T细胞的活化，并进一步导致T细胞自发在体外的增殖。
三、免疫小鼠的脾细胞在体外对抗激活诱导凋亡活性。
为表明是否在体外，免疫接种增加T细胞抵抗活化诱导的细胞死亡，凋亡细胞用Annexin-V加PI染色检测，当细胞在体外培养48小时后用流式细胞仪分析。结果显示在选定细胞群中，未免疫小鼠淋巴细胞中有比免疫的小鼠更多的Annexin-V+和PI-的细胞，表明未免疫小鼠的凋亡细胞比从免疫的小鼠获得的凋亡细胞要多。而且，我们在48小时培育的T细胞亚群用Annexin V，PI和抗CD4或CD8抗体标记脾细胞，来识分析凋亡细胞的数量。在未免疫小鼠，CD4+T和CD8+T细胞显示了同样的更高程度的凋亡。而在免疫小鼠，T细胞亚群显示了更少的凋亡，特别是CD4+T细胞显示了更少的凋亡。
由于FAS和FASL是调节AICD的主要分子，我们通过实时PCR，检测免疫小鼠和未免疫小鼠FAS和FASL在T细胞的动态表达。结果显示在体外FAS表达是增加的。动态表达表明，FAS转录在24小时时开始，并维持更高的表达直到96小时后。在每个检测点，在免疫小鼠的FAS表达都高于在未免疫小鼠。相反的，FAS配体表达要低于未免疫小鼠。这些结果显示，用失活的自体T细胞免疫后增加了FAS分子的转录，但是不能增加在体外培养的T细胞FAS配体的分子的表达。
四、GADD45β在免疫小鼠T细胞中的高表达。
用实时定量PCR方法检测从免疫小鼠获取的T细胞GADD45β的表达。结果显示，在不同的检测点，GADD45β的mRNA水平高于天然小鼠。在新鲜分离的T细胞，GADD45β的表达比未免疫小鼠高3倍。这表明，自体T细胞免疫启动了在体内的基因转录。在体外研究中，细胞培养在10％FCS的完全培养基中，在16小时时，GADD45β的mRNA增加达到了最高水平。此后，GADD45β的mRNA的转录缓慢减低。对比一下，在未免疫小鼠，GADD45β的mRNA的水平逐渐上升并在8小时处达到最高水平。但是在8小时后，GADD45β水平快速下降并在48小时降到基线。这个结果显示了GADD45β转录在体内通过免疫激活并保持了在体外脾细胞对刺激的敏感性。
五、自身T细胞接种后增强免疫反应具有抑制肿瘤生长活性。
为了检测由自身反应性T细胞介导的细胞增殖是否引起了抗肿瘤反应的增强，在免疫过的小鼠体内接种小鼠T淋巴母细胞瘤细胞EL-4，在免疫组和对照组观察肿瘤生长情况。图6A显示，在最后一次免疫后，肿瘤生长减慢。12天后免疫组的肿瘤体积比对照组明显减小，在观察结束时免疫组的肿瘤体积也比对照组明显减小。以上结果显示在免疫组小鼠体内肿瘤生长发生停滞。
六、免疫组小鼠血清IL-12浓度增高。
在小鼠被处死前收集两组小鼠的血清，血清样本做ELISA来检测IL-12，IL-10，IL-4和TNF-α的表达。结果显示只有IL-12的表达是免疫组明显高于对照组，另外三种细胞因子在两组之间并没有明显差别。以上实验说明免疫组小鼠分泌的大量的IL-12可能是激活了体内的抗肿瘤细胞反应的机制之一。
七、免疫组小鼠体内NK细胞和CTL杀伤活性增加。
收集两组小鼠的脾脏细胞，通过LDH释放反应分析NK细胞的细胞毒性活性。结果显示NK细胞和CTL的细胞毒性活性免疫组比对照组明显升高。分析NK细胞，把脾脏细胞作为效应细胞，免疫组脾脏细胞的细胞毒性活性根据不同效应细胞与靶细胞比例(E∶T)呈现明显的剂量依赖反应。在对照组没有看到上述现象。分析CTL的细胞毒性，CTL与EL-4细胞孵育后免疫组小鼠的CD8+T细胞显示高的OD值，提示免疫组小鼠的CTL对于EL-4细胞有较强杀伤活性，也呈明显的剂量依赖性。这些数据显示免疫组NK细胞和CTL细胞毒性增加。
