专利名称：格列美脲和胰岛素诱导的糖基磷脂酰肌醇－特异的磷脂酶c调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及调节哺乳动物GPI-PLC(糖基磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C)活性的不同方法。
对哺乳动物质膜GPI-PLC特异的抑制剂GPI2350的合成是基于关于细菌和锥虫(G)PI-PLC的(晶体)结构、底物要求、GPI识别和切割机制以及迄今对它们描述的抑制剂的背景知识。对于锥虫GPI-PLC，GPI和PI分别是有效的和效力很差的底物，而对于细菌PI-PLC却刚好相反。细菌PI-PLC具有与80个残基的锥虫GPI-PLC相似的蛋白质序列区(“Kuppe等人(1989)J.Bacteriol.1716077-6083”)。为了分析GPI识别，最近已经测定了来自蜡状芽孢杆菌的PI-PLC与葡糖胺(glucosaminyl)(α1→6)-肌醇(GMI)的络合物在2.2分辨率下的三维结构并且揭示GMI的肌醇部分占据与游离肌醇相同的位置，而葡糖胺部分在催化部位入口处暴露于溶剂(“Heinz等人，(1995)EMBO J.143855-3863”，和“Heinz等人，(1996)Biochemistry 359496-9504)。核心四糖的剩余部分几乎不与PI-PLC接触，这可以解释所接受的GPI锚内核心聚糖的显著的结构多样性。总之，当前的实验数据表明细菌PI-PLC对PI和GPI切割的催化机理和锥虫GPI-PLC对GPI切割的催化机理都是相似的。然而，考虑到哺乳动物PI-PLC不能产生第二信使肌醇-三磷酸来接受GPI锚和细菌PI-PLC不能切割磷酸化的PI，不知道脂肪细胞质膜GPI-PLC是否也具有相似的催化机制。
以前用PI类似物和GMI衍生物已经检查了细菌和锥虫(G)PI-PLC的底物要求。催化需要在肌醇2位上的自由OH基。在用来自布鲁斯锥虫(T.bruei)的含有肉豆蔻酸的VSG进行的研究中，通过GMI的2-脱氧-肌醇类似物竞争性地阻断(G)PI-PLC，表明肌醇-2-OH尽管是催化所需的，但是对于底物识别不是必要的。此外，底物识别需要在肌醇-1位的带电的磷酰基(即，膦酸酯或者磷酸二酯)(“Morris，J.C.，等人，(1996)J.Biol.Chem.27115468-15477”)。从而，肌醇-1位和肌醇-2位的OH基都参与催化，然而仅仅磷酰基似乎是底物识别所需的。有趣的是，葡糖胺(α1→6)-肌醇-1，2-环磷酸原来对于锥虫GPI-PLC是比GMI-1-磷酸更好的抑制剂，而对于细菌PI-PLC却不是这样的，表明环状形式可以作为前者的产物类似物。此外，发现GMI-1-磷酸的膦酸衍生物是更有效的抑制剂，这最可能是因为它们是非切割的底物类似物。这些数据满足对细菌PI-PLC作用所提出的两步机制，其中PI首先被切割而产生环状肌醇-1，2-磷酸(cIP)结构，其然后水解成肌醇-1-磷酸。有趣的是，cIP结构当暴露于来自布鲁斯锥虫的GPI-PLC时，可以在免疫学上鉴定为所称作的锥虫VSG中的交叉反应决定簇，表明在锥虫GPI-PLC催化期间第一个步骤(环化)而不是第二个步骤(去环化)在运行。暂时或者稳定cIP形成的需要与如下发现相一致它们的肌醇残基在1-或者2-位被棕榈酰化的GPI锚，如人红细胞AChE的GPI锚抗磷脂酶切割。
发现对于锥虫的GPI-PLC，GMI-1-十二烷基膦酸酯比对应的己基衍生物更具抑制性，锥虫的GPI-PLC也是膜结合的(“Morris，J.C.等人(1995)J.Biol.Chem.2702517-2524”)。有趣的是，已经发现肌醇上缺少糖类取代基(例如，葡糖胺)时，肌醇-1-磷酸的非切割的类似物，如肌醇-1-O-十二烷基磷酸酯抑制锥虫GPI-PLC。当用2-氟取代取代2-脱氧-肌醇-1-O-十二烷基膦酸酯的2-位时，该类型的抑制剂的效力显著增加，所述2-氟取代物竞争性抑制锥虫GPI-PLC，IC50为10-90μM(“Morris，J.C.等人，(1996)J.Biol.Chem.27115468-15477”)。迄今报导的GPI-PLC的最有效的抑制剂在2-脱氧肌醇的2-位有氟基，在1-位有十二烷基-膦酸，该抑制剂比肌醇-1-O-十二烷基膦酸的抑制能力强至少5倍(Morris，J.C.等人(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.244873-867”)。有趣的是，这些化合物的一些对来自蜡状芽孢杆菌和布鲁斯锥虫的(G)PI-PLC的差别抑制证明这两种酶代表(G)PI-PLC的机械子类。
不幸地，还没有从哺乳动物GPI-PLC得到类似数据。令人惊奇地，新合成的肌醇-1，2-环-十二烷基膦酸(GPI-2350)结果是细菌以及脂肪细胞GPI-PLC的有效抑制剂。
细菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)从膜双层释放碱性磷酸酶(aP)，这一初步观察导致鉴定了涉及共价偶联糖基磷脂酰肌醇(GPI)脂类的蛋白质的另一类型的膜附着。
对来自布鲁斯锥虫(Trypanosome brucei)的表面糖蛋白变体(VSG)首次阐明了GPI锚的完整结构。
核心四糖由三个甘露糖残基和非乙酰化的葡糖胺组成，一端为通过磷酸乙醇胺桥连接到蛋白质部分的酰胺，另一端通过糖苷键连接到磷脂酰肌醇(PI)的6-羟基。PI由特异性C和D的(G)PI-特异的磷脂酶([G]PI-PLC/D)切割，分别释放二酰基甘油和磷脂酸，在蛋白质部分剩下末端(磷酸)肌醇聚糖(PIG)结构。
自那以后，多种来源的细菌PI-PLC已经常用于检测GPI-锚定的蛋白质(GPI-蛋白质)。
认为布鲁斯锥虫需要GPI-PLC对由GPI-锚定的VSG组成的保护性表面外壳的脂解释放以实现抗原性变异来逃避宿主的免疫系统。
因为多数哺乳动物细胞和组织表达GPI-蛋白质，它们的多数将它们的GPI锚包埋在质膜的外部小叶中，内源性(G)PI/PI-PLC/D可以控制它们细胞表面表达的特异下调和同时增加循环中可溶性蛋白质部分。
已经检测到GPI蛋白质的可溶形式在血流中循环，这些可溶形式为例如5-核苷酸酶(5’-Nuc)、Thy-1、碱性磷酸酶(aP)、和CD16受体。还可以在人嗜中性粒细胞、牛脑、大鼠肠和人癌细胞系中鉴定GPI-PLC。来自大鼠肝脏的GPI-PLC已经纯化均匀。已经描述了一种内源性GPI-PLC，其能够从猪最大小管(maximal tubule)释放肾二肽酶。
然而，仍然没有阐明GPI-PLC的结构或者基因。
而哺乳动物GPI-PLC是膜结合的，可以从不同物种(人、大鼠、牛)的所有类型的组织材料以及器官(胎盘、脑、肝、血清)回收哺乳动物GPI-PLD。
GPI-PLD的主要角色可能是内吞后降解GPI蛋白质的GPI锚和运输到溶酶体。
哺乳动物组织含有两种不同的GPI-PLD，它们在血清和细胞表面有活性，具有不同的功能性。
一些GPI蛋白质，如酵母和啮齿动物脂肪细胞中的5’-Nuc和aP，当它们的GPI锚被GPI-PLC在体外或者体内脂解切割时，似乎不从细胞表面以可溶形式释放。
分离颗粒级分/细胞后，需要额外的温和盐和/或胰蛋白酶切割来回收可溶性级分/介质中某些脂解切割的GPI-蛋白质的蛋白质级分，表明存在受体蛋白质。
在这些情况中，GPI-PLC的活性不影响GPI蛋白质的定位或者拓扑学，但是在它们从两亲性向亲水形式转化的过程中修饰功能(催化/结合)特征。完整GPI锚的存在影响附着到它的蛋白质级分的构象和行为。
对于5’-Nuc和Gce1，当与包埋在膜或者重建成去污剂微团或者脂质体的完整形式比较时，在脂解切割的GPI-蛋白质中催化和结合效率增加。
真核生物中的许多GPI-PL受到营养信号的上调，例如，在酵母中受到葡萄糖的上调，其中GPI蛋白质的脂解加工似乎在细胞壁的生物发生中起作用，并且在啮齿动物脂肪细胞、肌细胞和人内皮细胞中受到葡萄糖以及某些激素、生长因子和药物(例如，胰岛素、格列美脲)的上调。
格列美脲是一种抗糖尿病药物，其主要通过刺激胰岛素从胰细胞的释放降低血糖，而且但是在较小程度上通过模拟外周组织中代谢的胰岛素作用，如活化肌细胞中的葡萄糖转运和抑制脂肪细胞中的脂解作用来降低血糖。
磺脲类格列美脲的血糖降低效果部分是通过经由IRS-PI3K途径的胰岛素受体独立的活化刺激脂肪和肌细胞中非氧化性葡萄糖代谢来引起的。在分离的大鼠脂肪细胞中，已经阐明格列美脲作用的分子机理涉及脂类膜筏(raft)结合的信号传递组分，如酰化的非受体酪氨酸激酶pp59Lyn和一些GPI蛋白质的重新分布和相伴的活化，以及质膜糖基磷脂酰肌醇-特异的GPI-PLC的刺激，其也由胰岛素适度活化。
