呈现增强的木质纤维素水解产物发酵的改良酵母菌株的制作方法

专利名称：呈现增强的木质纤维素水解产物发酵的改良酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有增强的利用木质纤维素水解产物生长和/或发酵能力的新酵母菌株。
背景技术：
植物细胞壁主要由大生物聚合物纤维素、半纤维素、木质素和果胶构成。纤维素和半纤维素构成了一种用于生产可发酵糖的可再生且廉价的重要碳源。纤维素由通过β-1，4糖苷键以直链连接在一起的D-葡萄糖单元构成。半纤维素主要由直链木糖骨架和多个侧链(例如，L-阿拉伯糖、乙酸、阿魏酸等)构成，所述直链木糖骨架包含通过β -I, 4糖苷键连接在一起的D-木糖单元,所述侧链通过糖苷键或酯键与所述木糖单元连接。术语木质纤维素通常用于描述包含纤维素、半纤维素和木质素的植物来源的生物质。近年，已经非常关注并致力于从含木质纤维素的原料例如农业废料和林业废料生产燃料和化学品，主要为乙醇，原因是农业废料和林业废料成本低并广泛可得。这些农业废料和林业废料通常被燃烧或掩埋；因此，使用这些木质纤维素原料用于乙醇生产提供了代替丢弃的有吸引力的方案。这些原料的另一个优势是木质素副产物——其在所述纤维素转化过程后仍然存在——可用作燃料来代替化石燃料为所述过程提供动力。若干研究已得出结论当考虑整个生产和消耗循环时，使用由纤维素生产的乙醇产生接近于零的温室气体。相比之下，来自诸如玉米淀粉、甘蔗和甜菜的原料的燃料乙醇受到这些原料已经用作人和动物食物来源的限制。使用这些原料的另一缺点是在其转化过程中使用化石燃料。因此，这些过程对减少温室气体仅有有限的作用。木质纤维素生物质也已被考虑用于生产除乙醇以外的其它发酵产物。所述产品的实例包括乳酸、山梨醇、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、丙二醇、丁二醇、木糖醇、丙酮和丁醇。将木质纤维素原料转化为乙醇或其它发酵产物的第一个化学处理步骤涉及将所述纤维素和半纤维素聚合物水解为糖单体，例如葡萄糖和木糖，其可在后续发酵步骤中被转化为乙醇或其它发酵产物。所述纤维素和半纤维素的水解可用一步化学处理或用温和化学预处理后以纤维素酶酶水解所述预处理木质纤维素的两步法实现。在一步化学处理中，使所述木质纤维素原料与强酸或碱在足以将所述原料的纤维素和半纤维素组分水解为糖单体的条件下接触。在两步化学-酶水解方法中，首先将所述木质纤维素原料在与浓酸或浓碱水解方法的条件类似但较温和的条件下进行预处理。所述预处理的目的是增加纤维素表面积并将纤维状原料转化为泥状结构，而纤维素到葡萄糖的转化有限。如果用酸进行所述预处理，那么就将所述原料的半纤维素组分水解为木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖。所得到的水解产物——其富于衍生自半纤维素的戊糖——可与固体物分离并用于后续发酵过程以将所述戊糖转化为乙醇或其它产物。如果用碱进行所述预处理，那么所述多糖发生非常少的水解；然而，碱处理会通过与所述半纤维素上存在的酸基团反应而打开所述纤维素的表面。在所述预处理步骤后，将所述纤维素用一种或多种纤维素酶例如外纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β -葡萄糖苷酶(β -G)进行酶水解。CBH和EG酶可催化纤维素中β-1，4- -葡聚糖键的水解。CBH酶例如CBHI和CBHII可作用于纤维素微纤丝中的葡萄糖聚合物的末端并释放纤维二塘，而EG酶可作用在所述纤维素聚合物内的随机位置。综上，所述纤维素酶将纤维素水解为纤维二糖，其转而被β-G水解为葡萄糖。除CBH、EG和β -G酶以外，在所述水解反应过程在还可存在增强预处理的木质纤维素底物的酶降解的其它酶或蛋白，例如木糖酶、木糖苷酶、β -甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、膨胀因子(swollenin)和膨大素(expansin)。木糖酶的存在可能是有利的,例如,在经预处理的原料中存在大量木糖的情况下。如果在预处理和酶水解步骤之间将所述戊糖与固体物分离，那么葡萄糖将是通过酶处理产生的水解产物中主要的糖单体。如果使由所述化学预处理步骤释放的戊糖带至酶水解步骤，那么水解产物将含有约2:1的重量比的葡萄糖和木糖，其中L-阿拉伯糖为总糖单体的约3-5wt%。将产生的木质纤维素的水解产物(有时称为木质纤维素水解产物)中的己糖和戊糖转化为乙醇或其它产物在后续微生物发酵中进行。如果葡萄糖是所述水解产物中存在的优势糖，那么所述发酵通常用酵母属(Saccharomyces spp.)酵母进行,其将此糖和存在的其它己糖转化为乙醇。然而,如果所述水解产物包含高比例的戊糖例如衍生自半纤维素的木糖和阿拉伯糖，那么所述发酵用天然具有或通过遗传工程具有将木糖和/或阿拉伯糖发酵为乙醇或其它产物的能力的微生物进行。可天然依靠戊糖例如木糖或阿拉伯糖生长并且/或者将其发酵成乙醇或糖醇类的微生物实例包括但不限于属于假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的某些种的酵母。然而，所述酵母通常以较酵母属低得多的速率发酵葡萄糖。这在用于发酵含有高比例葡萄糖和木糖的木质纤维素水解产物的方法中是特别大的限制。已进行遗传修饰以利用木糖生长或发酵的微生物实例包括但不限于已插入(a)来自树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶(XR)编码基因和木糖还原酶(XDH)编码基因(分别为 XYLl 和 XYL2)(美国专利 No. 5，789，210、5，866，382、6，582，944和7，527，927以及欧洲专利No. 