专利名称：磷脂酸磷酸酶基因及其利用的制作方法
磷脂酸磷酸酶基因及其利用技术区域本发明涉及新型磷脂酸磷酸酶基因及其利用。
背景技术：
包含2个以上不饱和键的脂肪酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA polyunsaturated),已知有花生四 烯酸、二高Y亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。该多不饱和脂肪酸中包含在动物体内无法合成的多不饱和脂肪酸，对于此种多不饱和脂肪酸，作为必需脂肪酸需要从食物中摄取。多不饱和脂肪酸分布广泛，例如花生四烯酸可从由动物的肾上腺、肝脏中提取的脂质中分离。但是，动物脏器中所包含的多不饱和脂肪酸为少量，仅从动物脏器中提取或分离多不饱和脂肪酸，不足以进行大量供给。因此，不断在开发培养各种微生物以获得多不饱和脂肪酸的方法。其中，被孢霉属(Mortierella)微生物作为生产包含花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的脂质的微生物而广为人知。此外，还进行了在植物中生产多不饱和脂肪酸的尝试。已知多不饱和脂肪酸构成三酰甘油(也称为甘油三酯、TG)等的贮藏脂质，在微生物的菌体内或植物种子中积累。作为贮藏脂质的三酰甘油在生物体内如下生成。通过甘油-3-磷酸酰基转移酶向甘油-3-磷酸转移酰基而生成溶血磷脂酸，通过溶血磷脂酸酰基转移酶向溶血磷脂酸转移酰基而生成磷脂酸，磷脂酸通过磷脂酸磷酸酶脱磷酸化而生成二酰甘油，通过二酰甘油酰基转移酶向二酰甘油中转移酰基而生成三酰甘油。在上述途径中，磷脂酸(phosphatidic acid,以下有时也记为“PA”。此外，也有时记为1，2_ 二酰基-sn-甘油-3-磷酸。)在为三酰甘油的前体的同时，还为二酰基型甘油磷脂的生物合成的前体。在酵母等中，由PA和胞嘧啶核苷5’-3磷酸(CTP)通过磷脂酸胞苷酰转移酶合成CDP 二酰甘油(CDP-DG)，生物合成各种磷脂。如上所述，已知将PA脱磷酸化而生物合成二酰甘油(diacylglycerol,以下有时也记为“DG”。)的反应由磷脂酸磷酸酶(E. C. 3. I. 3. 4、phosphatidic acid phosphatase,以下也记为“PAP”。)催化。已知该PAP存在于从细菌到脊椎动物的所有的生物中。已知在作为真菌类的酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中，有2种类型的PAP (非专利文献1、2、7)。一个类型为Mg2+依赖性的PAP(PAPl)，另一类型为Mg2+非依赖性的PAP(PAP2)。作为编码PAPl的基因，已知有PAHl基因(非专利文献3_5)，由于pah I Δ突变株具有PAPl活性，所以，认为还有其他承担PAPl活性的基因。已知在pahl Δ突变株中，核膜、ER的膜异常扩张，进而成为磷脂生物合成的关键的基因表达异常增高(非专利文献6)。另一方面，作为编码PAP2的基因，已知有DPPl基因和L PPl基因，这些基因基本承担了酵母的PAP2活性。已知这些基因所编码的酶的底物特异性广泛，作用于二酰甘油焦憐酸酯(DGPP)、溶血憐脂酸、sphingoid base phosphate、isoprenoid phosphate等而进行脱磷酸化。已知在作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)中，有作为Mg2+非依赖性的PAP2同源物MaPAPl基因(专利文献I)。已知在其他的菌类中，存在认为是编码PAPl家族酶、PAP2家族酶的基因同源物，但功能还不为人所知。现有技术文献专利文献专利文献I国际公开公报第W02009/008466号公报非专利文献
非专利文献I Biochem. Biophys. Acta, 1348,45-55,1997非专利文献2 Trends Biochem Sci.，31 (12)，694-699，2006非专利文献3 EMBO J.，24，1931-1941，2005，非专利文献4 J. Biol. Chem. ,281 (14), 9210-9218, 2006非专利文献5 J. Biol. Chem.，281 (45)，34537-34548，2006非专利文献6 J. Biol. Chem.，282 (51) ,37026-37035，2007非专利文献7 J. Biol. Chem.，284 (5)，2593-2597，2009
发明内容
已报道的PAP基因在通过导入宿主细胞使其表达时可使该宿主所产生的脂肪酸组合物的脂肪酸组成发生改变，但至今为止对此进行研究的例子非常少。希望鉴定出通过导入宿主细胞内或使其表达而可制造目标脂肪酸组成的油脂、或使目标脂肪酸含量增加的新型基因。本发明的目的在于提供通过在宿主细胞内表达或导入而可制造目标脂肪酸组成的油脂、或使目标脂肪酸含量增加的蛋白质及核酸。本发明者为解决上述课题而进行了深入研究。首先，分析脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的基因组,从中提取与已知的Mg2+依赖性磷脂酸磷酸酶(PAPl)基因具有同源性的序列。进而为获得编码PAP的开放阅读框(ORF)的全长，通过cDNA文库的筛选或通过PCR克隆全长cDNA。发现将该基因导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞，通过经过克隆的cDNA编码的蛋白质具有磷脂酸磷酸酶活性，而且，通过导入该cDNA，可提高酵母中作为贮藏脂质的三酰甘油的生产量。由此，成功地克隆了与新型磷脂酸磷酸酶(PAP)有关的基因，从而完成了本发明。即本发明如下。(I) 一种核酸，其特征在于，包含以下(a) (g)中任一项所述的核酸(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的喊基序列；(f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；(g)核酸,其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有70%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。(2)根据⑴中所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (g)中的任一项(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸,其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有90%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；(f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的喊基序列；(g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。(3) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (d)中任一项所述的核酸(a)核酸，其包含序列号I或序列号6表示的碱基序列或其部分序列；(b)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列；(C)核酸，其包含序列号4或序列号9表示的碱基序列或其部分序列；(d)核酸，其包含序列号5或序列号10表示的碱基序列或其部分序列。(4) 一种核酸，其特征在于，包含以下(a) (g)中任一项所述的核酸(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的喊基序列；(c)核酸,其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有70%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(d) 核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的喊基序列；(e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的外显子的碱基序列；(g)核酸,其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有70%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的外显子的喊基序列。(5)根据(4)中所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (g)中的任一项(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸,其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有90%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的喊基序列；(e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列；(f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2 X SSC,500C的条件下杂交，且包含具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的外显子的碱基序列；(g)核酸,其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有90%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的外显子的喊基序列。(6) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质
(a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性；(b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。(7) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质(a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性；
(b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。(8) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质(a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性；(b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性。(9) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质(a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列所组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性；(b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性。(10) 一种蛋白质，其特征在于，由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成。(11) 一种重组载体，其特征在于，包含(I) (5)中任一项所述的核酸。(12) 一种转化体，其特征在于，通过(11)中所述的重组载体转化。(13) 一种脂肪酸或包含脂质的脂肪酸组合物，其特征在于，培养(12)中所述的转化体而得到。(14) 一种脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养(12)中所述的转化体而得到的培养物中提取脂肪酸或脂质。(15) 一种食品，其特征在于，包含(13)中所述的脂肪酸组合物。本发明的PAP可以在导入该PAP的细胞中实现提高脂肪酸、贮藏脂质的生产能力的目的。因此，作为使微生物、植物中的多不饱和脂肪酸的生产率提高的酶而优选。此外，与未导入PAP的宿主产生的脂肪酸组合物相比，可期待本发明的PAP在宿主中产生组成不同的脂肪酸组合物。由此可提供具有所希望的特性、效果的脂质，所以，作为可适用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的酶而有用。
