专利名称：用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1－CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合基因工程蛋白，尤其是用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途。
背景技术：
肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应是机体清除肿瘤细胞的主要手段，在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应答。第一个信号是抗原特异性的，由T细胞受体(TCR)及结合特异性抗原的MHC-I或II类分子介导的，第二个信号是由抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子(如B7分子)与T细胞表面分子(如CD28)反应介导的。肿瘤细胞通过下调参与T细胞识别及抗原反应的分子表达、降低免疫原性等途径逃逸机体的免疫监视。第二个信号缺失将导致T细胞产生“免疫无能”，从而阻止了肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)的克隆性扩增。
研究发现，肿瘤细胞表面共刺激分子B7.1(CD80)表达降低，这种共刺激分子信号的缺失可能是肿瘤细胞逃逸免疫监视、因而不能引起机体免疫应答及激活肿瘤特异性T细胞的机制，用转基因方法将B7.1基因转入肿瘤细胞，可以提高肿瘤细胞的免疫原性，引起T细胞介导的免疫反应，使机体不仅可以清除B7.1+肿瘤细胞，而且可以清除没有转染B7.1的原代肿瘤细胞。有研究发现，肾肿瘤细胞系RCC-1不表达B7.1、在体外不能刺激自身T细胞，转染B7.1后的RCC-1细胞可以诱导很强的自身CTL反应。这些实验结果表明，B7.1的表达具有诱导肿瘤特异性免疫反应及肿瘤免疫治疗的潜能。
急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)以及B细胞淋巴瘤的临床治疗，目前主要以化疗为主，但疗效较差，虽然可以取得暂时的缓解，然而生存期较短。因此，降低白血病的病死率，改善淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗方法是世界医学正在攻克的一个重点。急性淋巴细胞白血病(ALL)是恶性克隆增殖性疾病，可导致大量不成熟前体淋巴细胞体内积聚和浸润，占所有儿童急性白血病的85％和成人急性白血病的20％，在所有白血病中占25％，是一种十分常见的血液系统恶性肿瘤。根据白血病细胞的免疫表型，可将ALL患者分成B-ALL或T-ALL两类，其中B细胞ALL(B-ALL)ALL占70-80％。
近年来儿童ALL患者的临床预后得到了明显改善。但成人ALL患者的临床疗效仍然较差，大多数不能获得长期无病生存。因此开展以化疗、干细胞移植、免疫治疗及生物治疗等综合手段以提高患者远期疗效的研究方兴未艾。应用基因工程抗体进行肿瘤免疫治疗是当前的研究热点之，生物工程类抗体美罗华的临床应用为肿瘤的生物免疫治疗开创了新的局面，研究表明联合应用美罗华及化疗可以明显提高B-ALL和B细胞淋巴瘤(B-NHL)患者的临床预后。鼠源性抗CD19×抗CD3单链双特异性抗体也已进入临床试验阶段。表明免疫治疗是治疗恶性淋巴系统疾患的重要手段之一。
研究表明，ALL白血病细胞表面免疫共刺激分子B7.1表达降低，甚至缺如，导致白血病细胞不能有效地被细胞毒T细胞(CTL)识别杀伤。由于B细胞ALL通常表达HLA-DR和CD19表面抗原，因此，我们从免疫疗法入手，利用基因工程方法构建、表达B7.1-抗CD19单链抗体scFv(见本申请人的专利申请，200410072713.5)，利用CD19表面抗原作为ALL白血病细胞的表面标记，将B7.1结合到ALL白血病细胞表面，使之成为抗原提呈细胞。以进一步探讨血液肿瘤的免疫治疗机制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白，获得一种新的、能与B淋巴细胞白血病、淋巴瘤细胞结合的活性表达产物，并具有特异的生物学活性。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白，由SEQ ID NO.2所示的抗B7.1胞外区基因所表达的氨基酸序列及抗CD19单克隆抗体重链可变区以及轻链可变区基因所表达的氨基酸序列组成，并包括与CD19和CD28特异性结合的活性片段。
用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白，所述SEQID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
含有上述的融合基因工程蛋白的核苷酸序列的载体，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的cDNA的pMD-18T载体。
所构建的载体为pET22b(+)。