450530)，或者(b)真菌或细菌木糖异构酶(XI)基因(美国专利No. 6，475，768和7，622，284)的重组酵母属菌株。这些菌株既能够利用木糖又能够利用葡萄糖进行生长和/或发酵。被遗传修饰以利用L-阿拉伯糖进行生长和/或发酵的酵母实例包括但不限于已插入来自真菌(美国专利No. 7，527，951)或细菌(国际专利公开No. WO 2008/041840)阿拉伯糖代谢途径的基因的重组酵母属菌株。在某些实例中，已开发了既可利用木糖又可利用阿拉伯糖进行生长和/或发酵的重组酵母属菌株(国际专利公开No. W02006/096130)。已通过遗传工程和/或适应进化技术对这些菌株进行了进一步遗传修饰，以增强木糖转化率或木糖的乙醇产率。这些修饰包括过表达糖转运子(美国专利公开No. 2007/0082386)、缺失内源非特异性醛糖还原酶GRE3 (美国专利No. 6，410, 302)和增强磷酸戊糖途径(国际专利公开No. WO 2005/108552 ;美国专利公开No. 2006/0216804和2007/0082386)ο然而，尽管所述木糖转化速率和/或木糖的乙醇得率随纯糖发酵增加,但对于木质纤维素水解产物中的戊糖发酵未观察到也未见报道类似的结果。木质纤维素水解产物，不管是通过一步化学处理方法还是通过两步化学预处理 及酶水解方法生产，均通常不仅包含糖单体例如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，而且包含木质素单体、乙酸盐(从所述半纤维素侧链释放)和所述糖的化学反应产物例如糠醛(来自木糖)和羟甲基糠醛(来自葡萄糖)。乙酸盐、糠醛和羟甲基糠醛是微生物生长和/或将糖转化为乙醇的发酵过程的公知抑制物。木质纤维素水解产物中存在乙酸特别成问题，因为其会抑制酵母细胞生长并因此显著降低发酵产物的产率(Abbott et al. (2007)FEMS YeastRes. 7:819-33)。将木质纤维素原料转化为可发酵糖时出现的其它酵母抑制物是糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)。通过暴露于高温和酸，糠醛和HMF分别来自于木糖和葡萄糖丢水分子。这些化合物的抑制效应可通过延长进行所述发酵所需的时间、增加所需的酵母量、减少最终产率或这些的组合降低发酵操作的效率。可在酵母发酵中在木质纤维素水解产物转化为乙醇(或其它化学品)之前通过物理分离方法从所述水解产物中除去这些抑制物。然而，这些方法通常昂贵并可能导致从木质素生物质生产乙醇或其它所需发酵产物的总成本增加。例如，已经被提出来降低由木质纤维素原料水解产生的抑制物的浓度的一种方法是超施石灰，其涉及加入Ca(OH)2以从木质纤维素水解产物沉淀抑制物，从而提高后续使用酵母的发酵。这类方法为美国专利No. 2，203，360 ;4，342，831 ;6，737，258 ;7，455，997 ；以及 Wooley 等人(见Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design andEconomics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzyme HydrolysisCurrent and Future Scenarios(1999)Technical Report, National Renewable EnergyLaboratory, pp. 16-17)所公开。然而,石灰块的任何处理都是困难和昂贵的。此外,将I丐导入所述流体会增加钙垢在蒸发器、蒸馏塔和其它处理设备上沉淀的可能性。垢的清除和避免会增加糖处理的成本。已经被提出来除去发酵抑制物的另一方法是离子交换。例如，Nilvebrant等人((2001)App. Biochem. Biotech. 91-93:35-49)已经研究了离子交换，其中对云杉水解产物进行处理以除去发酵抑制物，例如酚化合物、呋喃醛和脂肪族酸。美国专利No. 7，455，997和Wooley等人(见上)报道了使用离子交换从获自木片的酸水解混合物中除去乙酸，然后进行石灰处理。类似地，Watson 等人((1984)Enzyme Microb. Technol. 6:451-56)公开了在发酵之前使用离子交换从甘蔗渣酸水解产物中除去抑制物例如乙酸和2-糠醛(糠醛)。此外，Tran 和 Chambers ((1986)Enzyme Microb. Technol. 8:439-44)公开了在发酵之前从红橡木的酸预水解产物中除去抑制物的多种处理，包括混合床离子树脂处理。在实践中，若干因素限制离子交换处理除去抑制物的有效性。首先，所述流体的多组分性质导致在任何单一条件组下不能有效除去一些物质。第二，高离子载量要求非常频繁和昂贵地再生所述树脂。最后，并非所有所述抑制物均是离子型的，离子交换对从糖中除去非离子型的化合物无效。美国专利公开No. 2008/0171370报道了没食子酸可用于通过结合乙酸解毒由预处理木质纤维素材料产生的水解产物。如其中所公开的，没食子酸是天然的聚合物共聚单体，即没食子鞣质结构的核心，并因此是在Fischer酯化中以硫酸催化剂聚合苯酚和乙酸的天然手段。国际专利公开No. WO 2008/124162公开了通过能够将乙酸转化为生物化学品例如乙醇、丁醇、琥珀酸、乳酸、延胡索酸、丙酮酸、丁酸和丙酮的大肠杆菌(E. coli)菌株从含有木糖和葡萄糖的糖混合物中选择性除去乙酸。所述大肠杆菌已经缺失了 4个编码参与木糖和葡萄糖利用蛋白的基因，从而防止大肠杆菌消耗木糖或葡萄糖但已知对乙酸代谢没有作用。在乙酸转化为所述生物化学品后，使用不同微生物对所述糖混合物进行木糖和葡萄糖发酵，一种微生物具有仅发酵木糖的能力，另一种微生物具有仅发酵葡萄糖的能力。