专利名称：一种产单磷酸类脂a的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产单磷酸类脂A的基因工程菌及其构建方法和应用，特别是一种无需诱导直接生产单磷酸类脂A的大肠杆菌。
背景技术：
疫苗佐剂可以非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。铝佐剂是目前全球公认的广泛应用于人体的疫苗佐剂，安全可靠，可显著增强体液免疫反应，但是对细胞免疫的效果不够理想。因此，人们致力于开发更加高效安全的疫苗佐剂。MPL是一种已应用于临床试验的脂质体佐剂，人类临床试验的不良反应频率与铝佐剂一样低，其炎症毒性是LPS的0.1%。除MPL外，单磷酸类脂A (MPLA)也被证明具有疫苗佐剂潜力。目前，MPLA的生产方法主要是从沙门氏菌中提取或者化学合成。现有生产方法的缺点在于 第一、沙门氏菌是致病菌，操作起来比较困难；第二、沙门氏菌能同时合成几种不同结构的类脂A，这给后续的分离纯化带来很多困难；第三、该方法涉及到化学处理，步骤繁多，影响产品质量和产量。本发明是构建了一株不依靠IPTG诱导的能生产MPLA的大肠杆菌基因工程菌。类脂A自细胞内膜内侧开始合成，合成途径比较保守，但在转运到外膜外侧的过程中可以发生多种修饰，以适应外界环境。目前，与类脂A结构修饰有关的基因已有报道。 利用这些基因，根据类脂A分子的合成及修饰机理，通过基因工程技术将大肠杆菌中类脂A 的结构改造成为MPLA。具体方法是在野生型大肠杆菌染色体上敲入表达IpxE基因。IpxE 来源于弗朗西斯菌，其编码的蛋白质可以水解类脂A分子1位上的磷酸。本研究室前期构建了一株能生产MPLA的大肠杆菌基因工程菌，生产过程中需要添加IPTG诱导(Jiuzhou Chen et al.2010)。该菌株开创了 MPLA生产的新方法，但是生产过程中需要添加IPTG诱导，生产成本较高，不利于大规模生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的产MPLA的基因工程菌，其生产过程中无需IPTG诱导，进一步降低生产成本，以适应大规模生产。为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E.coli W3110 AlacI laCZ::i^lpxE，其中IacI发生缺失突变失活，IacZ基因基因敲入表达i^nlpxE基因。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌生产单磷酸类脂A的方法。其中发酵方法为常规发酵方法，单磷酸类脂A的提取方法为将过夜培养的菌液按初始OD6tltl = 0. 02转接到200mL LB液体培养基中，37°C培养至OD6tltl = 1时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系 (氯仿/甲醇/水，1 2 0.8, ν/ν/ν)悬浮菌体，磁力搅拌lh，2000rpm离心20min分相， 使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入27mL 12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超声震荡 10min，100°C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2 2 1.8，^力，2000印111离心101^11，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液G l，v/v)将类脂A洗出。类脂A的检测、分析薄层层析(TLC)检测将样品点于Gel 60 TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水00 25 4 2，ν/ν/ν/ν)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10% 硫酸进行碳化，置于加热板上显色。ESI/MS分析类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液G 1，ν/ν)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。本发明提供的基因工程菌在保持类脂结构单一的基础上又降低了生产成本，且没有引入任何抗性标记，更有利于大规模工业化生产。
图1野生型大肠杆菌与基因工程菌类脂A TLC分析1 :W3110类脂A样品；2 突变株HW001类脂A样品图2基因工程菌类脂AESI/MS分析
具体实施例方式实施例1突变株E. coli W3110 Δ IacI的构建1、IacI基因敲除片段的获得采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得IacI基因敲除片段，其两端为IacI 基因上下游同源臂、中间为kan片段。IacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。将IacI基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK (+)，获得重组质粒pBlueScript II SK (+)-IacI(U)-pkan-lacl(D)。2、敲除感受态的制备及电转化接种带有Red 重组辅助质粒 pKD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-Step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97 (12) :6640-6645)的大肠杆菌 W3110 (ATCC39936)于含100μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C，200rpm过夜培养。按2%接种量转接IOOmL LB液体培养基，30°C，200rpm培养至OD600 = 0 . 2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为 30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至0D_ = 0. 5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的 50mL离心管中，4°C，SOOOrpm离心IOmin收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3次，最后用ImL 10%甘油悬浮，每管80 μ L分装至预冷的无菌EP管中。将500_1000ng IacI敲除片段加入感受态细胞中，混勻，冰浴15mm，1. 5kv电击 5mS，30°C孵育2h，涂布30 μ g/mL卡那霉素的LB固体平板，30°C培养，挑取转化子于含 30 μ g/mL卡那霉素及100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。3、温敏型表达载体pCRE的构建根据NCBI 数据库中 pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder Τ, Beinhauer J, Hegemann JH. A new efficient gene disruption cassette for repeated use inbudding yeast. Nucleic Acids Res，1996，24 :2519-2524)载体序列，采用化学全合成或 PCR方法获得ere基因克隆到pKD46质粒，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布100 μ g/ mL氨苄青霉素的LB固体平板，30°C过夜培养，挑取转化子提质粒酶切验证，得到Cre重组酶温敏型表达载体，并命名为PCRE。