图1-1为来自M. alpina 1S-4株的MaPAHl. I的基因组序列(序列号5)和ORF (序列号I)的比较图。图1-2为图1-1的延续。图1-3为图1-2的延续。图1-4为图1-3的延续。图2-1为来自M. alpina IS-4株的MaPAHl. 2的基因组序列(序列号10)和ORF (序列号6)的比较图。图2-2为图2-1的延续。图2-3为图2-2的延续。图2-4为图2-3的延续。 图3-1为表示来自M. alpina 1S-4株的MaPAHl. I的cDNA(序列号4)及由此导出的推定氨基酸序列(序列号2)的图。图3-2为图3-1的延续。图3-3为图3-2的延续。图4-1为表示来自M. alpina 1S-4株的MaPAHl. 2的cDNA(序列号9)及由此导出的推定氨基酸序列(序列号7)的图。图4-2为图4-1的延续。图5-1为来自M. alpina 1S_4株的MaPAHl. I的推定氨基酸序列(序列号2)及来自相同M. alpina 1S-4株的MaPAHl. 2的推定氨基酸序列(序列号7)、和作为PAPl家族的磷脂酸磷酸酶的来自酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的ScPAHl蛋白质(序列号19)及来自小鼠的Lipin的氨基酸序列(序列号20)的比较图。PAPl家族的磷脂酸磷酸酶的N末端部分十分保守，称为IipinN末端保守区(pfam04571)。在MaPAHl. I及MaPAHl. 2中，N末端的部分十分保守。已知该图中的*印的甘氨酸残基(相当于序列号2的80位的氨基酸、序列号7的80位的氨基酸)是PAP活性所必需的。双下线部(相当于序列号2的819-823位的氨基酸、序列号7的737-741位的氨基酸)为类似卤酸脱卤酶(HAD)的结构域中的DXDX (T/V)基序。MaPAHl. I及MaPAHl. 2中该基序也为保守，其前后的序列也为保守。图5-2为图5-1的延续。图6-1为来自M. alpina 1S_4株的MaPAHl. I的CDS (编码序列)序列(序列号3)及来自相同M. alpina IS_4株的MaPAHl. 2的⑶S序列(序列号8)的比较图。图6-2为图6-1的延续。图6-3为图6-2的延续。图7为来自M. alpina 1S_4株的MaPAHl. I的推定氨基酸序列(序列号2)及来自相同M. alpina 1S-4株的MaPAHl. 2的推定氨基酸序列(序列号7)的比较图。
具体实施例方式本发明涉及来自被孢霉属(Mortierella)的新型磷脂酸磷酸酶基因，其特征在于，使磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油。本发明的磷脂酸磷酸酶为催化使磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油的反应的酶。本发明的PAP的底物通常为磷脂酸，但不限于此。
编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸本发明的磷脂酸磷酸酶(PAP)中包含MaPAHl. I及MaPAHl. 2。将编码MaPAHl. I及MaPAHl. 2的cDNA、⑶S、ORF及推定氨基酸序列的对应关系整理记入以下表I中。表I
MaPAHl. IMaPAHL 2
序列号I相当于序列序列号I相气r序列号9 号4的区域的区域
cDMA 序列号4 轉序列号9 林**傘 CDS 序列号3 第I- 3985位序列号8 第72- 3791位 ORF 序列号I 第I-3982位序列号6 第72- 3788位
氨基酸序列序列号2 *****序列号7 *****作为与本发明的MaPAHl. I相关的序列，可列举作为MaPAHl. I的氨基酸序列的序列号2、作为表不MaPAHl. I的ORF区域的序列的序列号I、且还有作为表不其⑶S区域的序列的序列号3及作为其cDNA的碱基序列的序列号4。其中，序列号3相当于序列号4的第I-第3985位的碱基序列，序列号I相当于序列号4的第I-第3982位的碱基序列及序列号3的第I-第3982位的碱基序列。此外，作为编码本发明的MaPAHl. I的基因组碱基序列，可列举序列号5。序列号5的基因组序列由11个外显子和10个内含子组成，外显子区域为序列号5的第I 182位、第370 584位、第690 1435位、第1536 1856位、第1946 2192位、第2292 第2403位、第2490 第2763位、第2847 第3077位、第3166 第3555位、第3648 3862位、第3981 第5034位。作为与本发明的MaPAHl. 2相关的序列，可列举作为MaPAHl. 2的氨基酸序列的序列号7、作为表示MaPAHl. 2的ORF区域的序列的序列号6、且还有作为表示其CDS区域的序列的序列号8及作为其cDNA的碱基序列的序列号9。其中，序列号8相当于序列号9的第72-第3791位的碱基序列，序列号6相当于序列号9的第72-第3788位的碱基序列及序列号8的第I-第3717位的碱基序列。且作为编码本发明的MaPAHl. 2的基因组碱基序列，可列举序列号10。序列号10的基因组序列由8个外显子和7个内含子组成，外显子区域为序列号10的第I 第454位、第674 第1006位、第1145 第1390位、第1479 第1583位、第1662 第1804位、第1905 第2143位、第2243 第3409位、第3520 第4552 位。本发明的核酸除单链及双链DNA以外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制作。DNA中例如可列举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及其组合物、DNA和RNA的杂交体等，但不限于此。作为本发明的核酸的优选方式，可列举(a)包含序列号I或序列号6表不的碱基序列的核酸，(b)包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸，(C)包含序列号4或序列号9表示的碱基序列的核酸或(d)包含序列号5或序列号10表示的碱基序列的核酸等。为了获得上述碱基序列，也可从具有PAP活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与已知具有PAP活性的蛋白质有同源性的蛋白质的碱基序列。作为具有PAP活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可列举高山被孢霉(M. alpina)，但并不限于此。进行EST分析时，首先构建cDNA文库。对于cDNA文库的构建方法，可参考“Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed. ” (Cold Spring HarborPress (2001))。且也可用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可列举以下方法。即将作为脂质生产菌的高山被孢霉(M. alpina)的适合菌株接种到适合的培养基中，预培养适当时间。作为适合该预培养的培养条件，例如作为培养基组成，可列举I. 8%葡萄糖、I %酵母膏、pH6. 0，培养时间为3 4天，培养温度为28°C的条件。然后将预培养物在适当的条件下进行本培养。作为适合本培养的培养基组成，例如可 列举 I. 8%葡萄糖、I %大豆粉、0. I %橄榄油、0. 01% AdecanoUO. 3% ΚΗ2Ρ04、0· I % Na2SO4,0. 05% CaCl2 · 2Η20、0. 05% MgCl2 · 6Η20、ρΗ6. O。作为适合本培养的培养条件，例如可列举300rpm、lvvm、26°C下通气搅拌培养8天的条件。培养期间可添加适量的葡萄糖。在本培养中适时采集培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从得到的总RNA中纯化poly (A)+RNA。而且还可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列使用按照可确定载体上插入部分的碱基序列的方式设计的引物进行确定，可得到EST。例如用ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)构建 cDNA 文库时，可进行定向克隆。分析基因组DNA时，培养具有PAP活性的生物的细胞，从该细胞中制备基因组DNA。确定所得到的基因组DNA的喊基序列，将确定的喊基序列进行拼接。从最终得到的超级重叠群(supercontig)的序列中，搜索编码与已知具有PAP活性的蛋白质的氨基酸序列有高同源性的氨基酸序列的序列。作为编码此种氨基酸序列的序列，从匹配的超级重叠群的序列中制备引物，以上述cDNA文库为模板进行PCR，将所得到的DNA片段整合到质粒中进行克隆。以经过克隆的质粒为模板，通过使用上述引物进行PCR来制备探针。使用制备的探针筛选cDNA文库。将本发明的MaPAHl. I及MaPAHl. 2的推定氨基酸序列相对于在GenBank注册的氨基酸序列，使用BLASTp程序进行同源性搜索。这些氨基酸序列均与来自新生隐球菌新生变种(Cryptococcus neoformans var. neoformans) JEC21 的 Nuclear elongation anddeformation protein I推定蛋白质(AAW42851)以最高分匹配，同一性分别为25. 9%及26.6%。此外,真菌类的PAPl同源物中,进行了功能分析的来自酿酒酵母(S. cerevisiae)的PAHl (本说明书中，有时也标记为酵母的PAHl或ScPAHl)蛋白质的氨基酸序列和本发明的MaPAHl. I及MaPAHl. 2的推定氨基酸序列的同一性分别为22. 7%及22. 5%。本发明还包括与包含上述序列号I或序列号6表示的碱基序列(有时也记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列(有时也记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。“具有同等功能”是指，本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有磷脂酸磷酸酶(PAP)活性。且“具有同等功能”还包括在使本发明的碱基序列编码的蛋白质或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质在酵母的PAHl缺陷型株中表达时，使该缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性。本发明的蛋白质的PAP活性以及使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性可以是Mg2+依赖性，也可以是Mg2+非依赖性。优选本发明的蛋白质的所述活性为Mg2+依赖性。作为与此种本发明的核酸具有同等功能的核酸，可列举包含以下(a) (g)中任一项所述的碱基序列的核酸。且在以下列举的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”意指上述的“使PAP活性及/或使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性”。(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋 白质的碱基序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列含有如下碱基序列，编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质。具体地说，为如下碱基序列，编码由以下氨基酸序列组成的蛋白质且具有本发明的上述活性的蛋白质，氨基酸序列为(i)序列号2或序列号7所示的氨基酸序列中I个或多个(优选为I个或数个(例如I 400个、I 200个、I 130个、I 100个、I 75个、I 50个、I 30个、I 25个、I 20个、I 15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个))氨基酸发生缺失
的氨基酸序列，(ii)序列号2或序列号7所示的氨基酸序列中I个或多个(优选为I个或数个(例如I 400个、I 200个、I 130个、I 100个、I 75个、I 50个、I 30个、I 25个、I 20个、I 15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个))氨基酸用其
他氨基酸取代的氨基酸序列，(iii)序列号2或序列号7所示的氨基酸序列中附加I个或多个(优选为I个或数个(例如I 400个、I 200个、I 130个、I 100个、I 75个、I 50个、I 30个、I 25个、I 20个、I 15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个))其他氨
基酸的氨基酸序列或(iv)组合上述⑴ (iii)的氨基酸序列。上述中，取代优选为保守性取代。保守性取代是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原来序列的结构相关的特征，可为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原来序列中存在的螺旋结构，或不破坏赋予原来序列特征的其他种类的二级结构，可为任何取代。保守性取代通常可用生物学体系合成、化学肽合成来导入，但优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可包含非天然的氨基酸残基，也可包含肽模仿物、氨基酸序列中未被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。以下，将氨基酸残基按可取代的残基分类举例，但可取代的氨基酸残基不限于以下记载的残基
A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸及2，3-二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸；G组苯丙氨酸及酪氨酸。