所述的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白或所述的载体在制备治疗急慢性B细胞淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果是本发明成功制备了B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白；该蛋白能有效地与B淋巴细胞白血病、淋巴瘤细胞结合特异性结合；在体外实验中能有效的介导肿瘤细胞刺激T细胞活化，分泌有利于抗肿瘤免疫的细胞因子，促进活化T的克隆性增殖，最终导致活化T细胞特异性杀伤肿瘤细胞；在动物体内实验中有效地延长荷瘤小鼠的生存期，具有显著的免疫治疗作用。该融合蛋白用于临床，将对B淋巴细胞白血病、淋巴瘤具有治疗作用。
图1为PCR扩增B7.1基因胞外区片段(MMarker)。
图2为PCR扩增的抗CD19-ScFv基因片段琼脂糖凝胶电泳(MMarker)。
图3为PCR扩增的B7.1-CD19scFv基因片段琼脂糖凝胶电泳(MMarker)。
图4a为B7.1-CD19scFv基因核苷酸序列示意图。
图4b为表达载体pET22b(+)-B7.1-CD19scFv蛋白表达载体示意图。
图5为Rosetta(DE3)-pET22b(+)-B7.1-CD19scFv表达的比较和优化。
图6为B7.1-CD19scFv的Western blot分析(MMarker)。
图7为B7.1-CD19scFv诱导表达后细胞可溶性部分经不同浓度咪唑(mmol/L)洗脱后10％SDS-PAGE电泳(MMarker)。
图8为B7.1-CD19 ScFv结合曲线及Scatchard分析。
图9a为竞争性免疫荧光抑制实验阴性对照组(AB血清+鼠源IgG)。
图9b为竞争性免疫荧光抑制实验阳性对照组(HI19a+PBS)。
图9c为竞争性免疫荧光抑制实验组(B7.1-CD19-ScFv+HI19a)图9d为阳性对照组与实验组FACS重叠图。
图10a为B7.1-CD19scFv介导的T细胞增殖分析。
图10b为B7.1-CD19scFv介导的T细胞增殖率。
图11为B7.1-CD19scFv介导T的细胞IFN-γ释放。
图12为B7.1-CD19scFv介导的CTL细胞毒活性。
图13为B7.1-CD19scFv对NOD/SCID荷瘤小鼠的治疗作用研究。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明的用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白作进一步的详细说明一、人类自细胞表面抗原B7.1基因克隆1.从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人B7.1分化抗原cDNA序列，借助引物设计软件primer 3设计引物。
扩增B7.1胞外区的引物primer-sen5’-ccggaattcggtgttatccacgtgac-3’EcoRIantisen5’-cccaagctttgtattccagttgaagg-3’Hind III2.RT-PCR扩增人类B7.1基因2.1从表达B7.1的B淋巴细胞中提取总RNA。
(1)取生长良好、能持续分泌抗CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞约106，加入1ml Trizol，吹打混匀，室温静置5分钟。
(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟。
(3)12000rpm，4℃，离心15分钟。
(4)取上清，加入0.5ml异丙醇室温静置15分钟。
(5)12000rpm，4℃，离心15分钟。
(6)弃上清，加入1ml75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心5分钟。
(7)弃上清，沉淀晾干，加入30μLDEPC处理的水溶解RNA沉淀，测OD260，OD280值，计算OD260/OD280比值，估算样品中RNA的含量和纯度。样品置于-80℃保存。
2.2逆转录cDNA。
RT-PCR逆转录20μl反应体系①将下列组分加入一无核酸酶的小离心管中。
随机引物(Oligo(dT)12-18)(500μl/ml) 1μl总RNA 2μg10mM dNTP Mix 1μl补H2O至12μl②65℃水浴5分钟后快速置于冰上，在管内加入下列试剂5×First-Strand Bμffer 4μl0.1M DTT 2μlRNase Inhibitor(40μnits/μl) 1μl③混匀，42℃孵育2分钟。
④加1μl(200μnits)MMLV逆转录酶逆转录酶，混匀42℃50分钟。
⑤70℃灭活15分钟，反应物保存于-20℃备用。