格列美脲是磺脲类活性剂，其刺激胰岛素从胰腺β细胞释放并且可以通过胰腺外机制发挥作用。将它每天一次施用于患有2型(非胰岛素依赖型)糖尿病的患者(在该患者中糖血(glycaemia)不是仅受到饮食和锻炼的控制)，并且可以与胰岛素组合用于二次磺脲类失败(secondary sulphonylureafailure)的患者。
格列美脲的最大降血糖效果发生在剂量后前4小时内。格列美脲对心血管变量的影响比格列本脲(优降糖)的更少并且更小。在年老患者或者肾脏或者肝脏疾病患者中药物动力学基本不变。已经记载了格列美脲的很少的药物相互作用。
在2型糖尿病患者中，格列美脲具有0.5到8mg/天的有效剂量范围，尽管在4和8mg/天剂量之间有很小的功效差异。在1年的研究中，格列美脲与格列本脲和格列吡嗪的功效相似。然而，在前几周的治疗中，格列美脲似乎比格列吡嗪更快地降低血糖。在14周的研究中在基线时具有良好的糖血控制的患者中比较了格列美脲和格列齐特，发现它们的效果之间没有差异。格列美脲加上胰岛素在帮助具有二次磺脲类失败的患者达到≤7.8mmol/L的禁食血糖目标水平中与胰岛素加上安慰剂一样有效，尽管用格列美脲看到了较低的胰岛素剂量和对糖血的更快的作用。
尽管格列美脲单一疗法通常是良好耐受的，但是在治疗≤1年的10-20％患者和接受6个月的伴随葡萄糖的≤50％的患者中发生低血糖。合并的临床试验数据提示格列美脲可能比格列本脲具有更低的低血糖发生率，尤其在前1个月治疗中。剂量通常以1mg/天开始，以1到2周的间隔对糖血控制逐步增加剂量到1到4mg/天的常规剂量范围(在英国最大6mg/天，或者在美国最大8mg/天)。
格列美脲主要通过刺激胰岛素从胰腺β细胞的释放并且在较小程度上通过模拟外周组织中代谢的胰岛素作用，如活化肌细胞中的葡萄糖转运和抑制脂肪细胞中的脂解作用来降低葡萄糖。
已经证明当用药理学浓度的格列美脲处理原代或者培养的啮齿动物脂肪细胞时，格列美脲通过活化GPI-PLC而有效诱导一小组GPI-蛋白质，如5’-Nuc、aP和Gce1的两亲性向亲水性的转化。
肌醇衍生物GPI-2350在本发明中首次公开，它以高效力(IC50＝0.2-10μM)和选择性抑制细菌、锥虫和血清GPI-PLC和GPI-PLD。GPI-2350几乎完全下调完整大鼠脂肪细胞中的GPI-PLC。而GPI-PLC在代谢胰岛素信号传递中不起作用，GPI-PLC的活化对于格列美脲的胰岛素模拟效应是必不可少的，通过从富含去污剂不溶性糖脂的脂类膜筏结构域(DIG)到胰岛素受体底物-1(IRS-1)的胰岛素受体独立的串话产生格列美脲的所述胰岛素模拟效应。
DIG在许多终末分化细胞，如脂肪细胞的质膜中大量表达，是特别的膜微型结构域，其作为膜介导的生物学过程的平台，所述生物学过程包括信号转导和运输和蛋白质与脂类的分选。
它们在外质小叶(exoplasmic leaflet)中富含胆固醇和(糖)鞘脂类并且在内部小叶中富含具有饱和酰基链的磷脂和胆固醇，在双层内形成脂类有序相。DIG的特征是在冷的1％ Triton X-100中不溶和当进行蔗糖梯度离心时具有低的浮力密度。基于这些标准，已经发现某些GPI-锚定的、酰化的和跨膜信号蛋白在质膜的DIG对非DIG区域中富集。此外，具有较高胆固醇含量的DIG(hcDIG)和较低胆固醇含量的DIG(IcDIG)可以基于它们的较低和较高浮力密度相互区别。
某些GPI-锚定以及酰化的信号蛋白自hcDIG向IcDIG的依赖刺激的重新分布受到GPI-2350的阻断。
GPI-2350通过脂类膜筏-相关的GPI-PLC减小GPI-蛋白质，如Gce1和5’-Nuc从完整大鼠脂肪细胞的基础脂解释放和格列美脲/胰岛素诱导的脂解释放(IC50＝5-10μM)。GPI-2350(50μM)对GPI-PLC的抑制导致几乎完全阻断(i)pp59Lyn和Gce1从小窝蛋白的解离，(ii)它们从hcDIG向IcDIG的重新分布，(iii)pp59Lyn和IRS-1的酪氨酸磷酸化，(iv)葡萄糖转运的刺激和(v)响应格列美脲的脂解作用的抑制。
GPI-PLC的胰岛素活化对脂类膜筏分布具有适度影响，并且它在代谢的胰岛素信号传递中的较小作用(如果存在)仅在GPI-2350的存在下阐明，因为它(例如，IRS-1的酪氨酸磷酸化和脂解作用的抑制)仅仅受到微小地减小。
格列美脲诱导的GPI-PLC产生的脂解切割的GPI-蛋白质保持与hcDIG结合而不是像它们的未切割的两亲性形式以及pp59Lyn那样重新分布到IcDIG中。
在大鼠脂肪细胞中，通过重新分布和活化的pp59Lyn经过IRS酪氨酸磷酸化引起格列美脲与胰岛素信号级联的串话需要hcDIG-相关的GPI-PLC的活化。
本发明涉及鉴定调节哺乳动物GPI-PLC的活性的化合物的方法，其中a]将哺乳动物细胞与格列美脲温育；b]制备a]的细胞的hcDIG；c]将来自b]的hcDIG与化合物温育；d]测定来自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
根据该方法的步骤a]的哺乳动物细胞属于啮齿动物或者狗的细胞。啮齿动物是例如，小鼠、大鼠或者豚鼠。该方法还涉及人的细胞，或者类人猿，例如，黑猩猩、大猩猩或者狒狒。此类细胞为例如，胰细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、脂肪细胞。还可以通过细胞培养物提供哺乳动物细胞。对于细胞的获取、graving、收获和加工，使用常规技术(例如，Current Protocols in Cell Biology；John Wiley&Sons；0-471-24108-3-Loseleaf；0-471-24105-9-CD-ROM)。
来自根据本发明方法的步骤c]的hcDIG的GPI-PLC的活性的测定通过测量pp59Lyn从hcDIG的解离，或者通过测量pp59Lyn和/或Gce1从hcDIG向IcDIG的重新分布，或者通过测量pp59Lyn和/或IRS-1的磷酸化的改变，或者通过测量葡萄糖转运的刺激和/或脂解作用的抑制来进行。
本发明还涉及可以通过前面公开的本发明方法鉴定的化合物。此类化合物为例如，本发明公开的式I的化合物或者其衍生物。
本发明还涉及处于所有立体异构形式的式I化合物 其中R1、R2、R3和R4相互独立地为OH或F并且R5为(C1-C20)-烷基或者(C2-C20)-烯基，和其所有比例的混合物，和它的生理学上可耐受的盐。
本发明还涉及如前面提到的式I化合物，其中R1、R2、R3和/或R4的任意两个相互独立地为F。
本发明还涉及如前面提到的式I化合物，其中R1、R2、R3和R4在每种情况中为OH。
本发明还涉及如前面提到的式I化合物，其中R5为C12-烷基。
本发明的此类化合物具有例如下面的通式，包括其所有立体异构形式 或者本发明的此类化合物具有例如下面的通式
本发明的此类化合物可以例如命名为肌醇-1，2-环十二烷基膦酸，包括其所有立体异构形式。
在本发明的上下文中，术语(C1-C20)-烷基将涉及所有立体异构构型(conformation)的直链或者支链的下列基团甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基。
在本发明的上下文中，术语(C2-C20)-烯基将包括所有立体异构构型(conformation)的直链或者支链的下列基团乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基。
本发明还涉及制备肌醇-1，2-环-十二烷基-膦酸的方法，其包括a]磷酸化外消旋的1，4，5，6-四-O-苄基-肌醇得到四-O-苄基-肌醇-1，2-环-十二烷基-膦酸。
b]四-O-苄基-肌醇-1，2-环-十二烷基膦酸的催化氢化。
所述制备方法可以应用于通过使用包含如上述的R1、R2、R3、R4和/或R5的适宜的原料制备本发明的任意其他化合物。
本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种式I的化合物和/或其生理学上可耐受的盐和/或其前体药物和药学上可接受的载体。
本发明还涉及式I化合物和其生理学上可耐受的盐和/或其前体药物的用途，用于改变用于治疗糖尿病的药物的副作用。这种药物为例如格列美脲。副作用为例如，格列美脲的错误剂量导致的低血糖。
本发明还涉及式I化合物的用途，用于生产处理用于治疗糖尿病的药物(例如，格列美脲)的副作用的药物组合物。
本发明还涉及鉴定调节格列美脲活性的化合物的方法，其中a]将哺乳动物细胞与格列美脲和化合物的混合物温育；b]制备a]的细胞的hcDIG；c]测定来自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
本发明上下文中的化合物将表示任意有机和/或含碳化合物，其通过化学合成产生或者从天然来源分离并且具有50到50000道尔顿的分子量。格列美脲活性的调节将表示该活性受到刺激，或者抑制或者保持，即保持活性在某一水平上。