为保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)(Kyte 等，J. Mol. Biol.，157 :105-131 (1982))。此外，为非保守性取代可根据亲水性进行氨基酸的取代。另外，在保守性取代及非保守性取代的任一种中，期望相当于序列号2或序列号7中第80位的氨基酸的氨基酸残基为甘氨酸。此外，期望相当于序列号2的第819-第823位的氨基酸或序列号7的第737-第741位的氨基酸的部分为DXDX (T/V) (X为任意氨基酸)。本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩写，均根据IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature、或例如 Immunology—A Synthesis (第 2 版，E. S. Golub 及D. R. Gren 监修,Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts (1991))等中记载的本领域惯用的缩写。此外，氨基酸有光学异构体时，在无特别说明的情况下，均表示L体。D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α - 二取代氨基酸等的非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非惯用氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。且本说明书中使用的蛋白质的标记法，根据标准用法及本领域中常用的标记法，左方向为氨基末端方向，右方向为羧基末端方向。同样，在通常情况下不特别提及时，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方向为5’方向。只要是本领域技术人员，使用本领域中公知的技术，即可设计、制备本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如，通过将认为对本发明蛋白质的生物学活性并不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而使其结构改变的蛋白质分子中适当的区域。且也可鉴定在类似的蛋白质间保守的分子的残基及区域。进而，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏生物学活性且不对蛋白质的多肽结构产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。特别是在本发明的MaPAHl. I及MaPAHl. 2的氨基酸序列中，Mg2+依赖型磷脂酸磷酸酶(PAPl)家族酶中被称为 IipinN 末端保守区(lipin,N-terminal conserved region ；pfam04571)的N末端部分100个氨基酸左右的氨基酸序列为比较保守。此外，在本发明的MaPAHl. I及MaPAHl. 2的氨基酸序列中，存在作为类似卤酸脱卤酶的蛋白质超家族酶的保守基序“DXDX(T/V)催化位点基序”。图5中用双下线表示的DIDGT序列(分别为序列号2的第819 第823残基、及序列号7的第737 第741残基)相当于上述的基序。本发明的突变体保留了上述保守基序，且只要不损害本发明的上述活性，也可为任何突变体。另夕卜，还存在如下报道，酵母的PAPl中该保守基序部分发生突变时，PAP活性消失(J.Biol.Chem. ,282(51) :37026_37035，(2007))。只要是本领域技术人员，均可鉴定对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽类似的肽残基，比较此2种肽的氨基酸残基，预测出与本发明蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基，即可进行所谓的结构-功能研究。而且，通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，可选择保持了本发明蛋白质的生物学活性的突变体。且如果是本领域技术人员，即可对本蛋白质突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。进而从所得到的分析结果来看，也可预测与蛋白质的三维结构有关的氨基酸残基的比对。预测为蛋白质表面上存在的氨基酸残基具有参与和其它分子的重要的相互作用的可能性，因此，如果是本领域技术人员，即可基于上述分析结果，制备不使预测为在此种蛋白质表面上存在的氨基酸残基发生改变的突变体。而且，只要是本领域技术人员，均可制备构成本发明蛋白质的各个氨基酸残基中，只有一个氨基酸残基发生取代的突变体。通过公知的检测方法筛选此种突变体，即可收集各个突变体的信息。由此，通过对以下情况进行比较，即某种特定氨基酸残基发生取代的突变体的生物学活性与本发明蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现出此种生物学活性时或产生抑制本蛋白质生物学活性的不适当活性时，可评价构成本发明蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，即可根据此种从日常实验中收集的信·息，单独或与其他突变组合，从而容易地分析作为本发明蛋白质的突变体的不期望的氨基酸取代。如上所述，由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，可通过《Molecular Cloning, ALaboratory Manual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001) )、〈〈Current Protocolsin Molecular Biology》(John Wiley & Sons(1987-1997)> Kunkel(1985)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82 :488_92、Kunkel (1988)Method. EnzymoI. 85 :2763_6)等中记载的定点诱变法等方法制备。发生了此种氨基酸的缺失、取代或附加等突变的突变体的制备，例如可通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知手法，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒、例如 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司制)、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等TAKARA BIO公司制)等进行。且作为在蛋白质的氨基酸序列中，既保持了其活性同时又引入I个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，可列举为除上述定点诱变以外，还可利用用诱变剂处理基因的方法、及使基因选择性断裂将选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。本发明的核酸中包含的碱基序列，优选为编码由序列号2或序列号7所示的氨基酸序列中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有PAP活性的蛋白质的喊基序列。此外，本发明的核酸中包含的碱基序列中，还包含优选为编码由序列号2或序列号7中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质的喊基序列。本发明蛋白质中的氨基酸突变或修饰的数量、或突变或修饰的位点，只要保持PAP活性或使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性，并无限制。本发明的PAP活性、或使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性可使用公知的方法测定。例如，可参照以下文献J. Biol. Chem.，273，14331-14338(1998)。例如，本发明的“PAP活性”也可如下测定。破碎使本发明的PAP表达的转化细胞，离心分离其细胞破碎液并回收上清，制成粗酶液。也可将粗酶液进一步纯化为本发明的PAP。且将包含本发明的PAP的粗酶液或纯化后的本发明的PAP添加在作为反应液的O. 5mM磷脂酸、IOmM 2-巯基乙醇、50mM Tris-HCl (pH7. 5)中，25 28°C下反应适当时间，添加氯仿甲醇使反应终止后进行脂质提取，将所得到的脂质通过薄层色谱法等进行分离，对可生成的二酰甘油量进行定量。此外，本发明的“使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性”例如也可如下测定。在酿酒酵母(S. cerevisiae)中，阻断ScPAHl基因,得到酵母的PAHl缺陷型株。将酵母的PAHl缺陷型株作为宿主，使用包含编码本发明的PAP的核酸的载 体进行转化。培养上述转化株后，通过将培养液离心分离回收菌体，水洗后冷冻干燥。在干燥菌体中加入氯仿甲醇，用玻璃珠破坏菌体，用溶剂提取脂质。将提取的脂质通过薄层色谱法等分离，测定生成的DG及/或TG的量。将用不含编码本发明的PAP的核酸的载体转化的酵母的PAHl缺陷型株作为对照进行比较。在使用包含编码本发明的PAP的核酸的载体转化酵母的PAHl缺陷型株时，生成的DG及/或TG的量提高的情况下，该PAP判断为具有“使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性”。(b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列含有如下碱基序列，与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段制备探针，使用此探针通过菌落杂交法、曬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法,可从cDNA文库及基因组文库等中获得。对于杂交法的详细步骤，可参照《MolecularCloning, A Laboratory Manual 3rded.》(Cold Spring Harbor Press (2001);特别是 Section 6-7)、《Current Protocolsin Molecular Biology》(John Wiley & Sons (1987-1997);特别是 Section6. 3-6. 4)、〈〈DNA Cloning I Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed. )) (OxfordUniversity (1995);杂交条件特别参照 Section2. 10)等。杂交条件的强度主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明书中“严谨条件”包括中度或高度严谨条件。具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件，可列举IXSSC 6XSSC、42°C 55°C的条件，更优选为1XSSC 3XSSC、45°C 50°C的条件，最优选为2XSSC、50°C的条件。杂交溶液中例如包含约50 %甲酰胺时，采用比上述温度低5至15°C的温度。作为洗涤条件，可列举0. 5X SSC 6XSSC、40°C 60°C。在杂交及洗涤时，通常可加入0. 05%
0.2% SDS、优选为约 0. 1% SDS0
作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如杂交条件，可列举O. I X SSC 2 X SSC、55°C 65°C的条件，更优选为O. I X SSC 1父55(、601 651的条件，最优选为0.2\55(、631的条件。作为洗涤条件，可列举O. 2XSSC 2XSSC、50°C 68°C，更优选为O. 2XSSC,60 65°C。特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可列举在5XSSC、1 % SDS、50mMTris-HCl (pH7. 5)及50%甲酰胺中在42°C的条件下进行预杂交后，添加探针，在42°C保温过夜形成杂交体，然后在O. 2XSSC、0. 1% SDS中在65°C下进行3次20分钟的洗涤的条件，但并不限于此条件。此外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体地说，可列举为使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)、ECL direct labeling &detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。作为本发明中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，优选与由序列号I或序列 号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质。(c)核酸,其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有70%以上同一'丨生的碱基序列所组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列含有如下碱基序列，由与序列号I或序列号6所示的碱基序列有至少70%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。可列举优选为包含与序列号I或序列号6所示的碱基序列有至少75%以上、进一步优选为80%以上(例如为85%以上，更优选为90%以上，进一步为95%、98%或99%以上)同一性的碱基序列的核酸，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。2个碱基序列的同一性％可通过视觉检查、数学计算来确定，但优选使用计算机程序、通过比较2组核酸的序列信息来确定。作为序列比较计算机程序，例如可利用美国国立医学图书馆网站http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/blast/bl2seq/bls. html 的 BLASTN 程序(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 403-10) :2· 2. 7 版或 WU-BLAST2. O 算法等。关于WU-BLAST2. O的标准默认参数的设定,可使用以下网站http://blast. wustl. edu中所记载的内容。(d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸编码的蛋白质，只要与具有本发明的上述活性的蛋白质有同等功能，也可以是与MaPAHl. I或MaPAHl. 2的氨基酸序列有同一性的蛋白质。具体地说，可列举与序列号2或序列号7所示的氨基酸序列有75%以上、优选为80%以上、更优选为85%、进一步优选为90% (例如95%、进一步为98% )以上同一性的