2.3PCR扩增人类B7.1基因反应体系为50μl10×buffer5μl2.5mM dNTPs 4μl50mM MgSO41μlPrimer Sense(20pmol/μl) 1μlAnti-sense(20pmol/μl)1μlTaq酶(5units/μl) 0.5μlcDNA 1μlddH2O36.5μl50μl扩增条件94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃1分钟，72℃30秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟。
3.PCR产物的酚氯仿抽提纯化在1.5ml微量离心管中将PCR产物稀释至400ul，加入等体积Tris饱和酚∶氯仿(v∶v＝1∶1)，混匀管中内容物使之成为乳浊液，用微量离心机于室温12000rpm离心1分钟。用移液枪将水相转移到另一个离心管中。弃去两相界面和有机相。加入等体积的氯仿再次抽提一次。加入2倍无水乙醇、0.1倍体积3M醋酸钠，于-20℃存放1小时，4℃离心，12000rpm，5分钟，弃上清。沉淀用1ml70％乙醇洗涤；离心后静止到乙醇挥发，将样本溶于20ulddH2O。取1ul样品于1％琼脂糖电泳定量检测。
4.重组质粒的测序将纯化后的PCR产物，连接入pMD-18T载体中，经酶切证实插入片段正确后，将阳性菌落3ml送上海生工生物工程公司进行DNA序列测定，将测序结果与GenBank数据库中公布的序列比较以证实序列正确。
二.B7.1-CD19scFv表达序列的构建1.引物设计根据原核表达载体pET22b(+)的酶切图谱以及抗人CD19scFv和人B7.1抗原胞外区的cDNA序列重新设计引物，在融合基因的N端引入His6基因序列。重组蛋白的链间连接肽DNA序列由博亚生物公司合成。抗人CD19scFv可以在市场购买(协和干细胞基因工程有限公司)。
1)扩增B7.1胞外区的引物primer-sen5’-catgccatggatcatcatcatcatcatcatggtgttatccacgtgac-3’NcoI (His)6antisen5’cgcggatcctgtattccagttgaagg-3’BamHI2)扩增抗人CD19scFv的引物primer-sen5’-ccggaattcgacattgtgctcacccagtctcca-3’EcoRIantisen5’-cccaagcttgtgaggagactgtgagagtggtgcc-3’Hind III3)B7.1与CD19scFv链间连接肽的DNA序列linker 1(sense chain)gatcccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactglinker 2(antisense chain)aattcagttgacacttggggtactttcttggtgtaacgaactaatagcgcattctgg2.PCR扩增100μl反应体系(于冰浴中混合各反应液)模板(已构建质粒) 1μl(＜1ng)10×PCR反应缓冲液(含Mg2+) 10μl上游引物 2μl(25pmol)下游引物 2μl(25pmol)dNTP(每种dNTP各2.5mM) 8μlPyrobestTMDNA聚合酶(5U/μl) 1μl
双蒸水补至终体积 100μl反应条件94℃预变性5min，变性94℃30sec、退火57℃1min、延伸72℃1min；30个循环最后72℃延伸7min。取5μl样品，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
结果见图1、图2、图3。
3.pET22b(+)-B7.1-CD19 scFv重组蛋白基因表达载体的构建将pET22b空载体用BamHI和EcoRI双酶切并纯化后连入链间连接肽。构成通用质粒。再将所得PCR产物分别经NcoI和BamHI、EcoRI和HindIII双酶切后连入通用质粒的相应酶切位点，组装成pET22b(+)-B7.1-CD19scFv重组蛋白基因表达载体。
结果见图4。
4.B7.1-CD19scFv基因工程蛋白的小量诱导表达及鉴定将组装后的ppET22b(+)B7.1-CD19scFv重组蛋白基因表达载体转化DH5α菌，取经测序读码框正确的一菌株小量制备质粒，转化Rosetta(DE3)，接种相同培养条件的(双抗性LB，3mL)，37℃振荡培养至OD600为0.6左右，在一管加入诱导剂IPTG(终浓度1mM)继续诱导，另一管作为非诱导对照，继续培养3～4小时。各取200μl菌液离心后向沉淀菌体中加入100μLSDS-PAGE上样缓冲液，将每一种细胞成分20μl，100℃水浴5分钟，进行SDS-PAGE电泳蛋白电泳分析(凝胶浓度10％)。进一步用Western blot验证，具体方法参考分子克隆，其中以抗His-tag抗体(IgG)为一抗与抗B7.1-CD19scFv重组蛋白上的(His)6标签结合，进行Western blot反应实验证明重组质粒pET22b(+)-B7.1-CD19scFv在大肠杆菌中经IPTG诱导有重组蛋白表达，1398bp片段表达出约65Kd的带(His)6的重组蛋白。
结果见图5、图6。
三、B7.1-CD19scFv基因工程蛋白的大量诱导表达1)从新鲜的划板平板中挑取单克隆，接入5ml含200μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的SOC培养基中，37℃，250rpm振荡培养至OD600为0.2～0.6。