4、突变株抗性标记的去除将PCR验证阳性的菌株接种含30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42 °C过夜培养，将培养液划线30 μ g/mL卡那霉素的LB固体平板，37°C培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110 laCI::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入带有重组酶Cre的温敏型表达载体 pCRE，将阳性菌株于含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖 (终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导IoxP位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42°C热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为W3110 Δ IacI并保藏。实施例2突变菌株HW001的构建1、敲入片段!^nlpxE-Fkan的获得根据pWSI^9-FnlpxE-Fkan (Jiuzhou Chen et al. 2010)序列，人工合成或 PCR 扩增带有lacZ-a天然同源臂的敲入片段i^lpxE-Fkan，其核苷酸序列如SEQ IN NO. 2所示。 其中，kan基因两侧带有FRT位点。2、敲除感受态的制备及电转化以带有pKD46质粒的W3110 Δ IacI菌株作为出发菌株，制备感受态，方法同前。 将500-1000ngFnlpXE-Fkan敲入片段电转入感受态细胞中，通过kan抗性筛选获得染色体 IacZ 基因内部敲入表达 FnlpxE-Fkan 的突变株 W3110 Δ IacI IacZ :FnlpxE_Fkan。3、突变株抗性标记的去除ffl Λ pCP20 M Ι (Cherepanov PP, Wackernagel W. Gene disruption in Escherichia coli :TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene,1995,158(1) :9-14),42°C 热激表达FLP酶，介导FRT位点的特异性重组即可去除kan抗性标记，筛选方法同前，得到的突变株命名为HW001。实施例3突变菌株HW001的类脂A结构分析1、突变菌株HW001的类脂A提取及薄层层析(TLC)分析类脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始0D_ =0. 02转接到200mL LB液体培养基中，37°C培养至0D_ = 1时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系(氯仿/甲醇/水，1 2 0. 8， ν/ν/ν)悬浮菌体，磁力搅拌lh，2000rpm离心20min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2_3 次。加入27mL 12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超产震荡lOmin，100°C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相体系(氯仿/甲醇/水， 2:2: 1.8，v/v/v)，2000rpm离心lOmin，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/ 甲醇溶液G l,v/v)将类脂A洗出。接着进行薄层层析(TLC)检测，将样品点于Gel 60 TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水GO 25 4 2,v/v/v/v)0层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色(结果如图1)。TLC结果显示野生型大肠杆菌类脂A (泳道1)结构比较单一，为双磷酸形式，而突变株HW001的类脂A (泳道2)结构为单磷酸形式，证明突变菌株在不需要IPTG诱导的前提下可以产生MPLA。2、类脂A结构的ESI/MS分析类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液G 1，ν/ν)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于 m/z 2500。突变株HW001的类脂A结构为单磷酸形式，m/z值为1717. 5 (图2)，而野生型大肠杆菌类脂A结构为双磷酸形式，m/z值为1797.5。从中可以看出，突变株HW001在不需要 IPTG诱导的有大肠杆菌基因工程菌相比，本发明构建的菌株在保持类脂结构单一的基础上又降低了生产成本，更有利于大规模工业化生产。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种产单磷酸类脂A的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为.coli W3110 AlacIlacZ: JnlpxE，其中IacI发生缺失突变失活，IacZ基因敲入表达!^nlpxE基因。
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)将人工构建的IacI敲除片段转化E.coli W3110，获得突变株E. coli W3110 Δ IacI，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；2)i^lpxE-Fkan片段电转入步骤1)制备的Ε.coli W3110 △ IacI感受态细胞中，获得 E. coliff3110 Δ IacI IacZ JnlpxE-Fkan，再次通过位点的特异性重组敲除其中的卡那霉素抗性基因。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)所述的位点特异性重组为Cre酶介导的 IoxP位点特异性重组。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于步骤幻所述的位点特异性重组为FLP酶介导的 FRT位点特异性重组。
5.权利要求1所述基因工程菌应用于单磷酸类脂A的生产。
全文摘要
本发明公开了一种产单磷酸类脂A的基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。所述基因工程菌为E.coli W3110 ΔlacI lacZ:: FnlpxE，其中lacI发生缺失突变失活，lacZ基因敲入表达FnlpxE基因。本发明构建的菌株在保持类脂结构单一的基础上又降低了生产成本，其没有引入任何外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。
文档编号C12P7/64GK102399736SQ201110316939
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者李烨, 王小元, 陈久洲, 韩雅宁 申请人:江南大学