专利名称：一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型生物活性因子(dsNKG2D-IL-15即双可溶性NK细胞活化 性受体NKG2D与细胞因子IL-15)融合蛋白的构建和制备基于利用肿瘤细胞自身结 合、富集、并反式递呈该活性蛋白，不仅直接激活其局部微环境内的NK或细胞毒性T细 胞(CTL)，并有望增强体内的特异性免疫应答，将可用于肿瘤的治疗，属于生物技术领 域。
背景技术：
肿瘤细胞降低HLA I类分子及共刺激分子的表达，逃逸机体内T淋巴细胞的监 视，却激活了 NK细胞的活性。如果NK细胞表面活化性受体传递的活化性信号强于抑 制性受体传递的抑制性信号，NK细胞将被活化，分泌细胞因子及直接杀伤肿瘤细胞，被 誉为是机体抗肿瘤的第一道防线。另一方面，肿瘤逃逸NK细胞监视功能的事实以及大 量实验依据证明，肿瘤组织内NK细胞的数目及功能均低于正常组织。因此，如何在体 内或体外促进NK细胞增殖、并提高NK细胞的生物学活性，决定以NK细胞为基础的肿 瘤免疫治疗的效果。NK细胞主要通过下面四条识别途径而活化1)非己识别，表现为通过模式识 别受体识别一些病原相关的分子模式而被活化。2)应激诱导的识别，即识别肿瘤细胞或 病毒感染细胞表面的应激分子，如MICA或ULBP蛋白等，与活化性受体NKg2D结合而 激活NK细胞。3)缺失自我的识别，表现为肿瘤细胞或病毒感染的细胞丢失或下调了经 典HLAI类分子的表达，引起抑制性信号减弱而使NK细胞活化。4)细胞因子介导的活 化，也是NK细胞活化的最有效刺激剂，例如DC细胞来源的IL-15是促进NK细胞增殖、 活化及发挥细胞毒效应的关键细胞因子；IL-12是促进NK细胞分泌IFN-Y最有效的细 胞因子；而IL-18可能促进NK细胞向淋巴结或脾脏内迁移，并与DC相互作用。IL-15被誉为是NK细胞的生长因子，也是NK细胞发育分化过程中的关键细胞 因子。IL-15与IL-2空间结构相似，含有4个α螺旋，分子量14 15KD。IL-15除 其特异性α受体外，与IL-2共有β受体，与IL-2、IL_4、IL_7、IL_9和IL-21共有γ 受体。与IL-2相比，IL-15可有效延长NK细胞生命周期，促进记忆性CD8+T细胞在体 内的长期存活，维持免疫记忆。虽然IL-2已被FDA批准用于转移性肾癌和恶性黑色素瘤 的治疗，但IL-2诱导肿瘤抗原限制性T细胞凋亡的特点会降低其抗肿瘤效应。另外IL-2 具有抑制记忆性T细胞存活、维持CD4+CD25+调节性T细胞的特点，提示用IL-15代替 IL-2用于肿瘤治疗，将产生更好的效果。IL-15及IL-15Rci基因敲除小鼠实验证明IL_15主要被细胞反式递呈而发挥效 应，即IL-15被树突状细胞或其他基质细胞分泌后，立即与这些细胞表面的受体α结合 (Ka = 10_")，再激活表达β与Y受体的邻近细胞(如NK细胞，CD8+T细胞)。而且 Lucas等制备可诱导性清除体内CDllchlgh DC的小鼠模型，发现淋巴结或脾脏内的DC细 胞反式递呈IL-15，是引起NK细胞致敏(细胞浆内储备颗粒酶和干扰素)的必要因素。另外，Kobayashi等将IL-15Rα转染小鼠高转移性结肠腺癌细胞株MC38，移植普通小鼠 可抑制肿瘤转移，而移植IL-15基因敲除鼠，短时间内肿瘤转移到肺组织导致小鼠死亡。 这些现象提示若建立肿瘤细胞反式递呈IL-15的作用方式，NK细胞不仅高效扩增与活 化，还具备靶向抗肿瘤的特点。若要肿瘤细胞反式递呈IL-15，首要方法是给肿瘤细胞转染IL-15Rci，但如何 让体内肿瘤细胞特异性摄取外源性的基因载体，目前的技术手段仍然困难。另一种较为 简便的策略是制备某种融合蛋白，既使其氨基端与肿瘤细胞特异性结合，又在羧基端携 带IL-15分子，从而具备激活NK细胞的效应。因此，选择合适的在肿瘤细胞与IL-15之 间“搭桥”的分子非常关键，既可制备某一肿瘤抗原的单克隆抗体，也可以选取该抗原 分子的受体。MHC I 类相关分子 A (MHC class I chain-related antigen A, MICA)是机体受到