氨基酸序列等。本发明的核酸中所包含的碱基序列，优选为编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。2段氨基酸序列的同一性的百分率可通过视觉检查、数学计算确定。此外，也可使用计算机程序来确定同一性百分率。作为此种计算机程序，例如可列举为BLAST、FASTA (Altschul 等、J. Mol. Biol. ,215 403-410 (1990)),及 Clustalff 等。特别是通过BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(NucI. Acids. Res. ,25,p. 3389-3402，1997)做了记载，可从美国生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得(BLAST 指南、Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul等)。且可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver. 7 (GENETYX)、DINASIS Pro (日立软件)、Vector NTI (Infomax)等的程序来确定。使多个氨基酸序列并列的特定的比对图也可显示序列中特定的短的区域的匹配，所以，即使使用的序列的全长序列间无显著相关时，也可在此种区域中检测出特定的序列同一性非常高的区域。且BLAST算法可使用BL0SUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数可使用如下所示的内容(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段(由Wootton及Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)确定；也希望参照 Wootton 及 Federhen, 1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis of compositionallybiased regions in sequence databases)Methods Enzymol. 266 :544_71)、或由短周期性的内部重复组成的片段(由 Claverie 及 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU程序确定))用于屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序列的一致性的统计学上的显著性阈值、或根据E-score (Karlin及Altschul, 1990)的统计学模型,仅由偶然发现的一致性的期望概率；源于某种一致性的统计学的显著差异比E-score阈值大时，不报告此一致性。(e)核酸，其包含与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的喊基序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列包含与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交的条件如上所述。作为本发明的核酸中所包含的碱基序列，可列举与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。(f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子的碱基序列。由序列号5及序列号10组成的碱基序列分别为编码本发明的MaPAHl. I及MaPAHl. 2的基因组DNA序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列含有如下碱基序列，与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子。上述碱基序列可如下获得，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段制备探针，使用此探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，从基因组文库等中获得。杂交的条件如上所述。(g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子的碱基序列。本发明的核酸中所包含的碱基序列含有如下碱基序列，与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有至少70%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。可列举如下喊基序列，含有优选与序列号5或序列号10所的喊基序列有至少75%以上、进一步优选为80%以上(例如、85%以上，更优选为90%以上，进一步 为95%、98%或99%以上)同一性的碱基序列，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子。2个碱基序列的同一性％可如上所述确定。此外，序列号5的基因组DNA序列由11个外显子和10个内含子组成，外显子区域为序列号5的第I 第182位、第370 第584位、第690 第1435位、第1536 第1856位、第1946 第2192位、第2292 第2403位、第2490 第2763位、第2847 第3077位、第3166 第3555位、第3648 3862位、第3981 第5034位。且序列号10的基因组DNA序列由8个外显子和7个内含子组成，外显子区域为序列号10的第I 第454位、第674 第1006位、第1145 第1390位、第1479 第1583位、第1662 第1804位、第1905 第2143位、第2243 第3409位、第3520 第4552位。在其他方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，含有在序列号5或序列号10所示的基因组DNA序列中，内含子区域的碱基序列与序列号5或序列号10所示的序列为100%同一，且外显子区域的碱基序列与序列号5或序列号10所示的序列有至少70 %以上，优选为75%以上，进一步优选为80%以上(例如85 %以上，更优选为90%以上，进一步为95%以上、98%以上、99%以上)同一性的碱基序列，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子。此外，在其他方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，含有在序列号5或序列号10所示的基因组DNA序列中，外显子区域的碱基序列与序列号5或序列号10所不的序列为100%同一,且内含子区域的碱基序列与序列号5或序列号10所不的序列有至少70 %以上，优选为75 %以上，进一步优选为80%以上(例如85 %以上，更优选为90%以上，进一步为95%以上、98%以上、99%以上)同一性的碱基序列，且可通过剪接脱离内含子区域，由此连接外显子区域并编码具有本发明的上述活性的蛋白质。进而在其他方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，含有在序列号5或序列号10所示的基因组DNA序列中，内含子区域的碱基序列与序列号5或序列号10所示的序列有至少70%以上，优选为75%以上，进一步优选为80%以上(例如85%以上，更优选为90%以上，进一步为95%以上、98%以上、99%以上)同一性的碱基序列，且外显子区域的碱基序列与序列号5或序列号10所示的序列有至少70%以上，优选为75%以上，进一步优选为80%以上(例如85%以上，更优选为90%以上，进一步为95%以上、98%以上、99%以上)同一性的碱基序列，且可通过剪接脱离内含子区域，由此连接的外显子区域编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
2个碱基序列的同一性％可通过上述的方法确定。而且本发明的核酸中还含有如下核酸，包含由序列号I或序列号6组成的碱基序列中I或多个的碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列所组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。具体地说，也可使用如下核酸，其包含(i)序列号I或序列号6所示的碱基序列中I个或多个(优选为I个或数个(例如I 1200个、I 1000个、I 750个、I 500个、I 400个、I 300个、I 250个、I 200个、I 150个、I 100个、I 50个、I 30个、I 25个、I 20个、I 15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个))碱基发生缺失的碱基序列，(ii)序列号I或序列号6所示的碱基序列中I个或多个(优选为I个或数个(例如I 1200个、I 1000个、I 750个、I 500个、I 400个、I 300个、I 250个、I 200个、I 150个、I 100个、I 50个、I 30个、I 25个、I 20个、I 15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个))碱基用其他碱基取代的碱基序列，··
(iii)序列号I或序列号6所示的碱基序列中附加I个或多个(优选为I个或数个(例如I 1200个、I 1000个、I 750个、I 500个、I 400个、I 300个、I 250个、I 200个、I 150个、I 100个、I 50个、I 30个、I 25个、I 20个、I 15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个))其他碱基的碱基序列，或(iv)组合了上述(i) (iii)的碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。作为本发明的核酸的优选方式，还为含有包含以下(a) (d)中任一项所述的碱基序列的片段的核酸(a)序列号I或序列号6表示的碱基序列，(b)编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(C)序列号4或序列号9表示的碱基序列，(d)序列号5或序列号10表示的碱基序列。有关(a)序列号I或序列号6表示的碱基序列、(b)编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号4或序列号9表示的碱基序列，如表I中所记载。且有关序列号5或序列号10表不的喊基序列如上所述。上述序列的片段包含上述碱基序列中所包含的ORFXDS、具有生物学活性的区域、作为如下记载的引物而使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制备。此外，本发明的核酸中也含有以下核酸。(I) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (g)中任一项所述的核酸。(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列。(b)核酸，其为与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸。(c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有70%以上同一性的喊基序列所组成的编码蛋白质的喊基序列。(d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列。