然而，所述方法不涉及从糖水解产物中除去不想要的糖，而是使所述混合物中存在的所有糖到乙醇或其它生物化学品的转化率最大化。解毒所述木质纤维素水解产物的另一种方法是开发耐受这些水解产物中存在的抑制性化合物的酵母菌株。例如，对于毕赤酵母属和酵母属菌株，已经报道了对木质纤维素水解产物的适应(Huang et al. (2009) Bioresource Technol. 100:3914-20;Martin etal. (2007) Bioresource Technol. 98:1767-73)。尽管此方法产生对所述水解产物具有一定耐受性的菌株，然而未表征所述适应性菌株的基因型。表征和/或提高对木质纤维素酶水解产物耐受性的其它尝试已经涉及对木质纤维素酶水解产物中的三种主要抑制物——乙酸、糠醛和羟甲基糠醛(HMF)——的耐受性。例如，已使毕赤酵母属和酵母属的菌株适应含有糠醛和/或羟甲基糠醛的培养基(Liu etal. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:345-52. ; Liu et al. (2005) Appl. Biochem.Biotechnol. 121-124:451-60)。还已经进行了其它尝试，以通过筛选酵母单缺失菌株的集合来鉴定那些增加所述酵母对糖醒(Gorsich et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol.71:339-49)、乙醛(Matsufuhi et al. (2008) Yeast25:825-22)以及乳酸和乙酸(Kawahataet al. (2006)FEMS Yeast Research6:924_36)敏感性的缺失，确定有助于抑制物耐受性的基因。进行了一个有限基因集合的表达作谱，以确定适应糠醛和HMF的酵母菌株相对于存在HMF下培养的亲代菌株的基因表达变化(Liu et al. (2009)Mol. Genet. Genomics282:233-44)。然而，所得到的菌株对木质纤维素水解产物的敏感性和存在木质纤维素水解产物条件下培养菌株的表达谱均未报道。

发明内容
本发明的一个目的是提供具有增强的利用木质纤维素水解产物中存在的木糖生长和/或发酵为乙醇或其它发酵产物的能力的酵母菌株。本发明提供能够利用木质纤维素水解产物中存在的木糖和/或其它戊糖生长和/或将这些戊糖发酵为发酵产物(例如醇(例如乙醇))或糖醇(例如木糖醇))的改良酵母菌株。所述改良酵母菌株就木糖发酵的比速率而言相对于衍生出所述改良酵母菌株的对应亲代酵母菌株呈现增加至至少I. 3倍(例如I. 5倍、2倍或更高)的生长速度。所述分离的改良酵母菌株可为酵母属，或可为某些其它属的酵母。在本发明的一个方面，相对于衍生出所述改良菌株的亲代菌株，所述改良菌株包含(a)选自 AREl、VBA3、RNQl、FUSl、PDII、BUD23、IMGU DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C和tE(UUC)B的一个或多个基因的拷贝数或表达的增加，(b)选自ARE1、VBA3、RNQl、FUSl、PDIl、BUD23、MGl、DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C、tE(UUC)B、BIKl和GLKl的一个或多个基因的拷贝数或表达的增加，(c)选自ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSl、PRP6、YBLlOOff-C, YBR201C-A 和 tE (UUC) G2 的一个或多个基因的拷贝数或表达的减少，(d)选自 ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSU PRP6、YBLIOOff-C,YBR201C-A,tE (UUC) G2和ALD3的一个或多个基因的拷贝数或表达的减少，或者(e)其组合。在本发明的另一方面，相对于衍生出所述改良菌株的亲代菌株，所述改良菌株包含(a)选自GALl、GAL7、GALlO、GAL80和PGMl的一个或多个半乳糖代谢途径基因的拷贝数或表达的增加，和/或(b)选自GAL3、GAL4、GAL11和PGM2的一个或多个半乳糖代谢途径基因的拷贝数和/或表达的减少。在本发明的又一方面，相对于衍生出所述改良菌株的亲代菌株，所述改良菌株包含(a)选自HXT1、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2和GRRl的一个或多个涉及己糖转运的基因的拷贝数和 / 或表达的增加，和 / 或(b)选自 HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个涉及己糖转运的基因的拷贝数和/或表达的减少。在本发明的再一方面，相对于衍生出所述改良菌株的亲代菌株，所述改良菌株包含选自 ERGl、ERG8、ERG10、ERGlI、ERG20、ERG25、ERG26、ERG27、HMGl 和 CYB5，或者选自ERGI、ERG8、ERGIO、ERG11、ERG20、ERG25、ERG26、ERG27、HMGI、CYB5、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24和ERG28的一个或多个麦角留醇生物合成途径基因的拷贝数和/或表达的增加。