应激反应后表达在细胞表面的一种糖蛋白，在大多数上皮性肿瘤细胞和病毒感染的细胞 表面广泛表达，而仅于正常肠道上皮组织中微量表达，成为肿瘤治疗很好的候选靶点。 NKg2D为MICA分子的受体，属于C-型凝集素家族成员，1个MICA分子可与两个同源 性的NKg2D分子结合，二者之间的亲和力相对较高(Kd为8X 10_7 4X 10_9M)。因此 体外制备的NKG2D分子在理论上具备体内靶向识别肿瘤的活性。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性因子dsNKG2D-IL_15 的序列及其制备方法，该方法能在体外大量表达dsNKg2D-IL-15蛋白，并且表达的 dsNKg2D-IL-15蛋白在生理环境下稳定而不降解。体内应用时，该活性因子可靶向结合 肿瘤细胞，并使肿瘤细胞反式递呈IL-15而激活NK细胞。本发明的方案是取NKg2D胞外区基因序列，通过柔性片段连接另一段相同 NKg2D的胞外区序列，体外表达后可在空间构象上形成二聚体。然后在其羧基端加上 IL-15,既靶向识别肿瘤细胞，又可以反式递呈IL-15，达到刺激NK细胞活化和增殖的目 的。本发明所说的增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子，是双可溶性NK细胞活化 性受体NKG2D与细胞因子IL-15融合蛋白dsNKG2D-IL_15，它的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明还公开了 dsNKG2D-IL-15的制备方法，其步骤如下l)dsNKg2D-IL_15表达载体的构建以原核表达载体pQ31为骨架，利用PCR 分别扩增两个相同人NKG2D受体的胞外区片段SEQ IDNO : 2和SEQ IDNO : 3，将这两 个片段先后插入PQ31载体，中间接上柔性片段；然后将IL-15的PCR扩增片段SEQ ID NO 4插入pQ31载体，与上述两个胞外区片段形成串联，中间接上柔性片段，得到融合 蛋白表达载体；2)dsNKg2D-IL-15蛋白的表达和纯化将上述融合蛋白表达载体转化入M15大 场杆菌菌株，经IPTG诱导表达，然后洗涤包涵体，变性条件下用Ni+-ITA树脂纯化，进 一步复性后得到dsNKg2D-IL_15蛋白。本发明还通过正交实验摸索出适合该蛋白的特定复性条件包括所需的最佳离
4子浓度、缓冲体系和酸碱度，分别为pH7.5，Tris-Base 20mM, Nacl 2OmM，甘油10%。 大量复性后超滤浓缩，交换在PBS缓冲体系，置于4°C条件下一周，蛋白质无明显沉淀及 降解。得到的dsNKg2D-IL_15蛋白经测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；其
中氨基酸残基位置1-3为dsNKg2D-IL-15基因片段插入载体后在连接部位产生的无关序 列；氨基酸残基4-142为第一个NKG2D胞外区的序列；165-303为第二个NKG2D胞外 区的序列；氨基酸残基326-439为IL-15的序列；氨基酸残基143-162、304-323为柔性 片段的序列；氨基酸残基163-164、324-325为两个片段连接时产生的无关序列。上述复性完全的dsNKg2D-IL_15重组蛋白，利用间接ELISA的方法分别鉴定 NKG2D和IL-15抗体结合该重组蛋白的能力；利用夹心ELISA和间接免疫荧光法鉴定该 融合蛋白结合MICA配体及超表达在K562细胞表面MICA分子的能力；最后鉴定该蛋 白刺激NK细胞活化、分泌IFN-Y及杀伤靶细胞的能力。实验结果证实该体外制备的 dsNKg2D-IL_15重组蛋白，具有靶向识别肿瘤细胞表面相应配体及激活NK活化、增殖 及杀伤肿瘤细胞的活性。