(e)核酸，其为与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸。(f)核酸，其为与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸。(g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有70%以上同一性的喊基序列所组成且编码蛋白质的喊基序列。(2)根据⑴中所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (g)中的任一项。(a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列。(b)核酸，其为与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交的核酸。 (c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成的碱基序列。(d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列。(e)核酸，其为与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交的核酸。(f)核酸，其为与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交的核酸。(g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成的碱基序列。本发明的磷脂酸磷酸酶蛋白质本发明的蛋白质，包含由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质及与所述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可来自天然，也可人工制备。对于由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，指如上述“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”一项中说明的具有“本发明的上述活性”的蛋白质。在本发明中，作为与由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可列举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质(a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性，(b)蛋白质，其是由与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70 %以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性。上述中，对于序列号2或序列号7中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列、或与由序列号2组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，如上述“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”一项中的说明。且上述“具有本发明的上述活性的蛋白质”包含如下蛋白质其为由包含序列号I或序列号6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、或序列号2或序列号7所示的氨基酸序列中通过I个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等的多种修饰而产生突变的蛋白质、或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且为具有使PAP活性及/或酵母的PAHl缺陷型株中的磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性的蛋白质。另外，本发明的蛋白质也可人工制备，此时可通过Fmoc法(9_芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。也可利用Advanced Che m Tech公司制、拍金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia 公司制、Pr otein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。且本发明的蛋白质中还包含以下蛋白质。(I) (a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成。(b)蛋白质，其由与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列所组成。·(2) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质。(a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I 200个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成。(b)蛋白质，其由与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成。本发明的核酸的克隆本发明的PAP的核酸，例如可通过使用适合的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。且可使用适合的引物通过PCR反应扩增，通过与适合的载体连接来进行克隆。并且也可亚克隆到其他载体中。例如也可使用pBlue-Script SK (+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp (TM Gibco-BRL)、p_Direct (Clontech)、pCR2. I-TOPO (Invi trogene)等市售的质粒载体。且通过PCR反应扩增时，引物可使用上述序列号4等所示的碱基序列的任何部分，例如可分别使用上游侧用引物NotI-PAHl-I-F :5’-GCGGCCGCATGCAGTCCGTGGGAAG-3’ (序列号 15)、下游侧用引物MaPAHl-I-IOR:5’-TTCTTGAGTAGCTGCTGTTGTTCG_3’(序列号 16)等。而后，在从高山被孢霉(M. alpina)菌体中制备的cDNA中，使上述引物及DNA聚合酶等作用而进行 PCR 反应。上述方法根据《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring Harbor Press (2001))等,只要是本领域技术人员均可容易地进行,作为本发明的PCR反应条件，例如可列举为以下条件变性温度90 95 °C退火温度40 60 °C延伸温度60 75 °C循环数10次以上所得到的PCR产物的纯化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN (Funakoshi)、QIAquick PCR purification Kits (QIAGEN)、ExoSAP-IT (GE Healthc areBio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，可进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶切出，通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick Gel extractio n Kits (QIAGEN)、Freeze&Squeeze 法等纯化。克隆后的核酸的碱基序列，可使用碱基序列测序仪来确定。PAP表达用载体构建及转化体的制备本发明还提供包含编码本发明的PAP的核酸的重组载体。本发明还进一步提供由上述重组载体转化的转化体。此种重组载体及转化体可如下获得。即将具有编码本发明的PAP的核酸的质粒用限制性内切酶酶切。使用的限制性内切酶，例如可列举为EcoRI、KpnI、BamHI及Sail等，但不限于此。且也可通过T4聚合酶处理将末端平滑化。将酶切后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将该DNA片段通过使用公知的方法整合到表达用载体中，可得到PAP表达用载体。将此表达载体导入宿主制备转化体，用于目的蛋白质的表达。
此时，表达载体及宿主只要可表达目的蛋白质，无特别限定，例如作为宿主，可列举真菌、细菌、植物、动物或它们的细胞等。作为真菌，可列举作为脂质生产菌的高山被孢霉(M. alpina)等的丝状菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母等。且作为细菌，可列举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)等。且植物可列举菜籽、大豆、棉花、红花、亚麻等的油料作物。作为脂质生产菌，例如可以使用在MYC0TAX0N，Vol.XLIV，No. 2，pp. 257-265(1992)中记载的菌株，具体地说可以列举属于被孢霉属(Mortierella)的微生物、例如长孢被抱霉(Mortierella elongata) IF08570、微小被抱霉(Mortierella exigua) IF08571、喜湿被抱霉(Mortierella hygrophila) IF05941、高山被抱霉(Mortierella alpina)IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219. 35、CBS224. 37、CBS250. 53、CBS343. 66、CBS527. 72、CBS528. 72、CBS529. 72、CBS608. 70、CBS754. 68 等被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物、或深黄被抱霉(Mortierella isabellina)CBS194. 28、IF06336、IF07824、IF07873、IF07874、IF08286、IF08308、IF07884、矮被孢霉(Mortierellanana) IF08190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana) IF05426、IF08186、CBS112. 08、CBS212. 72、IF07825、IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236. 82等Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被抱霉(Mortierella alpina)。以真菌类为宿主使用时，优选本发明的核酸在宿主中可自主复制、或者是可插入该菌的染色体上的结构，与此同时，优选是包含启动子、终止子的组成。使用高山被孢霉(M. alpina)作为宿主时,作为表达载体,例如可列举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要可在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4. I基因启动子、GAPDH(甘油醒3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF翻译延伸因子(Translation elongation factor)基因启动子的来自高山被孢霉(M. alpina)的启动子。作为向高山被孢霉(M. alpina)等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可列举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法及向核内DNA直接显微注射法等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养素的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化株。此外，转化使用抗药性标记基因时，在包含其药剂的选择培养基上培养，可得到具有抗药性的细胞菌落。以酵母为宿主使用时，作为表达载体，例如可列举pYE22m等。且也可使用P YES (Invitrogen)、pESC (STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。另外，作为适用于本发明的宿主可列举 Saccharomyces cerevisiae EH13-15 株(trpl, ΜΑΤ α )等，但不限于此。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gall启动子、gal 10启动子等来自酵母等的启动子。向酵母内导入重组载体的方法，例如可列举醋酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或多数)的包裹、及向核内直接显微注射DNA等。以大肠杆菌等的细菌为宿主使用时，作为表达载体，例如可列举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、Iac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。本发明的脂肪酸组合物的制造方法