对于本文所述的本发明的目的，所述改良菌株除了以下情况之外与所述亲代菌株相同(a)选自 ARE1、VBA3、RNQl、FUSl、PDIl、BUD23、IMGU DDI2, SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C、tE (UUC) B、GALl、GAL7、GALlO, GAL80、PGMl、HXTl、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRRl、ERGl、ERG8、ERGlO、ERGlI、ERG20、ERG25、ERG26、ERG27、HMGl 和 CYB5 的一个或多个基因的拷贝数和/或表达的增加，(b)选自AREU VBA3、RNQU FUSU PDIU BUD23、IMGUDDI2, SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C、tE(UUC) B、GAL1、GAL7、GALlO、GAL80、PGMl、HXTl、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRRl、ERGl、ERG8、ERGlO、ERGl I、ERG20、ERG25、ERG26、ERG27、HMG1、CYB5、BIK1、GLK1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24 和 ERG28 的一个或多个基因的拷贝数和 / 或表达的增加，(c)选自 ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSI、PRP6、YBLI OOff-C, YBR201C-A、tE (UUC) G2、GAL3、GAL4、GALl I、PGM2、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT9、HXTlU HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数和/或表达的减少，⑷选自 ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSU PRP6, YBLlOOff-C, YBR201C-A、tE (UUC) G2、GAL3、GAL4、GAL11、PGM2、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2、REGI 和ALD3的一个或多个基因的拷贝数和/或表达的减少，或者(e)其组合。所述改良酵母菌株可衍生自天然能够进行葡萄糖发酵的亲代酵母菌株，例如酵母属的菌种。在某些实施方案中，所述改良酵母菌株能够发酵木质纤维素水解产物中存在的葡萄糖和木糖两者。所述改良酵母菌株也可衍生自天然能够进行木糖发酵的亲代酵母菌株，例如假丝酵母属、毕赤酵母菌属或克鲁维酵母属的菌种，或者衍生自已通过重组或非重组手段改良以增强木糖利用的菌种。所述改良酵母菌株可衍生自已经通过如下方式使得能够利用木糖生长或发酵的亲代酵母属菌株纳入(a)编码木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的基因和/或(b)编码一种或多种木糖异构酶(XI)的基因。此外，所述改良酵母菌株还可过表达编码木酮糖激酶的内源基因或异源基因。或者，所述改良酵母菌株可衍生自已经通过一种或多种非重组方法，例如适应性进化或随机诱变和选择，使得能够利用木糖生长或发酵的亲代酵母属菌株。本发明的实施并不受到所用的产生所述改良酵母菌株和/或所述亲代酵母菌株的方法的限制。所述改良酵母菌株可包含能够增强木糖或木质纤维素水解产物中存在的其它糖发酵的其它修饰，包括但不限于改变编码磷酸戊糖途径(PPP)的酶的一个或多个基因的表达，降低编码非特异性醛糖还原酶的一个或多个基因的表达或者编码能够发酵L-阿拉伯糖或木质纤维素水解产物中存在的其它己糖或戊糖(例如甘露糖、半乳糖和果糖)的酶的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，这些相同的其它修饰也存在于亲代酵母菌株中。因此，可在本发明提供的修饰之前、之中或之后将这些其它修饰引入所述亲代酵母菌株。一种本发明的改良酵母菌株一酿酒酵母(S. cerevisiae)Y108-l—已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC )，美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯大学大道 10801 (10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209)。所述保藏于2010年I月6日进行，分配以ATCC保藏号No. PTA-10567。本发明还涉及一种利用本文所述的改良酵母菌株从含约30wt%到约90wt% (为总碳水化合物重量的函数)木糖的木质纤维素水解产物中生产发酵产物(例如醇(如乙醇)或糖醇(如木糖醇))的方法。此外，本发明涵盖含有一定百分比(为所述水解产物中总溶解固体物的函数)的至少一种酵母生长或发酵的抑制物(例如乙酸、糠醛、HMF)的木质纤维素水解产物。在本发明的发酵方法中，在含有所述木质纤维素水解产物的发酵培养基中在有利于所述水解产物中的木糖转化成所述发酵产物的条件下培养(例如厌氧培养)上文所述的改良酵母菌株。