2)离心收集菌体(1000g，5min)，除去上清，重悬于200ml新鲜含200μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的SOC培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD600为0.2～0.6。
3)离心收集菌体(1000g，10min)，除去上清，重悬于2000ml新鲜含300μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的SOC培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD600为0.2～0.6。
4)用250ml塑料离心杯离心收集菌体(1000g，10min)，除去上清，重悬于2000ml新鲜含300μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的TB培养基中，加入诱导剂IPTG(终浓度1mM)，37℃、250rpm振荡培养3.5h。
5)用250ml塑料离心杯离心收集菌体(4000g，10min)。
四、B7.1-CD19scFv基因工程蛋白的纯化以及超滤浓缩
1)将收集的菌体沉淀重悬于1/30培养体积预冷的50mmol/LTris-HCl、100mmol/LNaCl、pH8.0溶解。反复冻融3次后超声破碎细菌(超声30秒/冷却1分钟/150瓦/8次)，4℃，14000g离心20分钟。
2)上清转移至另一只新管中，用0.45μm滤膜过滤。
3)用10ml的去离子水洗柱后用10ml结合缓冲液平衡柱。
4)将过滤后的上清上柱，调整流速为10ml/h。
5)用10ml的结合缓冲液洗柱。
6)用10ml的洗涤缓冲液(10mM咪唑)洗柱。
7)用10ml含25mM咪唑的洗脱液洗柱。
8)用5ml浓度更高(10mM、25mM、50mM、75mM、100mM、150mM和200mM)的洗脱缓冲液依次洗脱蛋白。
9)用20μl等份的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的分布和纯度。
10)将蛋白纯度＞90％的洗脱液用PBS稀释，通过10,000MW的蛋白超滤膜，进行反复稀释脱盐至NaCl的浓度＜1mM，并浓缩蛋白至150μg/ml。
11)将浓缩的蛋白通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装并冻存与-20℃。
结果见图7。
五、B7.1-CD19scFv基因工程蛋白活性测定——结合常数的测定1)在96孔酶标板中加入100μl CD19表达阳性的白血病细胞系NALM-6细胞裂解液，37℃包被2小时；2)甩去包被液，以PBS(含0.05％Tween-20)洗3次，加入封闭液(PBS含3％牛血清白蛋白，10％羊血清)封闭2h后甩去封闭液，PBS洗涤3次。
3)一式二孔加入100μl 1∶3倍比稀释的B7.1-CD19scFv，以3％的牛血清白蛋白溶液作对照，37℃孵育2h。
4)除去反应液后以PBS洗涤三次，加入抗His-tag单抗(1∶2000稀释，0.1μg/ml)37℃孵育2h。
5)甩去第一抗体溶液，PBS洗三次后加入辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG(1∶1000稀释)，37℃孵育2h。
6)甩去反应液，PBS洗三次后，加显色液(OPD，H2O2)反应约10分钟以2N H2SO4终止反应，用酶标仪(Vamed Engineering，Austria)测定各孔OD492nm吸光值。每个B7.1-CD19scFv浓度的光吸收值取均值。
7)解离常数计算将数据代入ΔA＝ΔAMAX×L/(Kd+L)即ΔA＝-Kd×ΔA/L-ΔAMAX(ΔA为实验组与对照组的OD值的差，L为加入的重组的B7.1-CD19scFv的浓度。回归分析，计算解离常数Kd值。
结果见图8。
六、B7.1-CD19scFv基因工程蛋白结合活性测定-竞争抑制试验取NALM-6细胞，制成1×106/ml细胞悬液，加样于40孔细胞培养板，5×105细胞/孔。阴性对照组加100μll人AB血清，4℃孵育1h，3000rpm，4℃离心8min，弃上清液，PBS洗细胞2次，加鼠源性IgG20μl(1mg/ml)；阳性对照组于人AB血清封闭1小时后加入抗CD19单克隆抗体HI19a工作液20μl；试验组加人AB血清封闭后先加100μl B7.1-CD19ScFv，4℃孵育1h，3000rpm，4℃离心8min，弃上清液，PBS洗细胞2次，再加抗CD19单克隆抗体HI19a 20μl(1mg/ml)，4℃孵育1h，3000rpm，4℃离心8min，弃上清液，PBS洗细胞2次。三组细胞分别重悬于PBS中，加入20μl羊抗鼠IgG-FITC二抗，4℃孵育45min，PBS洗去未结合的荧光抗体，流式细胞仪检测单克隆抗体HI19a与NALM-6细胞系结合的阳性率。
结果见图9。
