专利名称：一种产单磷酸类脂a的大肠杆菌基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产单磷酸类脂A (MPL)的基因工程菌，特别是一种无需诱导直接生产MPL的大肠杆菌。
背景技术：
疫苗佐剂可以非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。铝佐剂是目前全球公认的广泛应用于人体的疫苗佐剂，安全可靠，可显著增强体液免疫反应，但是对细胞免疫的效果不够理想。因此，人们致力于开发更加高效安全的疫苗佐剂。类脂A可以被宿主细胞表面的Toll样受体4 (Toll Like Receptor 4，TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-a、IL-6、IL_8等多种炎性细胞因子。细胞因子的种类和数量主要取决于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂。MPL 是一种含有6条及7条脂肪酸链的单磷酸类脂A混合物，其有效结构是3位脱酰基化、2位添加十六碳羟基脂肪酸链的单磷酸类脂A，是已应用于临床试验的脂质体佐剂，人类临床试验的不良反应频率与铝佐剂一样低，其炎症毒性是LPS的0. 1%。目前，仅有Corixa公司生产商业化的MPL ,其生产方法是从沙门氏菌中提取脂多糖，再进行一系列水解、层析、纯化等过程。现有生产方法的缺点在于第一、沙门氏菌是致病菌，操作起来比较困难；第二、该方法涉及到化学处理，步骤繁多，影响产品质量和产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的产MPL的基因工程菌，其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于MPL佐剂的前期大规模生产。为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E.coli W3110 A IacIlacZ::pagL-lpXE-pagP，其基因组中IacI发生缺失突变失活，IacZ基因内部敲入表达pagL、IpxE 以及 pagP 基因。类脂A自细胞内膜内侧开始合成，合成途径比较保守，但在转运到外膜外侧的过程中可以发生多种修饰，以适应外界环境。目前，与类脂A结构修饰有关的基因已有报道。利用这些基因，根据类脂A分子的合成及修饰机理，通过基因工程技术将大肠杆菌中类脂A的结构改造成为MPL。所述IpxE来源于弗朗西斯菌，其编码的蛋白质可以水解类脂A分子I位上的磷酸；pagL来源于沙门氏菌，其编码的蛋白质可以水解去除类脂A分子3位的脂肪酸链；pagP来源于沙门氏菌，其编码的蛋白质可以在类脂A分子3 2位上添加一条十六碳脂肪酸链。为使外源基因在大肠杆菌中组成型表达，敲除染色体上的IacI基因，IacI基因编码Iac操纵子中的调节蛋白，敲除该基因可以解除调节蛋白的阻遏作用。本发明还提供了一种利用所述基因工程菌发酵生产MPL的方法。其中发酵方法为常规发酵方法，MPL的提取方法为将过夜培养的菌液按初始OD6tltl=O. 02转接到200mL LB液体培养基中，37° C培养至0D_=1时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)悬浮菌体,磁力搅拌lh,2000rpm离心20min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入27mL 12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超声震荡lOmin，100° C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8, v/v/v), 2000rpm离心IOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将类脂A洗出。类脂A的检测、分析·
薄层层析(TLC)检测将样品点于Gel 60 TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色。ESI/MS分析类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPTQ-TOF Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式,检测范围小于m/z2500。
图1野生型大肠杆菌与基因工程菌类脂A TLC分析1:W3110类脂A样品；2:突变株HW002类脂A样品图2基因工程菌类脂A ES I/MS分析A:W3110类脂A样品；B:突变株HW002类脂A样品图3野生型大肠杆菌与基因工程菌脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264. 7产生IL_6的分析
具体实施例方式实施例1突变株E. coli W3110 A Iacl的构建1、IacI基因敲除片段的获得采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得IacI基因敲除片段，其两端为IacI基因上下游同源臂、中间为kan片段。IacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将IacI基因敲除片段Xhol、PstI克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒pBlueScript II SK(+)-1acI (U)-pkan-lacl (D)。其中，kan 基因两侧带有 IoxP 位点。2、敲除感受态的制备及电转化接种带有Red 重组辅助质粒 pKD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA, 2000，97 (12) :6640-6645)的大肠杆菌 W3110 (ATCC39936)于含IOOii g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30° C，200rpm过夜培养。