通过本发明，我们用同品系健康小鼠活化的、灭活的T细胞给小鼠皮下接种3次以后可以诱发小鼠体内T细胞的活化。表现为小鼠的T细胞对丝裂原和异种抗原的反应能力增强、在体外存活时间延长、活化的细胞增多、CD8+T细胞增多。而且小鼠的NK和CTL活性也增强。这些经过免疫的小鼠对于T细胞型肿瘤细胞(EL-4)的抵抗力增强，表现为经免疫后的小鼠，在接种EL-4细胞株以后，出现肿瘤的时间晚、肿瘤生长小。与对照组相比有显著差异(p＜0.01)。而且，我们的初步实验证实，这一方法不仅对于EL-4肿瘤细胞具有抑制作用，而且对于小鼠的黑色素肿瘤也具有抑制作用(实验数据未显示)。提示这一自体活化T细胞疫苗可能具有广泛的抗肿瘤活性。因此，我们拟就这一方案扩大到临床使用。
讨论众所周知的是，将同系的动物或者病人体内活化的自身免疫型T细胞经过放射处理之后，它们能在体内诱导抗独特型T细胞，从而在某些案例中出现抑制和清除自身免疫型T细胞的结果[34，35]。例如，在多发性硬化症的病例中，大量的实验结果证实，调节性T细胞能够调节自身免疫型T细胞并在外周循环中将其清除，减轻症状。T细胞疫苗的临床研究证实，将灭活的自身T细胞接种回体内是安全有效的[32，33]。在本试验中我们首次发现，把自身活化的T细胞减活后免疫宿主能诱发肿瘤的生长，从而引起体内T细胞的活化。
在本发明中发现小鼠接种新鲜灭活T细胞后，其脾细胞能能在体外自发增殖。这种增殖现象，不需要任何其他的刺激物，只需要在10％的FCS的条件下即可发生。这预示着，给予宿主自体灭活T细胞免疫能在体内激发T细胞。这种接种诱导的T细胞增殖与自身免疫病中所用的T细胞疫苗不同，不是由于抗自身反应性T细胞的TCR而其作用，因为本发明中的免疫小鼠的血清不能诱导免疫小鼠的T细胞增生。这在使用免疫小鼠的抗血清和用CTL杀伤免疫小鼠CD4T细胞的实验中得到反映。这说明，15天内免疫小鼠3次并不能诱导足够的抗TCR抗体，也不能诱导足够的抗独特型CTL。但是我们试验的免疫方法的确超越了TCR途径转化了T细胞的活化，并使其对外源蛋白和丝裂原的刺激更为敏感。
为了进一步证明T细胞群能对免疫做出应答，我们通过特殊抗体染色，通过流式细胞仪检测了体内T细胞的扩增情况。结果显示，免疫之后，CD3+的细胞群发生了扩增。这说明，自身T细胞免疫能激发体内T细胞的扩增。另外，我们也检测了免疫后T细胞的活化。因为10％FCS中培养的T细胞标记上抗CD62L抗体后，阳性细胞能够被流式细胞仪所捕获。结果显示，相对于对照的天然小鼠，CD62L能在免疫后的小鼠的T细胞上显著的高表达。这说明，光照后的自身T细胞免疫不但能使体内T细胞群增殖，还能使T细胞活化。这进一步导致了体外T细胞自发的增殖。
众所周知，AICD是刺激之后淋巴细胞活化增殖的正常免疫反应，接着，这些细胞沿着程序直到死亡或者凋亡。这个过程在免疫系统的动态平衡上起到了非常重要的作用[34，35]。在AICD这一过程中有许多重要的因素参与。Fas和FasL是AICD中最为重要的介质[36，37]。Fas表达于活化的T细胞，并且是T细胞活化的标志之一。当淋巴细胞受到抗原刺激之后，Fas分子开始转录并表达于细胞的表面。接着，活化的淋巴细胞产生FasL并表达于细胞的表面。FasL能和外膜的Fas分子连接，并启动胞浆内Fas相关的死亡区域。一旦FasL和表达于自身或其他细胞的Fas相连，Fas下游的caspases级联反应程序就将启动。这将导致细胞的凋亡，它能阻断淋巴细胞的进一步活化，被称为AICD[38]。正常情况下，当没有外来刺激物作用时，体外培养的淋巴细胞在很短的时间内就会死亡。当存在外来刺激时，淋巴细胞会增殖后再凋亡。