在鉴定调节格列美脲活性的化合物的方法的步骤a]中的哺乳动物细胞将包括啮齿动物细胞，如大鼠或者小鼠的细胞，狗的细胞或者人的细胞。这种细胞可以是例如胰细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞或者脂肪细胞。还可以使用细胞培养物(例如，原代细胞培养物)的细胞。根据鉴定调节格列美脲活性的化合物的方法中的步骤c]的GPI-PLC的活性的测定可以通过测量pp59Lyn从hcDIG的解离，或者通过测量pp59Lyn和/或Gce1从hcDIG向IcDIG的重新分布，或者通过测量pp59Lyn和/或IRS1的磷酸化的改变，或者通过测量葡萄糖转运的刺激和/或脂解作用的抑制来实现。对于来自根据鉴定调节格列美脲活性的化合物的方法中的步骤c]的hcDIG的GPI-PLC的活性减小的情况，所鉴定的化合物失活或者减小格列美脲的活性。对于GPI-PLC的活性增强的情况，所鉴定的化合物刺激或者支持格列美脲的活性。
具有药学上可接受的阴离子的式I化合物的盐同样可以包括在本发明范围中作为产生或者纯化药学上可接受的盐的中间物和/或用于非治疗性的应用，例如，体外应用。
可以用本领域技术人员熟悉的常规方法制备式I化合物的盐。例如，通过将式I化合物与无机或者有机酸或者碱在溶剂或者稀释剂中化合可以制备盐。
此处所用的术语“生理学功能衍生物”涉及根据本发明的式I化合物的生理学上可接受的衍生物，例如，酯，其当施用于哺乳动物，如人时，能够(直接或者间接)形成式I化合物或者其活性代谢物。
生理学功能衍生物还包括根据本发明化合物的前体药物。此类前体药物可以在体内代谢成根据本发明的化合物。这些前体药物可以自身是有活性或无活性的。
根据本发明的化合物可以以多种多晶型形式存在，例如，作为无定形或者结晶的多晶型形式存在。根据本发明的化合物的所有多晶型形式包括在本发明的范围内并且是本发明的另一方面。
下面对“根据式I的化合物”的所有参考都表示如上述的一种/多种式I化合物，和它们的盐、溶剂合物和如本文描述的生理学功能衍生物。
为了实现所希望的生理学效果，根据式I化合物的必需的量取决于多种因素，例如，所选的特定化合物、计划的用途、施用方式和患者的临床状况。通常，日剂量为0.3mg到100mg(通常3mg到50mg)/天/千克体重，例如，3-10mg/kg/天。静脉内剂量可以为例如，0.3mg到1.0mg/kg，其可以适宜地作为10ng-100ng/千克体重/分钟注射液施用。用于这些目的的合适的输注溶液可以含有例如，每毫升0.1ng到10mg，通常1ng到10mg。单独剂量可以含有例如，1mg到10g活性化合物。从而，用于注射的安瓿剂可以含有例如，1mg到100mg，经口施用的单独的剂量剂型，例如片剂或者胶囊剂，可以含有例如，1.0到1000mg，通常10到600mg。对于药学上可接受的盐，上面提及的重量细节涉及来自该盐的二氢噻唑离子的重量。对于上述状况的预防或者治疗，根据式I的化合物可以自身用作化合物，但是它们优选与可耐受的赋形剂以药物组合物的形式存在。赋形剂当然必须是可耐受的，即它与组合物中的其他成分相容并且对患者的健康无害。赋形剂可以是固体或者液体或者两者并且优选与该化合物配制成单独剂量，例如，作为片剂，其可以含有按重量计0.05％到95％的活性化合物。还可以存在其他药学活性物质，包括根据式(I)的其他化合物。根据本发明的药物组合物可以通过一种已知的制药方法制备，该方法基本上包括将成分与药学上可接受的赋形剂和/或辅剂混合。
根据本发明的药物组合物为适于口服、直肠、局部、经口(例如，舌下)和肠胃外(例如，皮下、肌内、皮内或者静脉内)施用的那些药物组合物，然而每个个体情况中最合适的施用方式取决于所治疗的疾病的性质和严重性和用于每个病例的根据式(I)的化合物的性质。糖包衣的制剂和糖包衣的缓释制剂也包括在本发明的范围中。优选酸抗性和经肠制剂。适宜的肠包衣包括邻苯二甲酸醋酸纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和异丁烯酸和异丁烯酸甲酯的阴离子聚合物。
用于经口施用的适宜的药物化合物可以存在于单独的单位，如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或者片剂，其在每种情况中含有一定量的根据式(I)的化合物；作为粉剂或者颗粒；作为在水性或者非水性液体中的溶液剂或者混悬剂；或者作为水包油或者油包水乳剂。如已经提到的，可以通过任何适宜的制药方法制备这些组合物，所述方法包括其中将活性化合物和赋形剂(其可以由一种或多种额外成分组成)接触的步骤。通常，通过将活性化合物与液体和/或细分的固体赋形剂均匀并且同质地混合，之后如果需要，将产物成形，可以制备组合物。从而，例如，可以通过将化合物的粉剂或者粒剂与(如果合适)一种或多种额外成分压片或者成形可以制备片剂。可以在适宜的机器中，将自由流动形式的化合物，如粉剂或者颗粒(如果合适)与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或一种(多种)表面活性剂/分散剂混合后压片，可以制备压片的片剂。通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物成形可以制备成形的片剂。
适于经口(舌下)施用的药物组合物包括锭剂，其含有根据式I的化合物与调味剂、常规蔗糖和阿拉伯胶或者西黄蓍胶；和软锭剂，其包括惰性基质，如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶中的化合物。
用于肠胃外施用的适宜的药物组合物优选包括根据式I化合物的无菌水性制剂，其优选与预期的受者的血液等渗。这些制剂优选静脉内施用，然而也可以在皮下、肌内或者皮内作为注射剂进行施用。通过混合该化合物与水并使得所得溶液无菌并且与血液等渗，可以优选制备这些制剂。根据本发明的可注射的组合物通常含有按重量计0.1到5％活性化合物。
用于直肠施用的适宜的药物组合物优选作为单独的剂量栓剂存在。将根据式(I)的化合物与一种或多种常规固态赋形剂，例如，可可脂混合，并将所得混合物成形，可以制备这些组合物。
用于局部应用在皮肤的适宜的药物组合物优选作为软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、喷雾剂、气溶胶或者油存在。可以使用的赋形剂为矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、醇和两种或者多种这些物质的组合。活性化合物通常以按照组合物的重量计0.1到15％，例如，0.5到2％的浓度存在。
经皮施用也是可能的。用于经皮施用的适宜的药物组合物可以作为单独的贴剂存在，其适于与患者的表皮长期紧密接触。此类贴剂适宜地含有任选缓冲的水性溶液中、溶解和/或分散在粘合剂或者分散在聚合物中的活性化合物。适宜的活性化合物浓度为例如约1％到35％，优选约3％到15％。作为特定可能性，活性化合物可以由电转运或者离子电渗疗法释放，如Pharmaceutical Research，2(6)318(1986)中描述。
实施例材料和方法人重组胰岛素PIG41(公开在“Frick，W.等人，(1998)Biochemistry37，13421-13436”)和格列美脲(商品名Amaryl)由Aventis PharmaGermany(Frankfurt，Germany)的药物化学和合成部(medicinal chemistryand synthesis departments)提供。如Müller等人，(1997)Biochem.Biophys.Acta 134723-39中描述的合成12-((7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基)十二酸(NBD-FA)。胶原酶(Worthington，CLS，I型，250单位/mg)由Biochrom(Berlin，Germany)提供。来自牛奶的脂蛋白脂肪酶(LPL，亲和纯化的)、磷脂酶A2(蜜蜂毒液)、粗品猪胰脂肪酶(PL)、重组PC-和PI-PLC(蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus))、粗品PLD(卷心菜)和脱脂BSA(级分V)由Sigma/Aldrich(Deisenhofen，Germany)供应，粗品PI-PLC(大鼠肝脏)和蛋白酶抑制剂从Roche Molecular Biochemicals(Mannheim，Germany)购买。重组GPI-PLC(布鲁斯锥虫)从Oxford Glycosystems(Oxford，UK)得到。PLA2(AACOCF3)和PLC(U73122)的抑制剂来自Tocris(Avonmouth，UK)。Bisbodipy-C11-PC从Molecular Probes(Eugene，OR)购买。脂类从Avanti Polar Lipids(Birmingham，AL)购买。用于小窝蛋白-1的免疫沉淀的抗体(克隆C060)和小窝蛋白-1的的免疫印迹的抗体(兔)和pp59Lyn的免疫印迹的抗体(克隆32)来自Transduction Laboratories(Lexington，KY)。用于磷酸酪氨酸的的免疫印迹的抗体(克隆4G10)从Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)得到。用于IRS-1的免疫印迹的抗体(兔，亲和纯化的)(昆虫细胞中表达的抗总的人重组蛋白)、5’-Nuc(大鼠)和aP(牛)的免疫印迹的抗体由Biotrend(Cologne，Germany)制备。ECL Renaissance化学发光检测试剂盒从NEN/DuPont(Bad Homburg，Germany)得到。Sprague-Dawley大鼠由Charles-River Laboratories(UK)提供。