图l.dsNKg2D-IL_15融合基因片段的构建策略图。图2.dsNKg2D-IL_15蛋白介导肿瘤细胞反式递呈IL-15激活NK细胞的模式图。图3.pQE31-dsNKG2D-IL_15 重组载体经 BamH I 和 Hind III 双酶切后的 电泳图(l.Marker，2.PQE31 -dsNKG2D-IL-15/B+H, 3.PQE3l-dsNKG2D-IL-l5, 4.PQE31 -dsNKG2D-IL-15, 5.PQE31 -dsNKG2D-IL-15/B+H)。图4.利用DNAstar软件分析插入序列和标准序列之间的比对情况。图5.经不同时间IPTG诱导后重组蛋白表达的电泳图(1.未诱导，2.诱导后4h， 3.诱导后5h，4.诱导后6h)。图6.重组蛋白纯化过程中各步骤收集液体的PGAE电泳结果(1.包涵体，2.上样 穿透，3.W1, 4.W2, 5.E1, 6.E2, 7.Marker)。图7.重组蛋白质在不同缓冲体系中的PAGE电泳图(l.Marker，2 10.为表3条 件下dsNKg2D-IL-15电泳图)。图8.显示重组蛋白经超滤管交换缓冲液后的PAGE电泳图(1.纯化后蛋白，2.复 性第1天蛋白，3.复性第2天蛋白，4.复性第3天蛋白，5.超滤上液，6.超滤下液， 7.Marker)。图9.NKG2D抗体鉴定重组蛋白的间接ELISA法检测结果。图10.IL-15抗体鉴定重组蛋白的间接ELISA法检测结果。图11.夹心ELISA法检测重组蛋白与其配体MICA结合的结果。图12.流式细胞仪检测不同浓度重组蛋白分别与K562、K562-MICA细胞结合的结果。图13.流式细胞仪检测可溶性或固定型dsNKg2D-IL_15蛋白对NK细胞表达 CD69影响的情况。图14.流式细胞仪检测可溶性dsNKg2D-IL_15蛋白对NK细胞毒活性和IFN- Y分泌影响的情况。
具体实施例方式l.dsNKg2D-IL-15基因重组表达载体的构建IlPCR扩增的引物序列利用生物信息学的手段，分别设计相应的引物(见表 1)扩增出 sNKG2D (a)、sNKG2D (b)及IL-15 的基因片段。在 sNKG2D (a)和 sNKG2D (b)
的下游引物序列上分别加上(Gly4Ser)4的反向互补序列(表中方框内显示)，并考虑到密 码子的兼并性原则，提高该蛋白的翻译效率。图1显示dsNKg2D-IL-15融合基因片段的 构建策略。表l.sNKG2D (a)、sNKG2D (b)及IL-15基因扩增的引物序列
权利要求
1.一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子，其特征在于，它的氨基酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
2.—种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子的制备方法，其特征在于，步骤如下1)表达载体的构建以原核表达载体pQ31为骨架，利用PCR分别扩增两个相同 人NKG2D受体的胞外区片段SEQIDNO: 2禾Π SEQ ID NO 3，将这两个片段先后插入 PQ31载体，中间接上柔性片段；然后将IL-15的PCR扩增片段SEQ IDNO : 4插入pQ31 载体，与上述两个胞外区片段形成串联，中间接上柔性片段，得到融合蛋白表达载体；2)蛋白的表达及高效复性将步骤(1)得到的融合蛋白表达载体转化入M15大 场杆菌菌株，经IPTG诱导表达，然后洗涤包涵体，变性条件下用Ni+-ITA树脂纯化，进 一步复性后得到dsNKg2D-IL_15蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子及其制备方法，所说的活性因子的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。它通过以下方法制得利用PCR分别扩增出SEQIDNO2-4的片段，将这三个片段串联插入pQ31载体，各片段中间接上柔性片段；得到融合蛋白表达载体；再将融合蛋白表达载体转化入M15大场杆菌菌株，经IPTG诱导表达，然后洗涤包涵体，变性条件下用Ni+-ITA树脂纯化，进一步复性后得到dsNKg2D-IL-15蛋白。本发明能在体外大量表达dsNKg2D-IL-15蛋白，并且表达的蛋白在生理环境下稳定而不降解，具备使肿瘤细胞反式递呈IL-15激活NK细胞的活性。
文档编号C12N15/62GK102020717SQ201010533669
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者季明春, 杨悌, 潘兴元, 龚卫娟 申请人:扬州大学