本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即培养上述转化体，从获得的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。脂肪酸组合物是包含I种或I种以上的脂肪酸的集合体的组合物。在此，脂肪酸可以是遊离脂肪酸，也可以作为包含甘油三酯、磷脂等脂肪酸的脂质而存在。本发明的脂肪酸组合物具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来说，并不限于该方法，可采用通常公知的其他方法进行。用于培养使PAP表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，包含各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如转化酵母使PAP表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，以SC-Trp培养基为例每IL中，无氨基酸酵母氣源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFCO)为 6. 7g、葡萄糖为 20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐I. 25g、精氨酸0. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0. 6g、亮氨酸I. 8g、赖氨酸0. 9g、蛋氨酸0. 6g、苯丙氨酸I. 5g、丝氨酸11. 25g、酪氨酸0. 9g、缴氨酸4. 5g、苏氨酸6g、尿喃唳0. 6g的混合物)为I. 3g。培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的条件，具体可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(I段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即2段培养或3段培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。作为宿主使用酵母进行2段培养时，本发明的脂肪酸组合物的制造方法可如下进行。作为预培养，将转化体的菌落接种到上述的SC-Trp培养基等中，30°C下振荡培养2天。其后，作为本培养，在YPD5 (2%酵母膏、I %多聚蛋白胨、5%葡萄糖)培养基IOml中添加预培养液500μ 1，30°C下振荡培养2天。本发明的脂肪酸组合物本发明还提供在本发明的PAP已表达的细胞中的I种或I种以上作为脂肪酸的集合体的脂肪酸组合物。优选为培养本发明的PAP已表达的转化体而得到的脂肪酸组合物。脂肪酸可以是遊离脂肪酸，也可以以包含甘油三酯、磷脂等脂肪酸的脂质的形态存在。作为本发明脂肪酸组合物中包含的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可列举肉豆蘧酸(myristic acid)(十四烧酸)(14:0)、肉豆蘧油酸(myristoleicacid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1 (9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18:1 (11))、亚油酸(顺式，顺式_9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、Y-亚麻酸(6，9，12_十八碳三烯酸)(18:3 (6，9，12))、亚麻油酸(6，9，12，15-十八碳四烯酸酸)(18:4 (6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2 (8，11))、Mead 酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，11))、二高 Y-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3 (8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20:4 (5，8，11，14))、二十碳四烯酸(8，11，14，17- 二十碳四烯酸)(20:4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山嵛酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7,10，13，16))、(7，10，13，16，19- 二十二碳五烯酸)(22:5(7,10，13，16，19))、(4,7,10，13，16- 二十二碳五烯酸)(22:5(4, 7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四碳单烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了组织名及表示碳原子数量和双键位置的数值)。·
本发明的脂肪酸组合物只要是为上述脂肪酸中I种或I种以上的脂肪酸的组合，也可为由任何数量任何种类的脂肪酸组成的组合物。包含本发明的脂肪酸组合物的食品等此外，本发明还进一步提供包含上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物，根据常用方法，例如可用于包含油脂的食品、工业原料(化妆品、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料)的制造等用途中。作为化妆品(组合物)或医药(组合物)的剂型，可列举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可列举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半消化状态营养食品以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。进而，作为本发明的食品的例子，可以列举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方奶、早产儿用配方奶、老人用食品等，但不限于此。在本说明书中，食品是固体、流体、液体以及它们的混合物，是可摄取食用的物质的总称。营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥机体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品同义。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品。老人用食品是指处理成比未处理食品易消化和吸收的食品。婴儿用配方奶是指供给约I岁以下的儿童用的配方奶。早产儿用配方奶是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方奶。作为这些食品，可以列举肉、鱼、坚果等天然食品(用油脂处理过的食品)、中国菜、拉面、汤等在制作时加入油脂的食品、天妇罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、甜甜圈、花林糖等用油脂作为热介质的食品、黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工时添加了油脂的加工食品、(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于包含油脂的食品，例如还可以是面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产品、清酒、药酒、甜料酒、食醋、酱油、黄酱等发酵食品、酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品、鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品、果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质的菌株的评价·选择方法本发明还提供使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质进行脂质生产菌的评价和选择的方法。具体如下所示(I)评价方法作为本发明的一个实施方式，可列举使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质，进行脂质生产菌评价的方法。作为本发明的上述评价方法，首先可列举使用基于本发明的碱基序列设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行 评价的方法。此种评价方法的通常方法为公知，例如在国际专利申请W001/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等任何公知的方法[例如参照Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pl30(1990)]o基于本发明的碱基序列、优选基于序列号I或序列号6设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明碱基序列的任意部分，且其设计可使用公知方法进行。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15 25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300 2000碱基为宜。使用上述制备的引物或探针，检测上述被测菌株的基因组中是否存在本发明碱基序列的特异性序列。本发明碱基序列的特异性序列的检测可采用公知方法进行。例如，将包含本发明碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者包含上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，作为另一个引物使用包含该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸、或包含上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可测定扩增产物的有无、扩增产物分子量的大小等。适合本发明方法的PCR法的反应条件无特别限定，例如可列举以下条件，变性温度90 95°C退火温度40 60 °C延伸温度60 75 O循环数10次以上等的条件。将获得的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是包含相当于本发明碱基序列的特异性区域的核酸分子的大小，可预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。而且通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，还可进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。另外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。且作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号I或序列号6等本发明的碱基序列编码的PAP的表达量，也可评价被测菌株的本发明的上述活性。且PAP的表达量，可通过在适当条件下培养被测菌株，对PAP的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons 1994-2003)。(2)选择方法作为本发明的其他方式，可列举使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质进行脂质生产菌选择的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号I或序列号6等本发明的碱基序列编码的PAP的表达量，选择目的表达量的菌株，可选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株 ，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可选择出所期望的菌株。具体地说，例如可在适当的条件下培养标准菌株及被测菌株，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比被测菌株为高表达或低表达的被测菌株，来选择具有期望活性的菌株。对于所期望的活性，如上所述，可列举测定PAP的表达量及PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。且作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可选择出具有期望活性的被测菌株。对于所期望的活性，如上所述，可列举测定PAP的表达量及PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸表达受到抑制的菌株、进行诱变处理的菌株、自发突变的菌株等，但并不限于此。且本发明的上述活性，例如可通过本说明书中的“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”一项中记载的方法进行测定。作为诱变处理，例如可列举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、P67-75、学会出版中心等(日语原名大嶋泰治編著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p. 67-75、学会出版一))，但不限于此。