图I所示比较了在木质纤维素水解产物(图1A)和纯糖培养基(图1B)中葡萄糖和木糖消耗以及乙醇生产。呈现的数据是对每种条件和菌株的实验平均值(n=3)。当与亲代菌株(LNH-ST)对比时，改良菌株(Y108-1)仅在木质纤维素水解产物中(A)而未在纯糖培养基(B)中呈现增加的木糖摄取和转化。图2是描绘糖酵解(实线箭头)、磷酸戊糖途径(虚线箭头)以及木糖利用所需的导入途径(点箭头)的代谢图。缩写G-6-P(葡萄糖-6-磷酸)、F-6-P (果糖-6-磷酸)、F-l, 6-BP (果糖-1，6- 二磷酸)、DHAP (磷酸二羟丙酮)、GAP (甘油醛-3-磷酸)、PYR (丙酮酸)、Ru-5-P (核酮糖-5-磷酸)、R-5-P (核糖-5-磷酸)、Xu-5-P (木酮糖-5-磷酸)、S-7-P (景天庚糖-7-磷酸)和E-4-P (藓糖-4-磷酸)。图3示出了显示XKSl的高拷贝增加的CGH总括图。图4示出了显示ALD2和ALD3的拷贝丢失的CGH总括图。图5示出了显示ECM21和YBL100W-C的拷贝丢失的CGH总括图。图6示出了显示ILSl的拷贝丢失的CGH总括图。
图7示出了显示MST27、PRM8、ERV14和tE(UUC)G2的拷贝丢失的CGH总括图。图8示出了在改良(Y108-1)和亲代(LNH-ST)酵母菌株中，使用如实施例4. 3所述的实时qRT-PCR测量并相对于RDN18基因的转录水平标准化的酿酒酵母(S. cerevisiae)XKSl和树干毕赤氏酵母菌的XYLl和XYL2基因的相对转录本水平。误差棒代表两个重复 生物样本各个的二次测量的平均值的标准误差(SEM)。图9示出了如实施例5所述的亲代(LNH-ST，深灰)和改良(Y108-1，浅灰)酵母菌株中木糖还原酶(以NADPH或NADH)(图9A)以及木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶(图9B)的酶活。对于每个菌株和时间点，合并来自三次重复发酵的生物质以产生单个无细胞提取物。对酶活进行二重测定。示出了平均活性和标准差。图10示出了在改良(Y108-1)和亲代(LNH-ST)酵母菌株中，通过实时qRT_PCR测量并相对于ACTl基因转录水平标准化的酿酒酵母FUS1、YCL042W、YCL073C和VBA3基因的相对转录本水平。误差棒代表两个重复生物样本各个的平均值的标准误差(SEM)。图11示出了显示通过如实施例4. 2所述进行的微阵列杂交评估的所述改良酵母菌株(Y108-1)中相对所述亲代菌株(LNH-ST)中显示拷贝数增加或丢失的基因的相对转录本比例(Log2)。误差棒代表三个重复生物样本各个均二次测量的平均值的标准误差(SEM)。图12示出了通过如实施例4. 2所述进行的微阵列杂交评估的所述改良酵母菌株(Y108-1)中相对所述亲代菌株(LNH-ST)中参与半乳糖代谢的基因的相对转录本比例(Log2)。误差棒代表三个重复生物样本各个均二次测量的平均值的标准误差(SEM)。图13示出了通过如实施例4. 2所述进行的微阵列杂交评估的所述改良酵母菌株(Y108-1)中相对所述亲代菌株(LNH-ST)中参与己糖转运的基因的相对转录本比例(Log2)。误差棒代表三个重复生物样本各个均二次测量的平均值的标准误差(SEM)。图14示出了通过如实施例4. 2所述进行的微阵列杂交评估的所述改良酵母菌株(Y108-1)中相对所述亲代菌株(LNH-ST)中参与麦角留醇生物合成基因的相对转录本比例(Log2)。误差棒代表三个重复生物样本各个均二重测量的平均值的标准误差(SEM)。图15示出了包含连接于ADHl启动子(Padh)的编码木糖还原酶(XR)的树干毕赤氏酵母XYLl基因、连接于丙酮酸激酶启动子(Ppyk)的编码木糖醇脱氢酶(XDH)的树干毕赤氏酵母XYL2基因以及连接于丙酮酸激酶启动子(Ppyk)的编码木酮糖激酶(XKSl)的酿酒酵母基因的质粒pLNH-ST的图谱。其它元件包括抗生素选择标记物(KanR和AmpR)，酿酒酵母5S核糖体DNA定向序列(5S rDNA)和自主复制序列(ARS)。图16示出了在合成培养基(SM)+30g/L木糖平板(图16A)和含有稀释的、葡萄糖耗尽的木质纤维素水解产物(10%木质纤维素水解产物)的培养基(图16B)上显示的对照亲代(菌株YSC1048)和过表达所述基因(+)或缺失所述基因(△)的改良酵母菌株的对比生长。将平板于30°C孵育5天。图17示出了含有质粒pLNH-ST的亲代酵母菌株和改良酵母菌株在合成培养基+30g/L木糖(浅灰)或葡萄糖耗尽的稀释木质纤维素水解产物平板(深灰)上的相对生长密度。对平板成像并用ImageJ软件测量相对密度。虚线表示仅所述改良酵母菌株的平均生长密度。点线示出了所述平均值的标准差。图18示出了在所述改良酵母菌株(Y108-1)中相对所述亲代酵母菌株(LNH-ST)中参与半乳糖代谢途径的基因的相对转录本水平。
图19A、19B和19C示出了在所述改良酵母菌株(Y108-1)中相对所述亲代酵母菌株(LNH-ST)中参与麦角留醇生物合成途径的基因的相对转录本水平。
具体实施例方式以下描述是仅出于举例目的的实施方案，而非对有效实施本发明所必需的特征组合进行限制。所提供的标题不意图限制本发明的各种实施方案。术语例如“包含”和“包括”不意图进行限制。此外，除非另有指明，否则单数的使用包括复数，“或”是指“和/或”。除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与本领域普通技术人员的通常理解相同的含义。调制改良酵母菌株中的遗传谱本文使用的改良酵母菌株是一种所鉴定基因的拷贝数或表达相对于衍生出所述改良菌株的亲代菌株中相同基因拷贝数或表达呈现变化(即，增加或减少)的菌株。亲代酵母菌株是天然地或因诱变能够进行木糖发酵的菌株，但其呈现所鉴定基因野生型的或天然的拷贝数或表达，所述鉴定基因在所述改良酵母菌株中的拷贝数或表达增加或减少。所述改良酵母菌株可衍生自已经通过如下方式使得能够进行木糖发酵的酵母属的亲代酵母菌株重组地纳入(a)编码木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的基因和/或(b)编码一种或多种木糖异构酶(XI)的基因。