为了了解免疫后小鼠T细胞的最终结果，我们检测了天然的和免疫T细胞增殖后的凋亡模式。结果显示，免疫后小鼠的凋亡细胞比天然小鼠的要少。在免疫小鼠的凋亡细胞中，CD4+T细胞对凋亡的敏感性比CD8+T要低。但是在天然小鼠中，这些T细胞亚群之间就没有区别了。这些数据显示，免疫小鼠的淋巴细胞不但能在体外增殖的更快，还能存活的更久。这说明，免疫小鼠的淋巴细胞能对外来增殖的刺激更敏感，而对于诱导死亡(AICD)有一定的抵抗能力。
为了进一步探索免疫细胞对于抵抗AICD介导的死亡的机制，我们在培养过程中，利用荧光定量PCR每24小时检测Fas和FasL的转录情况。免疫小鼠脾细胞的mRNA的水平要高于天然小鼠，但是免疫小鼠FasL的转录要低于天然的小鼠。之前所述的多数监测点的结果显示，免疫小鼠的FasL明显的低于天然的小鼠。这说明，免疫过程能诱导T细胞中Fas的表达上调，而Fas分子参与了这些T细胞在体外的活化和增殖。但是FasL的转录并没有同时上调。众所周知，T细胞的高Fas，低FasL能维持细胞的活化并抵御AICD。而免疫接种后，究竟是什么分子参与了凋亡的这个模式，又是什么基因参与了AICD的抵御呢？GADD(生长抑制和DNA损伤诱导)家族包括三个基因(GADD45α，GADD45β and GADD45γ)，它们非常的保守。并且当它们过度的表达于细胞株表面时，它们的分子功能和基因产物都非常的相近。但是，这些基因的调控各有不同，因此在体内，它们的功能也有差异。GADD45β能作用于细胞周期，凋亡，信号转导和细胞的存活。对T细胞而言，GADD45β能通过T细胞受体(TCR)和炎症信号而被迅速激活。CD4+T细胞的GADD45β的缺陷将削弱其对于炎症因子TCR刺激的反应。之前的研究显示，在许多的肿瘤和细胞株中，GADD45β能通过NF-kB下游的JNK信号途径来抑制细胞的凋亡。另外，最近的报道显示，T细胞和B细胞中的GADD45β能通过NF-kB有效的抵御AICD中Fas介导的死亡信号，维持细胞的生存。
由于GADD45β是AICD潜在的抑制物，我们在实验中定时检测了GADD45β的表达。相对于未免疫小鼠，免疫的C57小鼠的T细胞中GADD45β的转录更高。这说明，免疫能促进GADD45β在体内的表达。体外试验证明，FCS存在时，免疫后能使GADD45β的mRNA的量明显增高，并在16小时达到最高峰，随之缓慢下降。但是在每个监测点，免疫小鼠中GADD45β的水平都高于天然的小鼠。相反，在FCS的刺激下，未免疫小鼠GADD45β表达的mRNA能更快的达到最高峰，但是之后就快速下降。这些结果说明，免疫能在体内促进GADD45β的转录，并且能使该转录维持的相对久些。由于GADD45β的水平比较高，T细胞便能抵御Fas介导的凋亡。但是GADD45β是如何抵御Fas介导的凋亡呢，这个疑问目前仍没有解开。Akanksha报道，TCR的刺激能诱导核内NF-kB的暂时聚集，从而活化GADD45β的表达，并相应的抵御Fas介导的凋亡。但是在我们的实验中，免疫引起的T细胞的活化和Fas的表达并不是以TCR接合为前提的，因此这和Akanksha所述说的情况不同。所以，这就有必要探索GADD45β是如何阻断Fas介导的AICD的，但是这个阻断机制目前还仍处于研究阶段。