此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可列举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体地说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用I种或I种以上的菌株。实施例以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。实施例I M. alpina的基因组分析将M.alpina 1S-4株接种到IOOml的GY2 :1培养基(2%葡萄糖、1%酵母膏ρΗ6· 0)中，在28°C下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(QIAGEN)制备基因组DNA。使用Roche 454GS FLX Standard来确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段文库的碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群。实施例2 cDNA的合成和cDNA文库的制备将M.alpina 1S-4株接种到IOOml的培养基(I. 8%葡萄糖、I %酵母膏、pH6. 0)中，在28°C下振荡培养4天。通过过滤收集菌体，使用盐酸胍/CsCl法制备总RNA。从总RNA中，通过SuperScript II RT(invitrogen)使用6碱基随机引物进行逆转录反应，合成 cDNA。且使用 01igotex-dT30〈Super>mRNAPurification Kit (TaKaRaBio),从总 RNA 中进行 poly (a)+RNA 的纯化。使用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold CloningKit (STRATAGENE)构建 cDNA 文库。实施例3 :来自酉良酒酵母(S. cerevisiae)的PAHl同源物的禅索作为承担酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) PAPl活性的基因之一的PAHl (YMR165C)(本说明书中也有时标记为ScPAHl)的氨基酸序列相对于M. alpina 1S-4株的基因组碱基序列进行tblastn分析。其结果，包含序列号5和序列号10所示的序列的超级重叠群匹配(hit)。将序列号5所涉及的基因命名为MaPAHl. 1，将序列号10所涉及的基因命名为MaPAHl. 2。实施例4 =MaPAHl. I 及 MaPAHl. 2 的克降
(I)探针的制备为了克隆MaPAHl. I基因和MaPAHl. 2基因的cDNA，从序列号5及序列号10以及上述BLAST分析的结果制备以下引物。MaPAHl-l-3F :5’ -CGCCAATACATTGACGTTTTCAG-3’ (序列号 11)MaPAHl-l-5R :5’ -AGTTCCAGTCATTGAACTCGGGTGC-3，(序列号 12)MaPAHl-2-3F :5’ -GAGCCCAGTTGACCTTTGAGGCATTC-3，(序列号 13)MaPAHl-2-5R :5，-CACTGAGAACGAGACCGTGTTGGCG-3’(序列号 14)以实施例2中构建的cDNA文库为模板，通过引物MaPAHl_l_3F和引物MaPAHl-l-5R 的组合、或引物 MaPAHl_2_3F 和引物 MaPAHl_2_5R 的组合，使用 ExTaq (TaKaRaBio)，进行94°C 2分钟之后，进行(94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 2分钟)30个循环的PCR。将分别得到的约0. 6kbp的DNA片段使用Τ0Ρ0-ΤΑ cloning Kit (invitrogen)进行克隆,确定所得到质粒的插入片段的碱基序列。将用前者的引物组合得到的具有序列号4的第2352位-第3010位的碱基序列的质粒作为pCR-MaPAHl. I-P,将用后者引物的组合得到的具有序列号9的第1615位-第2201位的碱基序列的质粒作为pCR-MaPAHl. 2_P。而后，分别以这些质粒为模板，使用上述引物通过PCR制备探针。反应中使用ExTaq (TaKaRa Bio),替换附带的dNTP混合物使用PCR标记混合物(Roche Diagnostics公司)，制备将经过扩增的DNA进行地高辛(DIG)标记的探针，作为MaPAHl. I探针和MaPAHl. 2探针。使用这些探针，分别筛选cDNA文库。杂交条件如下。缓冲液5xSSCU% SDS,50mA Tris-HCl (ρΗ7· 5)、50% 甲酰胺；温度:42V ( 一夜)；洗涤条件在O. 2x SSC、0· I % SDS 溶液中(65。。)、20 分钟 X 3 次;使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行检测。从筛选得到的噬菌体克隆中，通过使用体内切割技术切割质粒，得到各质粒DNA。用MaPAHl. I探针筛选后得到的质粒中插入片段长度最长的质粒包含序列号4的第1307位以后的序列，命名为质粒pB-MaPAHl. Ip。通过与ScPAHl的氨基酸序列比较,认为该质粒pB_MaPAHl. Ip不包含编码PAH1. I的N末端的区域。通过BLAST分析，将认为包含MaPAHl. I基因的基因组序列(序列号5)与ScPAHl的氨基酸序列的N末端序列进行比较时，认为序列号5的第I-第3位的ATG有可能是起始密码子。此外,将质粒pB-MaPAHl. Ip的各开放阅读框(frame)翻译成氨基酸序列，与来自酿酒酵母(s. cerevisiae)的ScPAHl蛋白质的氨基酸序列进行比较时,认为序列号4的第3985-第3987位的TGA为终止密码子。因此，为了克隆cDNA的全长，设计以下引物。NotI-PAHl-I-F :5，-GCGGCCGCATGCAGTCCGTGGGAAG-3’ (序列号 15)MaPAHl-I-IOR :5，-TTCTTGAGTAGCTGCTGTTGTTCG-3’(序列号 16)首先，以上述cDNA为模板，通过引物NotI-PAHl-I-F和引物MaPAHl-I-IOR的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，在进行94°C 2分钟之后，进行(94°C 30秒、55°C 30秒、720C 2分钟)的30个循环的PCR，将所得到的约I. 5kbp的DNA片段通过TOPO-TA cloningKit (invitrogen)克隆，确认插入片段部分的碱基序列。将包含序列号4的第I-第1500位的碱基序列的DNA片段经过克隆的质粒作为pCR-MaPAHl. l_Np。而后，将用限制性内切酶NotI和XhoI酶切质粒pCR-MaPAHl. I-Np而得到的约I. 4kbp的DNA片段、和用限制性内切酶NotI和BamHI酶切质粒pB-MaPAHl. Ip而得到的约3. 7kbp的DNA片段、和用限制性内 切酶XhoI和BamHI酶切质粒pB-MaPAHl. Ip而得到的约2. Ikb的DNA片段使用ligationhigh (TOYOBO)连接，得到认为包含MaPAHl. I的全长cDNA的质粒pB-MaPAHl. lcDNA。包含MaPAHl. I的全长ORF的cDNA序列如序列号4所示。另一方面，用MaPAHl. 2探针筛选而得到的质粒中插入片段长度最长的质粒包含序列号9的碱基序列。通过与来自酿酒酵母(S. cerevisiae)的ScPAHl的序列进行比较，认为该质粒具有包含MaPAHl. 2的全长ORF的cDNA。将该质粒作为pB-MaPAHl. 2cDNA。(2)序列分析 MaPAHl. I基因的cDNA序列(序列号4)中，包含由第I位-第3987位的碱基序列组成的⑶S (序列号3)、由第I位-第3984位的碱基序列组成的ORF (序列号I)。MaPAHl. I基因编码的推定氣基酸序列如序列号2所不。比较MaPAHl. I基因的基因组序列和ORF序列(图I)。MaPAHl. I基因的基因组序列认为由11个外显子和10个内含子组成。另一方面，MaPAHl. 2基因的cDNA序列(序列号9)中，包含由第72位-第3791位的碱基序列组成的⑶S (序列号8)、由第72位-第3788位的碱基序列组成的ORF (序列号6)。MaPAHl. 2基因编码的推定氨基酸序列如序列号7所示。比较MaPAHl. 2基因的基因组序列和ORF序列(图2)。MaPAHl. 2基因的基因组序列由8个外显子和7个内含子组成。MaPAHl. I和MaPAHl. 2的cDNA序列和推定氨基酸序列分别为如图3、图4所示。将MaPAHl. I和MaPAHl. 2的推定氨基酸序列相对于在GenBank中注册的氨基酸序列使用BLASTp程序进行同源性搜索时,均与来自新生隐球菌新生变种(Cryptococcusneoformans var. neoformans)JEC21的 Nuclear elongation and deformation protein I推定蛋白质(AAW42851)以最高分匹配,但同一'丨生分别低为25. 9%、26. 6%。在真菌类的PAPl同源物中，来自进行了功能分析的ScPAHl蛋白质的氨基酸序列、和本发明的来自高山被孢霉(M. alpina)的MaPAHl. I和MaPAHl. 2的氨基酸序列的同一性分别为22. 7%,22. 5%0将本发明的来自高山被孢霉(M. alpina)的MaPAHl. I和MaPAHl. 2的氨基酸序列与已知的ScPAHl及来自小鼠的Lipin的氨基酸序列比较(图5)。PAPl家族酶中，N末端部分的氨基酸序列十分保守,被称为IipinN末端保守区(lipin, N-terminalconserved region) (pfam04571)。本发明的来自高山被抱霉(M. alpina)的 MaPAHl. I 和MaPAHl. 2中，已知的酶和N末端部分为比较保守。而且，图5中用双下线表示的DIDGT序列与类似齒酸脱齒酶的蛋白质(haloacid dehalogenase (HAD) -like protein)超家族酶中保守的DXDX (T/V)催化位点的基序一致。比较MaPAHl. I和MaPAHl. 2的CDS序列时(图6)，同一性为54. 7%，比较推定氨基酸序列时(图7),同一'丨生为35. 6%。实施例5 =MaPAHl. I和MaPAHl. 2在酵母中的表汰
MaPAHl. I和MaPAHl. 2的表汰载体的构律:为使MaPAHl. I在酵母中表达，如下构建表达载体。首先，用限制性内切酶EcoRI酶切酵母表达用载体pYE22m(Biosci. Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)，接着通过Blunting Kit (TaKaRa Bio)将末端平滑化。而后将 Linker, pNotl, Phosphorylated(8mer) (TaKaRa Bio)使用 ligation high(东洋纺)连接，将所得到的载体作为载体pYE22mN。将用限制性内切酶NotI和KpnI酶切载体pYE22mN后与用限制性内切酶NotI和KpnI酶切质粒pB-MaPAHl. IcDNA而得到的约4. 2kbp的DNA片段连接，得到质粒pYE-MaPAHl. I。另一方面，将用限制性内切酶NotI和KpnI酶切载体pYE22mN后与用限制性内切酶NotI和KpnI酶切质粒pB-MaPAHl. 2cDNA而得到的约3. 8kbp的DNA片段连接，得到质粒pYE-MaPAHl. 2。S. cerevisiae A Scpahl URA3 株的制备为了克隆来自S. cerevisiae S288C株的ScPAHl基因，制备以下引物。引物KpnI-PAHl-F :5’ -GGTACCATGCAGTACGTAGGCAGAGCTC-3’(序列号 17)引物XhoI-PAHl-R :5’ -CTCGAGTTAATCTTCGAATTCATCTTCG-3’ (序列号 18)将S. cerevisiae S288C株在YPD (酵母膏2%、多聚蛋白胨I %、葡萄糖2% )液体培养基中30°C下培养一夜，从其菌体中使用Dr. GenTLE (酵母用)(TaKaRa Bio)提取DNA。以所得到的DNA为模板，通过用引物KpnI-PAHl-F和引物XhoI-PAHl-R并使用ExTaq进行的PCR反应，扩增ScPAHl基因。将所得到的约2. 5kbp的DNA片段使用TOPO TA cloningKit进行克隆，将碱基序列正确的克隆作为pCR-ScPAHl。通过将用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶EcoRV酶切pCR-ScPAHl而得到的约O. 4kbp的DNA片段、和用限制性内切酶EcoRV和限制性内切酶XhoI酶切pCR-ScPAHl而得到的约2. Ikbp的DNA片段与用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶XhoI酶切的载体pBluescriptIISK+连接，得到质粒pBScPAHl。用限制性内切酶EcoRV和限制性内切酶HincII酶切质粒pBScPAHl后的片段、和用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276)后进行末端平滑化而得到的约I. 2kbp的DNA片段连接，将ScPAHl基因和URA3基因为同向的产物作为质粒ρΒ Λ pahl URA3。而后，用限制性内切酶EcoRI酶切质粒pBApahl URA3而得到DNA片段，使用该DNA 片段将 S. cerevisiae YPH499 株(ura3-521ys2_801amber ade2-101ochre trpl- Δ 63his3-A200 leu2_A la) (STARATAGENE)作为宿主进行转化，将在SC-Ura(每IL中，无氨基酸酵母氣源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFCO) 6. 7g、葡萄糖 20g、氛基酸粉(腺嘌呤硫酸盐I. 25g、精氨酸O. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸O. 6g、亮氨酸I. Sg、赖氨酸O. 9g、蛋氨酸O. 6g、苯丙氨酸I. 5g、丝氨酸11. 25g、酪氨酸O. 9g、缴氨酸4. 5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)1.3g、琼脂培养基(2%琼脂))琼脂培养基中生长繁殖的菌株作为转化株进行筛选。用PCR确认导入Apahl :URA3构建物的ScPAHl基因被破坏，作为AScpahl URA3 株。