GPI-2350的合成(也参见图1中的草案)通过如“Zhai，H.-X.等人(1995)Tetrahedron Lett.367403-7406”中公开的方法制备原料外消旋1，4，5，6-四-O-苄基-肌醇(下文中化合物1)。然后在三乙胺和二甲基-氨基吡啶的存在下用十二烷基膦酰二氯磷酸化化合物1，得到四-O-苄基-肌醇-1，2-环-十二烷基膦酸(下文中化合物2)。通过用10％批钯木炭催化氢化，将化合物2脱苄基得到肌醇-1，2-环-十二烷基膦酸(下文中化合物3或者GPI-2350)，其为非对映体混合物。为了合成化合物2(图1)，将1g(1.8mmol)化合物1溶解在60ml二氯甲烷中，并加入1ml三乙胺、200mg二甲基-氨基吡啶和1g(10mmol)十二烷基膦酰二氯。让反应溶液静置(45分钟，室温下)。然后加入50ml乙酸乙酯并在硅胶上过滤混合物。浓缩溶剂后，通过急骤层析(正庚烷/乙酸乙酯，1/1，按体积计)纯化残渣。化合物2产率580mg(43％)白色无定形固体。TLC正庚烷/乙酸乙酯(1/1，按体积计)，Rf＝0.7.MS(M+Li)+＝761.4，计算的C60H59O7P，M＝754.9。为了合成化合物3(图1)，将505mg(0.67mmol)化合物2溶解在5ml乙酸乙酯和15ml甲醇的混合物中。加入700mg披钯(10％)木炭后，将反应混合物氢化(6h，1大气压H2)。将Pd在硅胶上过滤并用100ml甲醇洗涤。浓缩溶剂后，通过急骤层析(二氯甲烷/甲醇，5/1，按体积计)纯化残渣。化合物3的产率179mg(68％)白色无定形固体。TLC二氯甲烷/甲醇(5/1，按体积计)，Rf＝0.15.MS(M+Li)+＝401.2，计算的C18H35O7P，M＝394.4。化合物3在酸性溶剂比在碱性溶剂中的稳定性低。它在甲醇中稳定数天并且作为干燥的无定形固体在4℃稳定数年。
大鼠脂肪细胞的制备和温育通过消化从雄性大鼠(120-140g，随意喂养，见Ref.53)的附睾脂肪垫分离的脂肪细胞在含有1％(w/v)BSA的KRH(20mM Hepes/KOH，pH7.4，1.2mM KH2PO4，140mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mMMgSO4)中洗涤两次，然后在补充100μg/ml庆大霉素，100nM 1-甲基-2-苯基乙基腺苷，0.5U/ml腺苷脱氨酶，1mM丙酮酸钠和5mM D-葡萄糖，不存在或者存在GPI-2350(制备成DMSO中的10mM贮存液，体外和脂肪细胞温育中的最终DMSO在任意抑制剂浓度下保持恒定在0.5％)、胰岛素或者格列美脲(如“Müller等人(1994)J.Cell.Biol.1261267-1276”中描述的制备)的相同介质中，在37℃摇动水浴中，以5％CO2/95％O2不断冒泡的情况下温育所指示的时间，最终滴定度为每ml温育体积100μl收集细胞体积(通过将少量等分试样抽吸到毛细血球压积管中并在微量血细胞比容离心机中离心60秒以测定脂肪细胞在悬浮液中占据的分数来进行测定，10％ cytocrit对应于约1.5×106个细胞/ml)。
质膜和lc/hcDIG的制备从在裂解缓冲液(25mM吗啉代乙磺酸[MES]，pH6.0，140mM NaCl，2mM EDTA，0.5mM EGTA，0.25M蔗糖，50mM NaF，5mM焦磷酸钠，10mM甘油-3-磷酸，1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂)中用马达驱动的Teflon-in-glass匀浆器匀浆(10次冲程)预处理然后洗涤的脂肪细胞的核后infranatant制备质膜和DIG。将脱脂肪的核后infranatant差速离心，然后通过如前描述(48，53)的通过蔗糖和Percoll垫层上两次顺序离心纯化，最后以2mg蛋白质/ml悬浮在25mM Tris/HCl(pH7.4)，0.25M蔗糖，1mM EDTA上得到质膜。通过如“Müller，G.等人(2002)Mol.Med.8120-136”中报导的去污剂方法和不连续蔗糖梯度离心方法得到hc/IcDIG。在15-22％(级分4-5)和28-35％(级分8-9)蔗糖界面的光散射的乳白色带分别收集为hcDIG和lcDIG，用折射率测量密度。用25mM MES(pH6.5)，1％ Triton X-100，150mM NaCl将合并的梯度级分稀释3倍后通过离心(50,000xg，30min，4℃)收集hc/lcDIG，然后通过如“Müller，G.等人(2002)Mol.Med.8120-136”和/或“Müller，G.等人(2001)Mol.Cell.Biol.214553-4587”中描述的通过相关标记的富集/丧失进行表征(免疫印迹、酶测定法)，或者进行Triton X-114分配(见下文)。对于小窝蛋白的免疫沉淀，将DIG溶解(1h，4℃)在10mM Tris/HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1％ TritonX-100，60mM β-辛基葡糖苷，0.3％脱氧胆酸，5mM EDTA，0.5mMEGTA，1mM原钒酸钠，50mM NaF，1μM微囊藻素(microcystine)和蛋白质抑制剂)中并离心(50,000xg，30min)。为了直接免疫印迹，将DIG溶解在2倍Laemmli样品缓冲液中并离心(10,000xg，5min)。使用上清液。
GPI-PLC/D测定法根据“Hari等人(1997)Biochim.Biophys.Acta 1355293-302”等人的测定法，通过与100μl 200mM Tris/马来酸盐(pH7.0)中的10μl人胎盘aP溶液(10mM Hepes/NaOH，pH7.0，150mM NaCl中100U/ml)和1％Nonidet P-40在37℃温育10分钟，然后加入0.4ml冰预冷的终止缓冲液(10mM Hepes/NaOH，pH7.0，150mM NaCl，0.1mM MgCl2和0.01mM乙酸锌)来测定GPI-PLD(大鼠血清)。如“Mensa-Wilmot等人(1995)MethodsEnzymol.250641-655”中描述的，通过将50μl 50mM Tris/HCl(pH8.0)中的5μl人胎盘aP溶液(见上文)，0.25％ Nonidet P-40和5mM EDTA在37℃温育30分钟，随后加入0.45ml终止缓冲液结束反应来测定GPI-PLC(布鲁斯锥虫)。通过与100μl 20mM Hepes/KOH(pH7.8)，144mM NaCl，0.1％ TX-100，0.2mM MgCl2中的10μl牛红细胞乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液(10mM Tris/HCl，pH7.4，144mM NaCl，0.1％ TX-100中12U/ml)在25℃温育1小时并随后加入5μl冰乙酸，然后加入0.4ml 10mMTris/HCl(pH7.4)，144mM NaCl来测定PI-PLC(蜡状芽孢杆菌)和脂肪细胞GPI-PLC(5-25μg质膜或者hc/lcDIG)。每种反应混合物进行TX-114分配(见下文)。从在TX-114耗竭的相中测量的亲水aP或AChE的活性与分配前测量的总活性的比率，并对通过缺少(G)PI-PLC/D的空白温育揭示的TX-114耗竭的相中非酶背景(占总活性的10-20％)进行校正后，计算GPI-PLC/D活性。