七、MTT法测定B7.1-CD19scFv促进T细胞增殖活性1)从中心血站取健康供者外周血，经HLA配型试剂盒检测为HLA*0201+者，用于实验。Ficoll分离，获得单个核细胞(MNCs)，塑料培养瓶贴壁过夜，获取悬浮生长的淋巴细胞。1640培养液洗涤2次，用含10％FCS的1640调整靶细胞浓度至1×106/ml。实验组与相应对照组各孔加200μl(2×105/孔)。
2)2500cGy铯源(Cs137)照射NALM-6细胞(HLA*0201+)，1640培养液洗涤2次，用含10％FCS的1640调整靶细胞浓度至2.5×106，实验组与相应对照组各孔加20μl(5×104/孔)。
3)实验组(三复孔)各孔加20μl 1∶2倍比稀释的B7.1-CD19scFv，其终浓度分别为6、3、1.5、0.75μg/ml。
4)对照组(三复孔)为240μl外周血单个核细胞或经铯源照射的NALM-6(CD19阳性，CD80阴性，HLA*0201+)细胞。
5)在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养58h，加MTT(浓度为5mg/ml，Fluka公司产品)20μl，37℃，4h，弃上清，加二甲基亚砜(DMSO)200μl混匀。用酶标仪检测570nm处的吸光度(A)值，PI用以下公式计算PI＝(A实验孔-ANALM-6细胞孔)/A淋巴细胞孔结果见图10a和图10b。
八、ELISA法测定B7.1-CD19scFv促进人T细胞IFN-γ释放活性ELISA试剂盒(购自晶美生物)，按试剂盒说明操作。
1)待测样本的制备，同实施方式七步骤1及步骤2制备淋巴细胞和NALM-6细胞，PBS组、CD19scFv(40μg/ml)组和B7.1-CD19scFv组(80μg/ml)按PBLC∶NALM-6＝5∶1共培养96h，分别离心收集上清，作为待测标本。
2)将浓缩洗涤液、标准品、标准品稀释液、密封板条从冰箱中取出室温预温。
3)制备标准品加入标准品稀释液至冻干标准品中，待彻底溶解后，静置15min混匀(浓度为10000pg/支)，稀释至2000、1000、500、250、125、62.5、31.25和0pg/ml)。
4)将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1∶20)。
5)除空白孔外，分别将标本或不同浓度的标准品加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。
6)准备生物素化抗体工作液以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1∶200)。
7)洗板5次，350μl/孔。
8)除空白孔外，加生物素化抗体工作液100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60min。
9)准备酶结合物工作液以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶200)。
10)洗板5次，350μl/孔。
11)加入显色剂100μl/孔，37℃避光孵育8～10min(视显色深浅灵活掌握)。
12)加入终止液100μl/孔，混匀后5min内酶标仪450nm波长测量吸收值(OD450)。
13)绘出标准曲线，通过标本的OD值在标准曲线上查出其浓度。
结果见图11。
九、B7.1-CD19scFv基因工程蛋白的体外生物学活性(CTL活性)1)淋巴细胞的制备从中心血站取健康供者外周血，经HLA配型试剂盒检测为HLA*0201+者，用于实验。Ficoll分离，获得单个核细胞(MNCs)，塑料培养瓶贴壁过夜，获取悬浮生长的淋巴细胞。
2)淋巴细胞的诱导增殖、活化a.2500cGy铯源(Cs137)照射NALM-6细胞，1640培养液洗涤2次后备用。
b.PBS组、CD19scFv组和B7.1-CD19scFv组分别取步骤a制备的NALM-6细2.4×106。
c.于各组分别加入1ml PBS、CD19scFv(40μg/ml)和B7.1-CD19scFv(80μg/ml)。
d.于各组分别加入1.2×107淋巴细胞，加10μl重组人IL-2(50万U/ml)，调整各组终体积至10ml(CD19scFv终浓度4μg/ml，80CD-CD19scFv终浓度8μg/ml重组人IL-2终浓度50U/ml)。
e.置37℃，5％CO2，饱和湿度孵箱孵育108h。800rpm离心15min收集淋巴细胞，1640培养液洗涤2次，用1640调整靶细胞浓度至5×106/ml。
3)靶细胞制备1000rpm离心10min收集对数生长期的NALM-6和MCF-7(CD19阴性，HLA*0201+)，1640培养液洗涤2次，用1640调整靶细胞浓度至5×105/ml。
4)在U底96孔板设置下列对照组和实验组(三复孔)a.效应细胞自然释放b.实验组按不同效∶靶比例(50∶1，25∶1，12.5∶1和6.3∶1)加效应细胞20μl，靶细胞80μl于96孔培养板。
c.靶细胞自然释放d.靶细胞最大释放e.体积校正f.培养液本底置37℃，5％CO2，饱和湿度孵箱孵育4h。提前45分钟在靶细胞最大释放和体积校正孔加10μl 10×细胞裂解液。1000rpm离心4min。