此外，所述改良酵母菌株还可过表达编码木酮糖激酶(XK)的内源基因或异源基因。一种这样的表达来自树干毕赤酵母的XR和XDH编码基因并过表达内源XK编码基因的酿酒酵母菌株是酵母属菌株LNH-ST (描述于美国专利 No. 7，527，927)。或者，所述改良酵母菌株可衍生自已经通过一种或多种非重组技术，例如适应性进化或随机诱变和选择，使得能够进行木糖发酵的亲代酵母属菌株。然而，应理解，本发明的实施并不受到所用的产生所述亲代酵母菌株和改良酵母菌株的方法的限制。所述改良酵母菌株还可衍生自天然能够进行木糖发酵的假丝酵母属、毕赤酵母或克鲁维酵母属的亲代菌株，或者衍生自已通过重组或非重组手段改良以增强木糖发酵的菌株。对于本文所述的目的，术语“拷贝数增加”是指与所述亲代酵母中的给定基因的拷贝数相比，所述改良酵母中存在相同基因的至少编码区的至少一个额外拷贝。例如，相对于所述亲代酵母菌株中的给定基因的拷贝数，所述改良酵母菌种可含有相同基因的至少编码区的1、2、3、4、5、10或更多个额外拷贝。给定基因的额外拷贝可被整合到所述改良菌株的基因组中，或者存在于所述改良菌株中的一个或多个自主复制载体或质粒中。对于本文所述的目的，术语“表达增加”是指在培养基组成、温度、pH、细胞密度和培养物年龄相同或近乎相同条件下生长时，所述改良酵母中给定基因的转录本水平与所述亲代酵母中的相同基因的转录本水平相比增加至至少约I. 3倍。例如，当在基本相同的培养条件下生长或培养时，在所述改良酵母中给定基因的转录本水平相对于所述亲代酵母中相同基因的转录本水平可以增加至至少I. 3倍、I. 5倍、2. O倍、2. 5倍、3. O倍、4. O倍、5. O倍或10倍。对于本文所述的目的，术语“拷贝数减少”是指与所述亲代酵母中的给定基因的拷贝数相比，所述改良酵母的基因组中存在相同基因的至少编码区减少至少一个拷贝。对于本文所述的目的，术语“表达减少”是指在培养基组成、温度、pH、细胞密度和培养物年龄相同或近乎相同条件下生长时，所述改良酵母中给定基因的转录本水平与所述亲代酵母中的相同基因的转录本水平相比减少至至多约1/2。例如，当在基本相同的培养条件下生长或培养时，在所述改良酵母菌株中给定基因的转录本水平相对于所述亲代酵母菌株中相同基因的转录本水平可减少至至多1/2、1/2. 5、1/3、1/5、1/10、1/20、1/50或更少。在本发明的至少一些实施方案中，改良酵母菌种中所鉴定基因的拷贝数或表达的增加或减少可通过多种随机诱变和选择技术的任一种产生。例如，可对所述亲代酵母菌株进行辐射或化学诱变以建立突变菌株的文库，然后对其筛选所需的改变表型；在本例中，该表型应包括更有效地利用木质纤维素水解产物的木糖组分生长和/或发酵的能力。随机诱变和选择技术还包括“适应性进化技术”或“进化工程技术”。本文所用的术语适应性进化技术是指应用于通过暴露于环境挑战，随后选择具有所需改变表型及相应改变遗传图谱的改良和/或改善的酵母菌株影响酵母菌株或生物体的表型和遗传谱的任何方法或操作。例如，亲代酵母菌株可在含有初始浓度低、然后浓度增加的木质纤维素水解产物的培养基中培养，以产生具有利用所述水解产物中的木糖组分生长或发酵的能力的酵母细胞群，从中可分离个体改良酵母菌株，如实施例I所述。在本发明的至少一些实施方案中，所述改良酵母菌株中所鉴定基因的拷贝数或表达的增加或减少可通过多种遗传工程技术的任一种产生。本文使用的术语遗传工程技术是指用于直接操纵生物体基因的若干公知技术中的任一种。例如，基因敲除(向生物体的染色体中插入无效DNA序列，通常取代内源操作序列)、基因敲入(向生物体的染色体中插入蛋白编码DNA序列)和基因敲低(插入编码反义RNA或小干扰RNA的DNA序列，即RNA干扰(RNAi))技术为本领域所公知。减少基因表达的方法是公知的并可使用本领域已知的多种方法中的任一种进行。例如，可对所述基因进行修饰以破坏转录或翻译起始序列或将移码突变引入编码所述多肽的转录本中。减少基因表达的其它方法包括转录后RNA沉默方法例如反义RNA和RNA干扰(RNAi)。反义技术涉及引入与靶标基因的转录本互补的核苷酸序列，从而使所述互补反义核苷酸序列与所述靶标基因转录本杂交，藉此减少或消除可被翻译为蛋白的转录本的数量。表达反义RNA的实例示于Ngiam et al. (2000)Appl.Environ. Microbiol. 66 (2):775-82 ；和 Zrenner et al. (1993)Planta. 190(2):247-52,各自以引用的方式全文纳入本文。如本领域技术人员所知，RNAi方法包括双链RNA(dsRNA)、短发夹 RNA(shRNA)和小干扰 RNA(siRNA)，例如 Fire et al. (1998)Nature391:806-11;Paddison et al. (2002)Genes Dev. 16:948-58 ;和 Miyagishi et al. (2002)Nat. Biotechnol. 20:497-500的技术。上面引用的参考文献各自的内容以引用的方式全文纳入本文。减少基因表达的方法还包括部分或完全缺失所述基因，以及破坏或取代所述基因的启动子，从而大大减少或者甚至抑制所述基因的转录。例如，可用弱启动子取代所述基因的启动子，如美国专利No. 6，933，133所例示，所述专利以引用的方式全文纳入本文。因此，当所述弱启动子与内源多肽的编码序列可操作地连接时，该基因的转录会大大减少或者甚至被抑制。