其他脂肪酶测定法用如“Vertesy等人，(2002)Journal Antibiotics 55480-494”中描述的放射标记的油酸甘油酯小滴乳剂测量激素敏感的脂肪酶(HSL)和脂蛋白脂肪酶(LPL)。将2ml 5mM Tris/HCl(pH6.5)，6mM牛磺脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM CaCl2中的0.25mmol丁酸甘油酯与相同缓冲液中的猪PL和辅脂肪酶温育，使用pH调节到6.5的记录pH固定计(在25℃以1000转/分钟搅拌)测定胰脂肪酶(PL)。将0.2ml 10mM二棕榈酰卵磷脂，0.1ml10mM SDC和0.1ml 0.03M CaCl2与细菌PC-PLC(50mM Tris/HCl，pH7.5，0.1％ BSA中)在37℃温育10分钟测定PC-PLC。通过加入0.1ml 50％TCA并随后加入2.5ml氯仿/甲醇(66/33/1，按体积计)来终止反应。离心(1500xg，15min)后，除去上面的甲醇/水相(～1.33ml)的0.2ml部分，补加0.5ml 60％ HClO4，然后在170℃加热1小时并最后分析无机磷酸。通过在37℃温育0.1ml 10mM PI，0.1ml 0.8％去氧胆酸钠，0.1％ BSA，0.2ml100mM硼酸钠(pH7.5)和大鼠肝PI-PLC 20分钟来测量哺乳动物PI-PLC。终止反应并且如对PC-PLC描述的进一步处理。用250μl 40mMHepes/KOH(pH6.0)，4mM CaCl2和卷心菜PLD中的1.6mM[U-14C]磷脂酰胆碱(～2000-4000dpm/nmol)测定PLD。在37℃温育30分钟后，加入含有载体磷脂酸的5ml氯仿/甲醇(2/1，按体积计)终止反应。除去水溶性物质后，将最终洗涤的下面的氯仿相中含有的脂类转移到热活化的硅胶板中并用氯仿/甲醇/氨(65/35/4，按体积计)在第一维和氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/水(50/20/10/10/5，按体积计)在第二维进行二维分离。通过感光成像检测放射性磷脂酸。根据“Kim，T.-S.等人，(1997)J.Biol.Chem.2722542-2550”用由1-棕榈酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/bisbodipy-C11-PC/磷脂酰基-甘油/胆固醇(10/0.05/2/3，按体积计)组成的单层脂质体底物测定PLA2。用Marquardt-Levenberg非线性最小二乘法对浓度反应曲线进行拟合。当在对数线性轴上作图时，该方程得到S形曲线(SigmaPlot软件，JandelScientific)。
小窝蛋白的免疫沉淀将溶解的DIG(见上文，5-20μg蛋白质)通过与蛋白质A/G-Sepharose温育并随后离心(10,000xg，5min)预清除。上清液与1ml 10mM Tris/HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1％ TX-100中的预先吸附在蛋白质A/G-Sepharose上的抗-小窝蛋白-1抗体(1∶1000)在4℃温育1小时。将免疫复合体用相同缓冲液洗涤两次，然后用缺少TX-100的缓冲液洗涤两次，最后在无β-巯基乙醇的存在下进行SDS-PAGE。膜剥离后，用抗-小窝蛋白抗体对相同印迹进行同源免疫印迹(homologous immunoblotting)归一化免疫沉淀的小窝蛋白的回收。
免疫印迹用“Müller，G.等人，(2001)Mol.Cell.Biol.214553-4567”中描述的半干方法将SDS-PAGE分离的多肽转移到聚偏氟乙烯膜。经洗涤的膜用抗-小窝蛋白-1(1∶2000)、抗-pp59Lyn(1∶1250)、抗-aP(1∶500)、抗-5’-Nuc(1∶750)和抗-IRS-1(1∶2000)抗体在15℃温育4小时。洗涤的膜用辣根过氧化物酶-偶联的二级山羊抗-小鼠(1∶2000)或者山羊抗兔IgG(1∶4000)抗体温育。通过增强的化学发光显示标记的蛋白质。
TX-114分配根据“Bordier，C.，(1981)J.Biol，Chem.2722542-2550”，通过悬浮在1ml冰预冷的TX-114(1％)，25mM Tris/HCl(pH7.4)，144mM NaCl中或者与0.5ml冰预冷的TX-114(2％)混合，使用富含TX-114和耗竭TX-114的相之间的分配，将沉淀的hc/lcDIG(10-50μg蛋白质)或者(G)PI-PLC反应混合物(0.5ml)分离到两亲性或者亲水蛋白质中。在冰上温育1小时后，混合物在冰上的0.4ml 0.25M蔗糖和25mM Tris/HCl(pH7.4)的垫层上分层。通过升温到37℃并随后离心(10,000xg，1min)诱导相分离。提取下面的富含TX-114的相后，对合并的上面的TX-114-耗竭相的等分试样测量5’-Nuc、aP和AChE活性或者沉淀(15％聚乙二醇4000)后进行SDS-PAGE分析。
葡萄糖转运测定如“Müller，G.等人，(1994)J.Cell Biol.1261267-1276”中描述的通过将10,000-20,000个洗涤的脂肪细胞与50μl终浓度为50μM(0.33μCi/ml)的2-脱氧-D-[2，6-3H]葡萄糖在不存在或存在20μM细胞松弛素B的情况下在37℃温育20分钟来测定葡萄糖转运。
其他步骤如“Müller，G.等人，(2000)Mol.Cell.Biol.204708-4723”中描述的进行电穿孔。如＂Müller，G.等人，(2003)Biochimie 851245-1256＂描述的将脂解作用测定为甘油或者荧光NBD-FA从预标记的和异丙基肾上腺素刺激的脂肪细胞的释放。通过用8-N3-[32P]cAMP光标记溶解的质膜或者hc/lcDIG(10-50μg蛋白质)并随后如“Müller，G.等人，(1994)Biochemistry 3312149-12159”中描述的进行感光成像来检测Gce1。根据“Eliakim，R.等人，(1990)Biochim.Biophys.Acta 1355293-302”的方法测量5’-Nuc、aP和AChE活性。用来自Pierce(Rockford，IL)的BCA蛋白质测定试剂盒并用BSA作为校准标准测定蛋白质。用预制凝胶(Novex，SanDiego，CA；10％ Bis-Tris分离胶，吗啉代丙磺酸-SDS电泳缓冲液)进行SDS-PAGE。在LumiImager上用LumiImager软件(Roche Diagnostics)评估发光图像(Lumiimage)。用Storm 860 PhosphorImager系统(Molecular Dynamics，Gelsenkirchen，Germany)处理和定量磷光和荧光图像。用Adobe Photoshop软件(Adobe Systems，Mountain View，CA)产生图。
GPI-2350以高效力和选择性抑制多种来源的(G)PI-PLC/DGPI-2350对(纯化的或者粗品)蜡状芽孢杆菌PI-PLC、布鲁斯锥虫GPI-PLC和大鼠血清GPI-PLD的影响通过将它们与部分纯化的溶解的GPI蛋白质在适宜条件(低或者高去污剂浓度)下，在增加浓度的GPI-2350的存在下温育来监测。随后，通过分别测量TX-114分配时去污剂耗竭的相中的酶活性和分配前总消化混合物中的酶活性来确定消化混合物中含有脂解切割的GPI锚的亲水GPI蛋白质相对于总GPI-蛋白质的比(图2)。GPI-2350分别以10、2和1μM的表观IC50抑制细菌、锥虫和血清(G)PI-PLC/D。使用lcDIG或者hcDIG作为酶源溶解的质膜，AChE作为底物，GPI-2350也阻断大鼠脂肪细胞GPI-PLC，IC50为0.2-0.5μM。为了阐明脂肪细胞GPI-PLC的切割特异性，我们使用从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)球芽制备的GPI-蛋白质Gce1，其已经用[14C]-肌醇进行代谢标记。与hcDIG温育导致产生Gce1的亲水和14C-标记的形式，其用针对cIP产生的抗-CRD抗体以依赖浓度和时间的方式免疫沉淀(数据未显示)。缺少脂肪酰基链并且含有cIP的GPI-蛋白质的依赖hcDIG的产生证明了在大鼠脂肪细胞的质膜中GPI-PLC的表达。