5)乳酸脱氢酶活性测定方法参考Promega公司产品(CytoTox 96Non-Radioactive CytotoxityAssay)说明书。
a.转移50μl步骤4培养上清至另一96孔新酶标板b.解冻Assay Buffer，取12ml Buffer溶解LDH底物c.加50μl LDH底物至96孔酶标板，室温避光反应20mind.每孔加50μl 1M柠檬酸终止液终止酶促反应e.酶标仪492nm测定吸光度(A492)6)CTL活性计算计算各组(3复孔)平均吸光度(A492)，按下列公式计算CTL裂解靶细胞的百分率。
结果见图12。
十、B7.1-CD19scFv基因工程蛋白的体内生物学活性1)实验动物准备从中国医学科学院实验动物研究所购得20只4周龄NOD/SCID小鼠。饲养一周后NOD/SCID小鼠接受150cGy铯源(Cs137)照射，随机分为A、B、C和D组，每组5只。
2)淋巴细胞制备从中心血站取健康供者外周血(HLA*0201+)，Ficoll分离，获得单个核细胞(PBMCs)，塑料培养瓶贴壁过夜，获取悬浮生长的淋巴细胞(PLCs)。
3)各组NOD/SCID小鼠分别通过眼静脉窦注射200μl的下列PBS混和悬液A组3×104NALM-6细胞。
B组3×104NALM-6细胞与1×107PLCs混和后随即注射。
C组3×104NALM-6细胞，1×107PLCs与7.5μg CD19scFv混和后随即注射，第12h和第36h再补充注射7.5μg CD19scFv(CD19scFv总剂量为7.5μg×3)。
D组3×104NALM-6细胞，1×107PLCs与15μg B7.1-CD19scFv混和后随即注射，第12h和第36h再补充注射15μg B7.1-CD19scFv(B7.1-CD19scFv总剂量为15μg×3)。
4)密切观察实验动物的体重变化，症状出现及生存期，绘制曲线。解剖死亡小鼠，称重肝、脾重量，对肝、脾、肺、骨髓和脊髓行实验病理检查。
结果见图13。
SEQUENCE LISTING(序列表)<110>中国医学科学院血液学研究所<120>用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途<160>2<170>Patent In version 3.1<210>1<211>1398<212>DNA<213>人和鼠<220>
<221>B7.1-CD19scFv基因<222>(1)..(1398)<400>1ggtgttatcc acgtgaccaa ggaagtgaaa gaagtggcaa cgctgtcctg tggtcacaat60gtttctgttg aagagctggc acaaactcgc atctactggc aaaaggaaaa gaaaatggtg120ctgactatga tgtctgggga catgaatata tggcccgagt acaagaaccg gaccatcttt180gatatcacta ataacctctc cattgtgatc ctggctctgc gcccatctga cgagggcaca240
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<221>B7.1-CD19scFv PEPTIDE<222>(1)..(466)<400>2Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser1 5 10 15
Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr20 25 30Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met35 40 45Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn50 55 60Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr65 70 75 80Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu85 90 95His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro100 105 110Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile115 125 125Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu130 135 140Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro145 150 155 160Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr165 170 175Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val180 