按2%接种量转接IOOmL LB液体培养基，30° C，200rpm培养至OD6tltl=O. 2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD6tltl=O. 5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4° C，8000rpm离心IOmin收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3次，最后用ImL 10%甘油悬浮,每管80 ii L分装至预冷的无菌EP管中。将500_1000ng IacI敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1. 5kv电击5ms, 30° C孵育2h，涂布30iig/mL卡那霉素的LB固体平板，30° C培养，挑取转化子于含30 u g/mL卡那霉素及100 u g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。3、温敏型表达载体pCRE的构建根据NCBI 数据库中 pSH47(Guldener U，Heck S，Fielder T, BeinhauerJ, Hegemann JH. A new efficient gene disruption cassette for repeated use inbudding yeast. Nucleic Acids Res, 1996，24:25192524)载体序列，米用化学全合成或PCR方法获得ere基因通过Sac1、NcoI酶切位点克隆到pKD46质粒多克隆位点，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布IOOii g/mL氨苄青霉素的LB固体平板，30° C过夜培养，挑取转化子提质粒酶切验证，得到Cre重组酶温敏型表达载体，并命名为pCRE。4、突变株抗性标记的去除将PCR验证阳性的菌株接种含30 ii g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42° C过 夜培养，将培养液划线30 u g/mL卡那霉素的LB固体平板，37 ° C培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110Iac1: :kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入带有重组酶Cre的温敏型表达载体PCRE,将阳性菌株于含100 u g/mL氨节青霉素的LB液体培养基中培养,加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导IoxP位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42° C热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为W3110 A IacI并保藏。实施例2突变菌株HW002的构建1、敲入片段 pagl-lpxE-pagP-Fkan 的获得采用PCR扩增的方法获得分别获得pagL、IpxE、pagP、Fkan基因片段，依次将其克隆到PWSK29，获得重组质粒pWSK29-pagL-lpxE-pagP_Fkan。PCR扩增带有IacZ-a天然同源臂的敲入片段pagL-lpxE-pagP-Fkan,其核苷酸序列如SEQ IN NO. 2所示。其中，kan基因两侧带有FRT位点。2、敲入感受态的制备及电转化以带有pKD46质粒的W3110 A IacI菌株作为出发菌株，制备感受态，方法同前。将500-1000ngpagL-lpxE-pagP_Fkan敲入片段电转入感受态细胞中，通过kan抗性筛选获得染色体IacZ基因内部敲入表达pagL-lpxE-pagP-Fkan的突变株W3110 A IacIlacZ::pagL-lpxE-pagP_Fkan03、突变株抗性标记的去除通过转入pCP20 质粒(Cherepanov P P，Wackernagel W. Gene disruptionin Escherichia col1:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzedexcision of the antibiotic-resistance determinant. Gene, 1995, 158(1) :9-14),42° C热激表达FLP酶，介导FRT位点的特异性重组即可去除kan抗性标记，筛选方法同前，得到的突变株命名为HW002并保藏。实施例3突变菌株HW002的类脂A结构分析1、突变菌株HW002的类脂A提取及薄层层析(TLC)分析类脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始OD600=O. 02转接到200mL LB液体培养基中，37。C培养至0D_=1时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗漆菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌lh, 2000rpm离心20min分相,使用一相体系洗漆细胞碎片2_3次。加入27mL 12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超声震荡lOmin，100° C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8,v/v/v), 2000rpm离心lOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)将类脂A洗出。接着进行薄层层析(TLC)检测，将样品点于Gel 60 TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色(图1)。TLC结果显示野生型大肠杆菌类脂A (泳道I)结构比较单一，为双磷酸形式，突变株HW002的类脂A (泳道2)结构有四种，其中包含MPL结构，其他结构是由于pagL、pagP基因的不完全表达造成的，这与商业化的MPL 成分一致，说明突变菌株可以产生含MPL的类脂A混合物。2、类脂A结构的ESI/MS分析