接着，研究了GPI-2350的选择性。来自多种来源的一些中性脂肪酶(HSL、PL、LPL)和不同特异性的PC/PI-特异的磷脂酶(A2、C、D)以及牛AChE都已知通过所称作的催化三联体运转，它们在阻断细菌、锥虫、血清和大鼠脂肪细胞GPI-PLC/D 60到95％的条件(50μM)下没有受到显著影响(图3)。含有开放的而不是cIP的GPI-2350的两种衍生物2-脱氧-2-氟-鲨(scyllo)-肌醇-1-O-十二烷基-膦酸(GPI-1793)和肌醇-1-O-十二烷基膦酸甲酯(GPI-2349)在所测试的最高浓度下对脂肪细胞GPI-PLC仅有非常温和的影响，但是以相似的功效抑制细菌和锥虫(G)PI-PLC(表1)。这些发现证明在涉及稳定的或者瞬时1，2-环磷酸酯键的产生中催化机制的相似性，但是还证明了在细菌、锥虫和脂肪细胞(G)PI-PLC之间底物识别的一些差异。考虑到后者通过cIP中间物运行并且基于初步动力学研究，必须假定GPI-2350作为竞争性抑制剂(Ki＝3-20μM)。这可以解释它的显著选择性，因为中性脂肪酶和哺乳动物PC/PI-特异的磷脂酶不识别GPI结构。与竞争作用模式相一致，当用过量新鲜GPI蛋白质底物对反应混合物进行10倍稀释时，GPI-2350对细菌和锥虫(G)PI-PLC的半最大抑制完全逆转。相比，在再分离和充分洗涤前用50μM GPI-2350处理的脂肪细胞hcDIG在不存在GPI-2350的情况下温育时仅显示出对纯化的溶解的AChE的低脂解切割(数据未显示)。这可以通过两亲性GPI-2350与hcDIG的相互作用来解释。备选地，GPI-2350可以作为过渡态类似物并且经历与脂肪细胞GPI-PLC的活性位点的(瞬时)共价偶联。有趣的是知道GPI-2350的环状磷酸酯键是否被(G)PI-PLC/D打开。
GPI-2350阻断分离的DIG和完整脂肪细胞中GPI-蛋白质的胰岛素-和格列美脲-诱导的切割基于当都存在于单独复合体(分别是去污剂微团和DIG)中时，GPI-2350对脂肪细胞质膜GPI-PLC对GPI-蛋白质的体外切割的干扰，接下来用内源或者外源GPI-蛋白质作为底物，研究了GPI-2350对完整脂肪细胞和分离的DIG中基础的和受刺激的GPI-PLC活性的效力(图4)。在分离的大鼠脂肪细胞中，GPI-PLC活性(以内源5’-Nuc，Gce1和aP的切割通过检测它们的两亲性向亲水性转化来跟踪)受到格列美脲和胰岛素(分别高达5倍和3倍)的刺激(栏E、G)。在从这些预处理的脂肪细胞制备的hcDIG中刺激被部分保留(分别为3倍和1.7倍)(栏C)。显著地，从未处理的脂肪细胞制备的hcDIG与格列美脲的直接温育激活了GPI-PLC(高达4倍)，但是与胰岛素温育不能激活GPI-PLC(栏A)。GPI-2350以依赖浓度的方式将基础的以及格列美脲-和胰岛素-刺激的GPI-PLC活性减小到低于分离的hcDIG和完整脂肪细胞中的基础的且相似的水平(图4，所有栏)。显然，GPI-2350不干扰GPI-PLC的活化，因为该抑制剂在与胰岛素或者格列美脲温育前和温育期间存在(栏C，E)。当用完整脂肪细胞(5-10μM，栏F)测定时，GPI-PLC抑制的IC50与分离的完整hcDIG(1μM，栏B，D)以及溶解的hcDIG和质膜(0.2-0.5μM，图2)相比更高。这可以反映当包埋在完整脂肪细胞的质膜中的DIG内时与分离的DIG相比，GPI-PLC的催化位点对GPI-2350的可接近性减小。然而，GPI-2350的细胞通透性的需要(基于它的两亲性性质，预测该需要相当强烈)大概可以排除，因为GPI-PLC的主要底物、GPI脂和蛋白质锚都定位于质膜的外面小叶，并且GPI-2350可能作为GPI-PLC的催化位点的(竞争性)抑制剂(见上文)。相反地，可以想象GPI-2350通过其十二烷基链自发分配到脂肪细胞质膜的非DIG区(占总细胞表面的80-90％)，类似于去污剂优先分配到非-DIG区的无序结构域而不是DIG的脂类有序结构域。
在用于分离DIG和质膜的实验条件下，用DIG(即hcDIG加上lcDIG)回收了分离的总质膜中65-85％的GPI-PLC活性(测量为外源AChE的切割)，与脂肪细胞的处理无关。对于典型的DIG标记蛋白质小窝蛋白-1(70-90％)(如通过免疫印迹测定)和DIG停留蛋白(resident protein)p115(55-75％)(如通过合成PIG的结合测定)观察到了相似的回收。而且，用DIG(hcDIG加上lcDIG)从差别处理的脂肪细胞回收的aP、5’-Nuc和Gce1(两亲性加上亲水形式)的总量大致恒定(90-140％，基础值设置为100％)，表明DIG分离方法在多种条件下的可重复性。因为分离的hcDIG的特征是比lcDIG和非-DIG区显著更低的蛋白质含量，所以与残留质膜相比，hcDIG高度富含GPI-PLC，与GPI-蛋白质底物的定位相一致。
大鼠脂肪细胞中GPI-PLC作用是DIG内GPI-锚定的和酰化的信号蛋白的再分布所需的。
接下来研究了GPI-蛋白质的脂解切割是否影响脂肪细胞质膜的DIG内GPI-锚定的以及酰化的信号蛋白的定位和依赖刺激物的再分布。为此，从格列美脲刺激前不存在或存在GPI-2350时温育的脂肪细胞制备hc/kcDIG，然后分析几种GPI-锚定的或者酰化的信号蛋白的存在(图5)。存在最大有效浓度的GPI-2350时，pp59Lyn、Gce1和5’-Nuc从hcDIG向lcDIG的有效再分布几乎被完全消除，所述再分布如它们在lcDIG中的量增加3到5倍所证明，这对应于与基础脂肪细胞相比hcDIG中损失70-90％。相比，相对于lcDIG在hcDIG中hcDIG停留蛋白、小窝蛋白-1和IRβ的相对富集以及在hcDIG和lcDIG中葡萄糖转运蛋白同种型4(Glut4)的相似丰度都不受到格列美脲的影响，该相对富集和相似丰度在GPI-2350的存在下不显著改变(图5)。这表明GPI-PLC的有效抑制特异干扰某些脂类修饰的信号蛋白，如Gce1和pp59Lyn从hcDIG到lcDIG的依赖刺激的转移，而不是导致DIG结构中的一般性和非特异的改变。
接下来研究了在GPI-PLC作用和GPI蛋白质再分布之间推定的因果关系下的机理，即在受刺激的分离的大鼠脂肪细胞中，脂解切割和/或未切割的GPI-蛋白质是否实际上转移到lcDIG。为此，将大鼠脂肪细胞与或者不与GPI-2350温育，然后用胰岛素或者格列美脲刺激。通过TX-114分配测定从总质膜、hcDIG和lcDIG回收的GPI-蛋白质、5’-Nuc、aP和Gce1的亲水和两亲性形式的量(表2)。用胰岛素和更有效的格列美脲处理导致质膜中亲水GPI-蛋白质的增加，其受到GPI-2350的完全阻断，表明有效的GPI-PLC抑制。响应胰岛素和格列美脲，亲水性GPI-蛋白质的量的增加仅在hcDIG中检测到，并且伴随着相同位置处两亲性形式的减少。在GPI-2350的存在下，这些改变甚至逆转到低于基础值，表明该两亲性向亲水性转化的脂解性质。从而，在hcDIG处胰岛素/格列美脲刺激的GPI-PLC产生的亲水性GPI-蛋白质通过不依赖于GPI锚的分子机理保持与hcDIG结合(表2)。有趣的是，格列美脲诱导的5’-Nuc、Gce1和aP从hcDIG向lcDIG的再分布(见图5)局限于它们的未切割的形式，如在lcDIG回收的两亲性GPI-蛋白质中升高3到4倍水平，但是在用lcDIG回收的亲水性GPI-蛋白质中是未改变的低水平，但是仍然被GPI-2350完全消除所反映的(表2)。相比，亲水性5’-Nuc、Gce1和aP的胰岛素诱导的产生伴随着它们的两亲性负体(counterpart)在lcDIG中仅非常温和的增加(显著性边界)，其在GPI-2350的存在下再次被消除。所研究的所有三种GPI-蛋白质仅显示出刺激物依赖的脂解切割和它们的两亲性形式的再分布之间的相关性，仅存在微小的数量差异(表2)。总之，hcDIG中脂解切割的GPI-蛋白质的产生和积累需要GPI-PLC活化(格列美脲)。
GPI-PLC的抑制干扰GPI-锚定的且酰化的信号蛋白从小窝蛋白的解离最近已经证明大鼠脂肪细胞中信号蛋白从hcDIG到lcDIG的再分布伴随着它们从小窝蛋白-1的解离和活化。接着通过抑制GPI-PLC并随后分析了小窝蛋白-1与Gce1和pp59Lyn的相互作用以及后者的激酶活性，研究了大鼠脂肪细胞中从小窝蛋白的解离/活化和GPI蛋白质的依赖刺激物的脂解切割之间推定的因果关系(图6)。来自从分离且溶解的hcDIG制备的小窝蛋白-1免疫沉淀物的pp59Lyn和Gce1的胰岛素(35-45％)和格列美脲-(75-85％)诱导的最大损失被GPI-2350完全废除(50μM；图6，栏A)，IC50为5-10μM(栏B)。该效价类似于完整脂肪细胞中GPI-2350对GPI-PLC的抑制(图3)。小窝蛋白-1的支架结构域(SCD)与信号蛋白(如非受体酪氨酸激酶)的小窝蛋白结合结构域(CBD)的结合，和反过来，CSD与CBD结合的减弱已经在许多但不是所有情况中表明在体外测定中分别引发信号蛋白的失活和活化。这意味着在质膜DIG中进行的信号转导中CSD-CBD相互作用的调节功能。