185 190Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Gly Ser Gln Asn Ala Leu Leu Val195 200 205Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Glu Phe Asp Ile Val210 215 220Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val225 230 235 240Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp
245 250 255Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala260 265 270Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser275 280 285Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu290 295 300Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly305 310 315 320Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly325 330 335Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly340 345 350Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala355 360 365Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg370 375 380Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly385 390 395 400Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala405 410 415Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser420 425 430Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val435 440 445Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val450 455 460Ser Ser46权利要求
1.一种用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白，其特征是由SEQ ID NO.2所示的抗B7.1胞外区基因所表达的氨基酸序列及抗CD19单克隆抗体重链可变区以及轻链可变区基因所表达的氨基酸序列组成，并包括与CD19和CD28特异性结合的活性片段。
2.根据权利要求1所述的用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白，其特征是所述SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.含有编码权利要求1所述的融合基因工程蛋白的核苷酸序列的载体，其特征是含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的cDNA的pMD-18T载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征是所构建的载体为pET22b(+)。
5.根据权利要求1、2中任一项所述的B7.1-CD19scFv融合基因工程蛋白或权利要求3、4中任一项所述的载体在制备治疗急慢性B细胞淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1－CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途，涉及人B7.1胞外区和抗人CD19单克隆抗体重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述基因和多肽在制备用于白血病和淋巴瘤治疗药物中的应用。本发明采用基因工程技术成功制备B7.1－CD19scFv融合基因工程蛋白，为人急慢性B细胞淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤的治疗奠定了基础。
文档编号C12N15/63GK1919871SQ200610015650
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者王敏, 王建祥, 陈森, 陈礼平, 饶青, 疗小龙 申请人:中国医学科学院血液学研究所