在一些实施方案中，已经对所述改良酵母菌株进行遗传修饰以至少部分缺失一个或多个所鉴定基因。本文使用的基因缺失或缺失突变是构成所述基因的部分DNA序列丢失的突变。因此，缺失是导致构成所述基因的DNA序列的完全或部分破坏的遗传材料的丢失或置换。可缺失任意数量的核苷酸，从单碱基到整段染色体。在一些实施方案中，考虑完全或近乎完全缺失所述基因序列。例如，基因的缺失可以是缺失所述基因的至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在本发明的方法中，本发明的改良酵母菌株在木质纤维素水解产物中相对于衍生出所述改良酵母菌株的对应亲代酵母菌株呈现生长增加和/或木糖发酵的比速率增加至至少I. 3倍(例如I. 5倍、2倍或更高)。改良酵母菌株中被调制基因集合本发明的改良酵母菌种在木质纤维素水解产物中的戊糖例如木糖上可以呈现发酵和/或生长增强。所述改良酵母菌株可为酵母属或其它酵母属菌株。在至少一个实施方案中，所述改良菌株衍生自具有插入树干毕赤酵母XYLl (XR)和XYL2 (XDH)基因的遗传修饰的亲代酵母菌株(例如LNH-ST)。在另一个实施方案中，所述改良酵母菌株可为酿酒酵母菌株 Y108-1 (ATCC 保藏号 No. PTA-10567)。相对于在所述亲代菌株中所见的速率，本发明的修饰(通过所述亲代酵母菌株的适应性进化产生)增加了在木质纤维素水解产物中的木糖上的生长速率或对所述木糖的发酵速率。此外，本发明的改良酵母菌株还可减少木质纤维素水解产物中存在的抑制性化合物糠醛和HMF的水平。所述改良酵母菌株(例如Y108-1)可包含一个或多个基因的拷贝数或表达的增加或减少，并且例如在转录、翻译和与所述基因或其编码蛋白有关的活性的水平上的这些调制可导致戊糖(例如木糖)发酵速率增加。在本文研究的酵母菌株中，16个基因在所述改良酵母菌株中相对于所述亲代酵母菌株中呈现拷贝数增加ARE1、VBA3、BIKl、RNQl、FUSl、PDIl、BUD23、IMGU DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C、tE(UUC)B和GLKl。当使用木质纤维素水解产物作为碳源培养时，另外27个基因在所述改良酵母菌株中相对于所述亲代酵母菌株中呈现表达增加HXK2、GRRl、GALl、GAL 7、GALlO, GAL80、PGMl、HXT1、HXT2、HXT3、GAL2、ERGl、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG8、ERGlO、ERG11、ERG20、ERG24、ERG25、ERG26、ERG27、ERG28、HMGl 和 CYB5。这43个基因拷贝数和表达的增加可直接或间接地与所述改良酵母菌株呈现的生长增加或对木质纤维素水解产物中木糖的发酵速率增加有关(参见表I和实施例2、3. 2,4. 2和4. 3)。Liu et al. ((2009)Mol. Genet. Genomics 282:233-44)公开了存在HMF和糠醛的条件下生长后，木质纤维素水解产物耐受的和敏感的菌株之间基因表达的差异。在所述耐受菌株中呈现更高mRNA水平的基因为GLKl和ALD2 ;前者在本公开(上文)中被提到在所述改良菌株中(Y108-1)升高，这能够增强木糖发酵。有趣的是，ALD2在本公开(上文)中被提到在所述改良菌株中拷贝数降减少；然而，Liu等人未研究与木糖发酵有关的基因表达的差异。类似地，Gorsich 等人((2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 71:339-49)公开了 ERG3基因的缺失降低酵母在糠醛存在下的生长，Matsufuji等人((2008) Yeast 25:825-33)公开了 ALD3基因的缺失造成对乙醛的敏感性增加，以及Kawahata等人((2006)FEMS YeastRes. 6:924-36)公开了 ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG24 和 ERG28 的单缺失导致了酵母菌株对有机酸的敏感性增加。有趣的是，尽管Kawahata等人公开了 ERV14基因的缺失也增加对有机酸的敏感性，本发明的改良酵母中ERV14表达减少导致了木质纤维素水解产物的发酵提闻。本发明涵盖有助于产生木质纤维素水解产物中的戊糖例如木糖的发酵速率增加的基因集合，包括被鉴定为拷贝数或表达增加的43个基因中的一个或多个(其中BIK1、GLK1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24和ERG28被包括在含有至少一个其它所鉴定基因集合中)。所述集合可包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42 或全部 43 个所鉴定基因。本文研究的酵母菌株中，12个基因在所述改良酵母菌株中相对于所述亲代酵母菌株中呈现拷贝数减少ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSl、PRP6、YBLlOOff-C,YBR201C-A、ALD3和tE (UUC) G2。当使用木质纤维素水解产物作为碳源培养时，另外14个基因在所述改良酵母菌株中相对于所述亲代酵母菌株中呈现表达减少GAL3、GAL4、GAL11、PGM2、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2 和 REGl。这 26 个基因的拷贝数和表达的减少可直接或间接地与所述改良酵母菌株呈现的生长增加或对木质纤维素水解产物中木糖的发酵速率增加有关(参见表I和实施例2、3. 2,4. 2和4. 3)。本发明涵盖有助于产生木质纤维素水解产物中的戊糖例如木糖的发酵速率增加的基因集合，包括被鉴定为拷贝数或表达增加的26个基因中的一个或多个。所述集合可包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或全部 26个所鉴定基因。本发明还涵盖有助于产生木质纤维素水解产物中的戊糖例如木糖的发酵速率增加的基因集合，包括被鉴定为拷贝数或表达增加的47个基因中的一个或多个与拷贝数或表达减少的26个基因中一个或多个的任意组合。这些组合的集合可包括调制2-73个所鉴