类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF MassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z 2500(图2)。野生型大肠杆菌类脂A结构为双磷酸形式，m/z值为1797. 2，提取过程中会造成少量I位磷酸基团缺失;MPL结构是3位脱酰基化、2位添加十六碳羟基脂肪酸链的单磷酸类脂 A，m/z 值为 1729. 3，而 m/z 值为 1491.1、1717. 3、1955. 5 的峰均为 PagL、PagP 不完全作用的产物。因此，突变株HW002可以产生含MPL的类脂A混合物。实施例4突变菌株HW002脂多糖(LPS)毒性分析
1、突变菌株HW002 LPS的提取及纯化LPS的提取采用热酚法。将过夜培养的菌液按初始OD6tltl=O. 02转接到800mL LB液体培养基中，37° C培养12小时后8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗涤菌体一次后称量菌体湿重，每3g湿菌体溶于IOmL ddH20中，68°C预热。加入等体积预热的90%苯酚，68°C剧烈振荡I小时。低温冷却后，4°C, 4000rpm离心20分钟,上清液用ddH20透析三天以去除苯酚，真空冷冻干燥得到LPS粗品。粗品用适量ddH20重悬后，加入RNase A(终浓度50 u g/ml)和DNase I (终浓度100 y g/ml)37°C处理2小时，再加入蛋白酶K (终浓度100 y g/ml)37°C处理过夜。酶处理后的样品中加入5mL水饱和苯酚，混匀，4000rpm离心30分钟，上清液用ddH20透析一天，真空冷冻干燥得到LPS。将LPS复溶到氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v),涡旋振荡30秒，12000rpm离心10分钟，移除上清，沉淀复溶在水中，真空冷冻干燥得到LPS纯品。2、LPS刺激小鼠巨噬细胞白血病细胞RAW264. 7后产生白介素-6 (IL_6)的分析RAW264. 7接种于96孔板，每孔IO5个细胞，37°C，5%C02培养12小时后，细胞贴壁，换新鲜培养液，加入不同浓度LPS (终浓度分别为10、100、1000ng/ml)，刺激24小时后取上清液，使用ELISA试剂盒(eBioscience，88-7064)检测IL-6含量(图3)。野生型大肠杆菌W3110和突变菌株HW002利用最小显着差法进行了差异分析，*P〈0. 05，**P〈0. 01。由于突变菌株类脂A结构的改变，尤其是MPL结构的出现，使得RAW264. 7细胞产生的IL-6显著下降，削弱了炎症反应，因此，突变菌株HW002产生的MPL混合物具有减毒的效果，可应用于后续疫苗佐剂的开发。本发明构建的菌株避免了使用致病菌生产类脂A，同时确保了 MPL有效结构的产生，更有利于大规模工业化生产。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种产单磷酸类脂A的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌基因组中 IacI发生缺失突变失活，IacZ基因内部敲入表达外源pagL、IpxE以及pagP基因。
2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)将人工构建的IacI敲除片段转化E.coli W3110，获得突变株E. coli W3110 lacl: :Pkan，通过位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因；2)将pagL-lpxE-pagP-Fkan片段电转入步骤I)制备的E.coli W3110 Δ IacI感受态细胞中，获得E. coli W3110 Δ IacI IacZ: :pagL-lpxE-pagP_Fkan,再次通过位点特异性重组去除其中的卡那霉素抗性基因。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述IacI敲除片段核苷酸序列如SEQID NO.1 所示。
4.权利要求2所述的方法,其特征在于所述pagL-lpxE-pagP-Fkan片段片段核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
5.权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于步骤I)所述的位点特异性重组为Cre酶介导的IoxP位点特异性重组。
6.权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于步骤2)所述的位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组。
7.权利要求1所述基因工程菌应用于单磷酸类脂A生产。
全文摘要
本发明公开了一种产单磷酸类脂A的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌基因组中lacl发生缺失突变失活，lacZ基因内部敲入表达外源pagL、lpxE以及pagP基因。本发明构建的菌株在其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于MPL佐剂的前期大规模生产。
文档编号C12R1/19GK102994435SQ20121042098
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者王小元, 韩雅宁, 陈久洲, 李烨 申请人:江南大学