大鼠脂肪细胞中GPI-PLC的抑制下调格列美脲但不下调胰岛素的代谢活性随后，研究了响应胰岛素和格列美脲，GPI-PLC抑制对IRS-1酪氨酸磷酸化的差别效果是否反映在它们在胰岛素靶细胞中的代谢活性中。为此，用任一种刺激物刺激前，将分离的大鼠脂肪细胞用GPI-2350预处理，然后测定葡萄糖转运和异丙基肾上腺素诱导的脂解(图8)。格列美脲对葡萄糖转运的刺激和异丙基肾上腺素诱导的脂解的抑制在GPI-2350存在下以依赖浓度的方式(IC50＝2-5μM)下降到低于对照值(50μM)。因此，格列美脲浓度反应曲线向右偏移并且GPI-2350对GPI-PLC的半最大抑制(5μM)过程中与不存在抑制剂时相比变得平坦。相比，葡萄糖转运的胰岛素刺激和异丙基肾上腺素诱导的脂解的抑制(与格列美脲相比高2-3倍)被仅50μM的GPI-2350分别降低达25％和33％(图8)。通过分析GPI-2350对格列美脲和胰岛素对异丙基肾上腺素诱导的脂解作用抑制的影响，证实了GPI-PLC抑制的这些差别效果，所述影响测量为NBD-FA而不是甘油从用该荧光脂肪酸衍生物预标记的大鼠脂肪细胞的释放(图9)。响应格列美脲浓度的增加，从异丙基肾上腺素诱导的脂肪细胞释放的NBD-FA(包括其氧化分解产物)的量的减少(IC50＝3μM)在50μM格列美脲的存在下被完全消除(栏A、B)。相比，NBD-FA(和降解产物)释放的胰岛素抑制仅受到GPI-2350(50μM)的损害达25-30％，伴随着胰岛素的表观IC50的微小增加(0.1对0.3μM)。大鼠肝脏PI-PLC和蜂毒PLA2的抑制剂不能显著影响基础的和格列美脲调节的葡萄糖转运和脂解作用，这证实了这些GPI-2350介导的效应对于GPI-PLC抑制的特异性(图8)。
最后，研究了GPI-PLC在胰岛素模拟刺激物而不是格列美脲的信号传递途径中的参与，这些信号途径依赖于或者独立于GPI-蛋白质在DIG中的再分布。在大鼠脂肪细胞中，用m-β-CD通过胆固醇耗竭对hcDIG的破坏、通过胰蛋白酶/盐/NEM处理对PIG受体p115的失活，或者用合成的配体PIG41对p115的占据，都导致lcDIG中Nuc的显著增加和葡萄糖转运活化(表3)。相比，原钒酸钠以及合成的CBDP刺激葡萄糖转运而不同时诱导5’-Nuc向lcDIG的转移。这与它们的作用方式、酪氨酸磷酸酶抑制剂钒酸盐对胰岛素受体和IRS-1脱磷酸的公知的抑制和CBDP对pp59Lyn和IRS-1酪氨酸磷酸化的直接刺激相一致。这些刺激物对IRS-1酪氨酸磷酸化和葡萄糖转运都不刺激(表3)在GPI-2350的存在下受到显著影响，意味着它们在GPI-PLC下游的一个点都串话到葡萄糖转运系统。
表格描述表1(G)PI-PLC抑制剂的特征。
表2胰岛素、格列美脲和GPI-2350对hcDIG、lcDIG和总质膜上脂解切割的和未切割的GPI-蛋白质的定位的影响。
表3GPI-2350对大鼠脂肪细胞中多种胰岛素模拟刺激物诱导的5’-Nuc转移和葡萄糖转运的影响。
表格说明表1来自大鼠脂肪细胞的hcDIG的GPI-PLC、来自布鲁斯锥虫的GPI-PLC和来自蜡状芽孢杆菌的PI-PLC与溶解的且部分纯化的牛红细胞AChE或者人胎盘aP在不存在或者存在增加浓度的(0.05μM-1mM)所示抑制剂的情况下在合适的条件下(见材料和方法)温育。从TX-114分配时用TX-114-耗竭的相回收的亲水AChE和aP活性计算切割率。给出了至少3次独立温育与一式四份的分配/酶测定得到的平均值+SD。n，a不适用。
表2分离的大鼠脂肪细胞不用或者用GPI-2350(50μM)处理(5分钟，37℃)，然后在所示的格列美脲(20μM)或胰岛素(10nM)的不存在或存在下温育(120分钟，37℃)。制备总的质膜(PM)、hcDIG和lcDIG然后进行TX-114分配。对TX-114-富集的和耗竭的相测定5’-Nuc和aP(活性测量)和Gce1(光亲和标记)。相对于从不存在GPI-2350下的基础脂肪细胞制备的总质膜和hcDIG中两亲性形式(每种设置为100任意单位)，计算两亲性和亲水GPI-蛋白质的量。亲水性和两亲性GPI-蛋白质从hcDIG和lcDIG的回收在多种温育条件下都是相当的。给出了至少3次独立细胞温育与每次一式两份的活性测量/凝胶运行的平均值±SD。
表3在甲基-β-环糊精(m-β-CD，10mM，50min)、CBDP(300μM，电穿孔，然后洗涤并随后温育30分钟)、PIG41(10μM，15min)、原钒酸钠(1mM，15min)、胰蛋白酶(10μg/ml，15min，接着用0.5M NaCl处理并随后洗涤)和N-乙基-马来酰亚胺(1mM，5min，然后加入DTT)的存在下温育分离的大鼠脂肪细胞。向半份脂肪细胞悬浮液加入GPI-2350(50μM终浓度)并进一步温育(60min，37℃)后，测定分离的IcDIG中部分细胞的5’-Nuc活性。在基础温育期间5’-Nuc的增加设置为100个任意单位。对其他部分的细胞(温育15分钟后)测定葡萄糖转运，其对于基础温育设置为100个任意单位。给出了至少3次独立细胞温育与每次一式三份的活性测量的平均值+SD。
表1
表2
表3
图1(G)PI-PLC抑制剂的结构和合成。见材料和方法。
图2GPI-2350的效力。从蜡状芽孢杆菌、大鼠血清和布鲁斯锥虫纯化的(G)PI-PLC/D以及从分离的大鼠脂肪细胞制备的总质膜(PM)和hc/lcDIG与增加浓度的GPI-2350温育(10min，30℃)，然后通过TX-114分配测定AChE和aP的两亲性向亲水性转化(见“材料和方法”)。脂解活性计算为不存在GPI-2350时对照反应(设置为100％)的％。给出了至少4次独立的温育与每次一式三份的AChE和aP活性测量的平均值+SD。
图3GPI-2350的选择性。根据典型的测定方案(见材料和方法)，在GPI-2350(50μM)不存在或者存在下，测定了多种(部分)纯化的或者重组的脂肪酶(如所指出的不同来源的HSL，激素敏感的脂肪酶；PL，胰脂肪酶；LPL，脂蛋白脂肪酶；PC-PLC，磷脂酰胆碱特异的磷脂酶C；PI-PLC，磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C；PLD，磷脂酶D；PLA2，磷脂酶A2；GPI-PLC，糖基磷脂酰肌醇特异的PLC/D和AChE(乙酰胆碱酯酶)以及从分离的大鼠脂肪细胞得到的总质膜(PM)和hc/lcDIG。给出了至少3次独立的温育与每次一式三份测量的平均值+SD。
图4GPI-2350对胰岛素/格列美脲诱导的GPI-PLC对GPI-蛋白质的切割的影响。栏A和BhcDIG从未处理的大鼠脂肪细胞制备然后不存在或者存在GPI-2350时温育(5min，37℃)(栏A，50μM；栏B，增加浓度)，然后不用或者用如所示的胰岛素(10nM)或者格列美脲(20μM)处理(120min，30℃)。栏C和D不存在或者存在如所示的胰岛素(10nM)或格列美脲(20μM)时温育分离的大鼠脂肪细胞(15min，37℃)。制备hcDIG并随后与GPI-2350温育(120min，30℃)(栏C，50μM；栏D，增加浓度)。栏E、F和G不存在或存在GPI-2350(栏E和G，50μM；栏F，增加浓度)时温育(5min，37℃)分离的大鼠脂肪细胞然后如所示的不用或用胰岛素(10nM)或格列美脲(20μM)处理(90min，37℃)。制备hcDIG。栏A-D用5’-Nuc作为外源性底物，测量hcDIG中GPI-PLC的活性，表示为它的亲水形式的转化。栏E-G用hcDIG的TX-114-耗竭相回收的蛋白质进行免疫印迹以检测亲水5’-Nuc和aP或者通过光亲和标记分析亲水Gce1。给出了3次独立的细胞温育与每次一式三份的活性测量和凝胶运行(显示了代表性的一份)的平均值+SE。
图5GPI-2350对DIG内信号蛋白的格列美脲诱导的重新分布的影响。分离的大鼠脂肪细胞不用或者用GPI-2350(50μM终浓度)处理(5min，37℃)，然后不存在或存在所示格列美脲(50μM)时温育(120min，37℃)。制备hcDIG和lcDIG并分别通过免疫印迹和光亲和标记测定pp59Lyn、5’-Nuc、小窝蛋白-1、胰岛素受体β亚基(IRβ)、葡萄糖转运蛋白4(Glut4)和Gce1的存在(见凝胶插图)。给出相对于不存在GPI-2350的对照反应(基础的)(设为100)，用hc/lcDIG回收的pp59Lyn、Gce1和5’-Nuc的量。给出至少3次独立细胞温育与一式两份的凝胶运行(显示的代表性的一份)的平均值+SD。
图6GPI-2350对格列美脲/胰岛素诱导的信号蛋白与小窝蛋白解离的影响。分离的大鼠脂肪细胞不用或者用GPI-2350处理(5min，37℃)(左栏，50μM；右栏，增加的浓度)，然后在不存在或者存在胰岛素(10nM)或格列美脲(20μM)时温育(120min，37℃)。从脂肪细胞制备hcDIG然后溶解。分别通过免疫印迹和光亲和标记测定从溶解的hcDIG制备的小窝蛋白-1免疫沉淀物中pp59Lyn和Gce1的存在。通过同源免疫印迹(homologousimmunoblotting)对免疫沉淀的小窝蛋白-1的回收进行校正后，给出相对于不存在GPI-2350时的对照反应(栏A，基础值设为100)或者胰岛素-或者格列美脲刺激的状态(栏B，设为100)，pp59Lyn和Gce1的量(见凝胶插图)。给出了至少4次独立的细胞温育与一式两份的凝胶运行(显示了代表性的一份)的平均值+SD。