转化株的获得:将Λ Scpahl :URA3 株作为宿主，用质粒pYE22m、pYE_MaPAHL l、pYE_MaPAHl. 2 分别转化，将可在SC_Ura、Trp (每IL中，无 氛基酸酵母氣源(Yeast nitrogen base w/o aminoacids) (DIFCO) 6. 7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐I. 25g、精氨酸O. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸O. 6g、亮氨酸I. 8g、赖氨酸O. 9g、蛋氨酸O. 6g、苯丙氨酸I. 5g、丝氨酸11. 25g、酪氨酸O. 9g、缬氨酸4. 5g、苏氨酸6g的混合物)I. 3g、琼脂培养基(2%琼脂))琼脂培养基中生长繁殖的菌株作为转化株进行筛选。在用各自的质粒转化的菌株中，每次将任意2株(将用质粒pYE22m转化的对照株作为Cl，C2,将用质粒pYE-MaPAHl. I转化的菌株作为MaPAHl. 1-1, MaPAHl. 1_2，将用质粒pYE-MaPAHl. 2转化的菌株作为MaPAHl. 2-1,MaPAHl. 2-2)用于以下的实验。实施例6 :M产依赖性磷脂酸磷酸酶活性(PAP1活性)的测定将各自的酵母的转化株接种到SC-Ura、Trp液体培养基IOOml中，30°C下振荡培养I天。由所得到的培养液如下制备粗酶液。特别是操作均在4°C或冰中进行。首先将培养液离心分离回收菌体，水洗。接着，在菌体中添加缓冲液A(50mA Tris-HCl (pH7. 5)、
0.3M 鹿糖、IOmA 疏基乙醇、O. 5mA 苯甲横酸氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)(PMSF)) 5ml,悬浮菌体。通过用弗式压碎器(Thermo Fisher Scientific公司)，用小细胞(minicell) 16kPa处理3次，破碎菌体。将菌体破碎液以1，500x g、10分钟离心分离，回收上清，作为粗酶液。粗酶液中所包含的蛋白质浓度通过Protein Assay CBB Solution (5x)(Nacalai Tesque)测定。改变Gil-Soo 等的方法(J. Biol. Chem.，282 (51) ,37026-37035，(2007))，如下测定PAPl活性。因酿酒酵母(S. cerevisiae)无法合成亚油酸,所以，作为PAP的底物使用 I, 2- 二亚油酸基-sn-甘油-3-憐酸(I, 2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate)(18:2-ΡΑ) ο 反应液为 500 μ 1，其组成为粗酶液 100μ L,50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、100 μ g/m
1,2- 二亚油酸基-sn-甘油-3-憐酸(I, 2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate),单钠盐(Monosodium Salt) (Avanti Polar Lipids, Inc) > ImM MgCl2> IOmM 2-疏基乙醇。将反应液在25°C下保持30分钟后，加入氯仿甲醇(I 2)终止反应，用Bligh-Dyer法提取脂质。使用硅胶60薄层板(Merck)，通过将己烷乙醚醋酸=70 30 I作为展开溶剂的薄层色谱法(TLC)分离脂质。将樱草灵溶液(0.015%樱草灵、80%丙酮水溶液)喷雾后，通过UV照射使脂质可视化。刮取二酰甘油(DG)组分，将脂肪酸通过盐酸甲醇法衍生为甲酯。接着，将脂肪酸甲酯用己烷提取，馏去己烷后，通过气相色谱法进行分析。向每单位粗酶液蛋白质的DG组分中转移的亚油酸量如表2所示。表2
转化株__18:2(g/mg蛋白质)
~ Cl— 15.43
~ C2— 17. 53
—MaPAHl. 1-1 — 56. 03
—MaPAHl. 1-2~ 44. 34 —MaPAHl. 2-1 — 19. 45
—MaPAHl. 2-2 20. 90如表2所示，与用pYE22m转化的C1、C2进行比较时，具有如下活性，将使MaPAHl. I表达的 MaPAHl. l-l、MaPAHl. 1-2 约为 3 倍、使 MaPAHl. 2 表达的 MaPAHl. 2_l、MaPAHl. 2-2 约为I. 2倍的18:2-PA转换为二亚麻油酸甘油酯(Dilinolein) (18:2_DG)的活性。由此可示意出MaPAHl. I和MaPAHl. 2具有PAP活性。另一方面，为分析上述PAP活性是否依赖Mg2+,如下进行反应。即反应液为500 μ I,其组成为粗酶液 100 μ L、50mM Tris-HCl (pH 7. 5) UOO μ g/mlI, 2_ 二亚油酸基 _sn_ 甘油-3-憐酸(I, 2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate),单钠盐(Monosodium Salt) (Avanti Polar Lipids, Inc.) >2mM ED TA> IOmM 2-疏基乙醇，此外与上述同样反应并进行分析。转移到每单位粗酶液蛋白质的DG组分中的亚油酸量如表3所示。表权利要求
1.一种核酸，其特征在于，包含以下(a) (g)中任一项所述的核酸 (a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的喊基序列； (f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列； (g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
2.根据权利要求I中所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (g)中的任一项 (a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2 X SSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2 X SSC、50°C的条件下杂交，且包含具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的喊基序列； (g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
3.—种核酸，其特征在于，为以下(a) (d)中任一项所述的核酸 (a)核酸，其包含序列号I或序列号6表示的碱基序列或其部分序列； (b)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列；(C)核酸，其包含序列号4或序列号9表示的碱基序列或其部分序列； (d)核酸，其包含序列号5或序列号10表示的碱基序列或其部分序列。
4.一种核酸，其特征在于，包含以下(a) (g)中任一项所述的核酸 (a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的喊基序列； (c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的喊基序列； (d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列； (e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列； (f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且包含具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的外显子的碱基序列； (g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
5.根据权利要求4中所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (g)中的任一项 (a)核酸，其包含编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其与由序列号I或序列号6组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性的蛋白质的喊基序列； (c)核酸，其包含与由序列号I或序列号6组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的喊基序列； (d)核酸，其包含编码与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列； (e)核酸，其与编码由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的碱基序列； (f)核酸，其与由序列号5或序列号10组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且包含具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的外显子的碱基序列； (g)核酸，其包含与由序列号5或序列号10组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提高的活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
6.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质 (a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性； (b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。
7.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质 (a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性； (b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。
8.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质 (a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性； (b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性。
9.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质 (a)蛋白质，其由序列号2或序列号7中I 130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中磷脂酸(PA)生成二酰甘油(DG)及/或甘油三酯(TG)的活性提高的活性； (b)蛋白质，其为与由序列号2或序列号7组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有使酵母的PAHl缺陷型株中PA生成DG及/或TG的活性提闻的活性。
10.一种蛋白质，其特征在于，由序列号2或序列号7表示的氨基酸序列组成。
11.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求I 5中任一项所述的核酸。
12.—种转化体，其特征在于，由权利要求11中所述的重组载体转化。
13.一种脂肪酸或包含脂质的脂肪酸组合物，其特征在于，培养权利要求12中所述的转化体而得到。
14.一种脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养权利要求12中所述的转化体而得到的培养物中提取脂肪酸或脂质。
15.一种食品，其特征在于，包含权利要求13中所述的脂肪酸组合物。
全文摘要
本发明提供新型磷脂酸磷酸酶基因。本发明的上述课题通过提供本发明的序列号1或序列号7、序列号4或序列号9、或序列号5或序列号10的碱基序列及序列号2或序列号6的氨基酸序列来解决。
文档编号A23L1/30GK102918153SQ20108006045
公开日2013年2月6日 申请日期2010年12月27日 优先权日2009年12月28日
发明者落合美佐 申请人:三得利控股株式会社