T细胞在肿瘤免疫中起到了非常重要的作用。活化的CTL和CD4+T细胞都在体内发挥了重要的清除肿瘤细胞的作用。众所周知，CTL和NK细胞能够通过释放颗粒酶B，或通过Fas-FasL介导的凋亡，或通过TNF-TNFR系统中的任意一条途径直接杀伤肿瘤细胞。CD4+细胞能够通过分泌细胞因子抑制肿瘤细胞的生长。正如之前介绍的，我们发现免疫后T细胞能够活化并有效抵御AICD。我们试图在体内找到这些活化细胞抗肿瘤的生物学功能。为此，我们建立了一个试验模型，用来证明是否免疫后T细胞的活化能抑制体内肿瘤的生长。在实验中，该小鼠在接受EL-4肿瘤细胞接种前就先接受了3次的免疫，肿瘤细胞接种后又接受了两次额外的免疫。观察发现，这些小鼠的肿瘤生长情况相对于对照组有明显的抑制。免疫后NK和CTL的杀伤活性都增强了。与此同时，细胞因子的监测显示，免疫小鼠体内的IL-12的浓度相对较高。
近来，大量的文献报道，IL-12能上调GADD45β的表达。另一方面，GADD45β的表达能诱导IL-12的分泌。GADD45β的表达和IL-12的分泌之间存在着正循环。就我们的结果而言，可以推断GADD45β不仅抑制Fas介导的凋亡，还能促进IL-12的分泌。
我们的实验结果显示，利用减活的自身活化T细胞作为免疫苗能有效的抵御体内肿瘤的生长。这一抗肿瘤机制主要有多种因素所用，包括T细胞的活化，对AICD的抵抗，高水平NK和CTL的细胞毒性作用。但是，关于T细胞免疫是如何发挥这些效用的研究还处于探索阶段。
我们的研究首次报道了这一事实，那就是，在小鼠模型中利用健康的减活的自身活化T细胞作为免疫苗能加强免疫增生的能力并能有效的抵御AICD，从而更好的抑制肿瘤细胞的增长。同样的原理可以用于人体的抗肿瘤辅助治疗。
用同样的方法测定对于小鼠黑色素肿瘤的体内抗瘤实验。初步实验证实，给小鼠接种了同种系健康活化灭活的T细胞后，同样能够抑制小鼠的黑色素肿瘤的生长。提示这一自体活化T细胞疫苗不仅对于EL-4肿瘤细胞具有抑制作用，可能具有更加广泛的抗肿瘤活性。显示其作为潜在的肿瘤辅助治疗作用。因此，在临床使用中，将有重大意义。
权利要求
1.一种抗T淋巴细胞瘤的自身T细胞疫苗，是利用健康的减活的自身活化T细胞作为疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种抗T淋巴细胞瘤的自身T细胞疫苗的制备方法是自体活化T细胞于培养基DMEM中，所述培养基DMEM10％小牛血清，10mMHEPES，50uMβ巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，50IU/ml青链霉素；使分离纯化的脾细胞3×106/ml，用2ug/mlConA刺激72小时，收集细胞，PH7.4之PBS洗涤三次；最后用特异性抗体包被的磁珠通过阴选纯化T细胞，纯化后的T细胞经照光仪使用3000rad照光，作为后续免疫接种所用的自体活化T细胞。
3.根据权利要求1所述的一种抗T淋巴细胞瘤的自身T细胞疫苗的用途，该疫苗用于抑制T淋巴瘤和其他肿瘤细胞在体内的生长。
全文摘要
本发明涉及一种抗T淋巴细胞瘤的自身T细胞疫苗，及其制备方法和用途。一种抗T淋巴细胞瘤的自身T细胞疫苗，是利用健康的减活的自身活化T细胞作为疫苗。该疫苗的制备方法是自体活化T细胞于培养基DMEM中，于10％小牛血清、10mMHEPES、50uMβ巯基乙醇、2mML－谷氨酰胺、50IU/ml青链霉素中；使分离纯化的脾细胞3×10
文档编号C12N5/08GK1875987SQ20061002715
公开日2006年12月13日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者李宁丽, 沈佰华, 王利 申请人:上海交通大学医学院