图7GPI-2350对信号蛋白的格列美脲/胰岛素诱导的活化的影响。分离的大鼠脂肪细胞不用或者用GPI-2350(栏A，50μM；栏B，增加的浓度)处理(5min，37℃)，然后不存在或者存在胰岛素(10nM)或者格列美脲(20μM)时温育(120min，37℃)。分别从脱脂的核后infranatant(见材料和方法)和溶解的合并的hc/lcDIG免疫沉淀IRS-1和pp59Lyn，然后进行免疫印迹来检测磷酸酪氨酸。通过同源免疫印迹对免疫沉淀的IRS-1和pp59Lyn的回收进行校正后，给出相对于不存在GPI-2350时的对照反应(栏A，基础值设为100)或者胰岛素-或者格列美脲刺激的状态(栏B，每种情况下设为100)，酪氨酸磷酸化的IRS-1和pp59Lyn的量(见凝胶插图)。给出了至少4次独立的细胞温育与一式两份的凝胶运行(显示了代表性的一份)的平均值+SD。
图8GPI-2350对格列美脲/胰岛素诱导的代谢活性的影响。分离的大鼠脂肪细胞不用或者用GPI-2350(栏A，50μM；栏B，增加的浓度；栏C，5μM，50μM)处理(5min，37℃)，然后不存在或者存在胰岛素(Ins，10nM)或者格列美脲(Gli，20μM，或者增加的浓度)时温育(15min，37℃)。然后对脂肪细胞测定葡萄糖转运和异丙基肾上腺素诱导的脂解。给出相对于不存在GPI-2350时的对照反应(栏A，基础的)或者胰岛素-或者格列美脲刺激态(栏B和C，设为100)的活性。给出了至少5次独立的细胞温育与一式三份的活性测量的平均值+SD。
图9分离的大鼠脂肪细胞用0.5mM NBD-FA(60min，37℃)标记，洗涤，然后不存在(栏B，D)或者存在GPI-2350(50μM；栏A，C)时温育(5min，37℃)，然后用增加浓度的格列美脲(栏A，B)或者胰岛素(栏C，D)刺激。不用或者用如所示的异丙基肾上腺素(1μM)温育(120min，37℃)后，用氯仿/庚烷/甲醇/0.1N HCl(3/3/2/1，按体积计)提取总细胞悬浮液。通过薄层层析(二乙醚/石油醚/乙酸78/22/1，按体积计)分析有机相并用NBD-FA作为标记平行地进行荧光成像。显示了两次独立的标记和温育的典型实验，得到了相似结果。TAG，三酰基甘油。
图10GPI蛋白质在大鼠脂肪细胞质膜的非DIG区、hcDIG和lcDIG之间的重新分布机理，GPI蛋白质受到胰岛素、格列美脲和胆固醇耗竭的调节(涉及GPI-PLC和推定的GPI蛋白质受体p115)和它经过小窝蛋白、pp125Fak和pp59Lyn到IRS-1的与下游代谢信号的偶联的工作模型。经过GPI-PLC和p115的跨膜结构域(TM)在hcDIG的拓扑学、膜取向和锚定类型是假设的。然而，基于所证明的多数GPI-蛋白质的细胞表面位置，强烈表明活性位点和结合位点分别朝向DIG的细胞外小叶。小窝蛋白通过钩状TM和羧基末端的三倍棕榈酰化(triple paltimoylation)埋入hcDIG的细胞质小叶中，pp59Lyn是通过氨基末端的双倍酰化作用(dual acylation)埋入的。
权利要求
1.鉴定调节哺乳动物GPI-PLC活性的化合物的方法，其中a]将哺乳动物细胞与格列美脲温育；b]制备a]的细胞的hcDIG；c]将来自b]的hcDIG与化合物温育；d]测定来自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
2.如权利要求1中要求保护的方法，其中步骤a]的哺乳动物细胞是啮齿动物或者狗的细胞。
3.如权利要求2中要求保护的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或者大鼠。
4.如权利要求1中要求保护的方法，其中所述步骤a]的哺乳动物细胞是人的细胞。
5.如权利要求1到4之一中要求保护的方法，其中所述细胞是胰细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞或者脂肪细胞。
6.如权利要求1中要求保护的方法，其中所述哺乳动物细胞来自细胞培养物。
7.如权利要求1到6中要求保护的方法，其中通过测量pp59Lyn从hcDIG的解离测定GPI-PLC的活性。
8.如权利要求1到6中要求保护的方法，其中通过测量pp59Lyn和/或Gce1从hcDIG到IcDIG的重新分布测定GPI-PLC的活性。
9.如权利要求1到6中要求保护的方法，其中通过测量pp59Lyn和/或IRS-1的磷酸化的改变测定GPI-PLC的活性。
10.如权利要求1到6中要求保护的方法，其中通过测量葡萄糖转运的刺激和/或脂解作用的抑制测定GPI-PLC的活性。
11.处于所有立体异构形式的式I的化合物 其中R1、R2、R3和R4相互独立地为H或者OH或F并且R5为(C1-C20)-烷基或者(C2-C20)-烯基，和其所有比例的混合物，和它的生理学上可耐受的盐。
12.如权利要求11中要求保护的式I的化合物，其中R1、R2、R3和/或R4的任意两个相互独立地为F。
13.如权利要求11或12中要求保护的式I的化合物，其中R1、R2、R3和R4为OH。
14.如权利要求11、12或13中要求保护的式I的化合物，其中R5为C12-烷基。
15.如权利要求11、12、13或14中要求保护的化合物的制备方法，其包括a]磷酸化外消旋的1，4，5，6-四-O-苄基-肌醇得到四-O-苄基-肌醇-1，2-环十二烷基-膦酸，b]四-O-苄基-肌醇-1，2-环-十二烷基膦酸的催化氢化成各自化合物。
16.药物组合物，其包含如权利要求11到14的一项或多项要求保护的至少一种式I化合物和/或其生理学上可耐受的盐和/或前体药物和药学上可接受的载体。
17.如权利要求11到14的一项或多项要求保护的式I化合物和/或其生理学上可耐受的盐和/或其前体药物的用途，用于改变用于治疗糖尿病的药物的副作用。
18.如权利要求17要求保护的式I化合物的用途，其中所述药物是格列美脲。
19.如权利要求11到14的一项或多项要求保护的式I化合物用于生产药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗用于糖尿病治疗的药物的副作用。
20.如权利要求19要求保护的式I化合物的用途，其中所述药物是格列美脲。
21.鉴定调节格列美脲活性的化合物的方法，其中a]将哺乳动物细胞与格列美脲和化合物的混合物温育；b]制备a]的细胞的hcDIG；c]测定来自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
22.权利要求21中要求保护的方法，其中步骤a]的哺乳动物细胞是啮齿动物或者狗的细胞。
23.权利要求22中要求保护的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或者大鼠。
24.权利要求21中要求保护的方法，其中所述步骤a]的哺乳动物细胞是人的细胞。
25.权利要求21到24之一中要求保护的方法，其中所述细胞是胰细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞或者脂肪细胞。
26.权利要求21中要求保护的方法，其中所述哺乳动物细胞来自细胞培养物。
27.权利要求21到26中要求保护的方法，其中通过测量pp59Lyn从hcDIG的解离测定GPI-PLC的活性。
28.权利要求21到26中要求保护的方法，其中通过测量pp59Lyn和/或Gce1从hcDIG到IcDIG的重新分布测定GPI-PLC的活性。
29.权利要求21到26中要求保护的方法，其中通过测量pp59Lyn和/或IRS-1的磷酸化的改变测定GPI-PLC的活性。
30.权利要求21到26中要求保护的方法，其中通过测量葡萄糖转运的刺激和/或脂解作用的抑制测定GPI-PLC的活性。
31.如权利要求11到14之一要求保护的式I化合物的用途，用于鉴定跨越脂肪细胞的质膜的信号转导期间DIG中的信号蛋白。
32.如权利要求11到14之一要求保护的式I化合物的用途，用于鉴定和表征哺乳动物的GPI-PLC突变体和/或相关的信号因子。
全文摘要
本发明涉及鉴定调节哺乳动物GPI－PLC活性的化合物的方法，其中a]将哺乳动物细胞与格列美脲温育；b]制备a]的细胞的hcDIG；c]将来自b]的hcDIG与化合物温育；d]测定来自c]的hcDIG的GPI－PLC的活性。
文档编号C07F9/6571GK1981048SQ200580004356
公开日2007年6月13日 申请日期2005年2月16日 优先权日2004年2月20日
发明者G·米勒, W·弗里克, R·施奈德 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司