定基因。关于本发明中拷贝数和/或表达增加或减少的个体基因的其它信息是已知的并容易为本领域普通技术人员获得。例如，在本发明的改良酵母菌株中呈现拷贝数或表达改变的个体基因的野生型或天然序列可从公众可获得的来源获得，包括但不限于酵母基因组数据库(S⑶ ;网址为WWW. yeastgenome. org) ；NCBI Entrez基因组计划网站的树干毕赤酵母网页(网址为 www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez db=genomeprj&cmd=Retrieve&dopt=0verview&list_uids=12845)；以及EMBL-EBI真核细胞基因组网站上的乳酸克鲁维酵母(Kluyvermyces Iactis)网页(网址为 www. ebi. ac. uk/2can/genomes/eukaryotes/Kluyveromyces_lactis. html)。基因拷贝数的调制可由本领域普通技术人员通过公知手段测量，例如比较基因组杂交(CGH) ,DNA印迹杂交或基因组DNA的定量实时PCR(qRT-PCR)。实施例3. 2提供了 CGH方法。基因表达的调制还可由本领域普通技术人员通过公知手段分析选择的mRNA或转录本水平来测量，例如如实施例4. 3中所述的定量实时PCR(qRT-PCR)、RNA印迹杂交，或者如实施例4. 2中所述的使用cDNA或寡核苷酸阵列杂交的全基因表达作谱。在至少一种改良酵母菌株中，其亲代酵母属菌株已通过向酵母属菌株的基因组中插入一个或多个拷贝的树干毕赤酵母XYLl (编码木糖还原酶或“XR”)和XYL2 (编码木糖醇脱氢酶或“XDH”)而被遗传改造或改良。本发明的改良酵母菌株呈现XR编码基因和XDH编码基因拷贝数和表达的明显进一步增加。与XR和XDH基因相关的ADHl和⑶C19启动子序列(如图15中质粒pLNH-ST的图谱所示)也呈现拷贝数增加(未直接分析XR和XDH基因的拷贝数，因为其不是天然酿酒酵母基因组的一部分，因此用于测定基因拷贝数的市售寡核苷酸阵列中不存在这些基因的探针)。这与在所述改良酵母菌株中相对于所述亲代酵母菌株中检测到XR和XDH的转录本水平和酶活增加是一致的(实施例4. 3和5，图8和9)。增加戊糖发酵(例如木糖发酵为乙醇)速率的一种方法是降低某些芳香醛例如糠醒的抑制效应。至少一个研究(Almeida et al. (2008)Biotechnol. Biofuels 1:12; seealso Almeida et al. (2008)Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:939-45)公开了糖醒和HMF的解毒需要由XDH的活性产生的NADH辅因子。因此，如启动子拷贝数增加所支持的，XDH活性增加可导致NADH的水平增加以及随后糠醛解毒的增加(Modig et al. (2002) Biochem.J. 363:769-76)。木质纤维素水解产物中的抑制物的解毒会产生木糖发酵增加。表I :在改良酵母菌株中相对于亲代菌株中呈现拷贝数和/或表达增加的基因。系统名称、标准名称和描述来自酵母属基因组数据库(参见URL:yeastgenome. org)。
权利要求
1.一种能够利用木质纤维素水解产物中的木糖生长或发酵的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株包含 (a)选自AREl、VBA3、RNQl、FUSl、PDII、BUD23、IMGU DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C和tE (UUC)B的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(b)选自ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSI、PRP6、YBLIOOff-C、YBR201C-A 和tE(UUC)G2的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。
2.一种能够利用木质纤维素水解产物中的木糖生长或发酵的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株包含(a)选自GALUGAL 7、GAL10、GAL80、PGM1、HXT1、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRR1、ERG1、ERG8、ERG10、ERG11、ERG20、ERG25、ERG 26、ERG27、HMGl 和 CYB5 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(b)选自GAL3、GAL4、GAL11、PGM2、HXT4、HXT5、HXT 6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。
3.权利要求I的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株还包含(a)选自GAL1、GAL7、GALlO、GAL80、PGMl、HXTl、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRRl、ERGl、ERG8、ERGlO、ERGlI、ERG20、ERG25、ERG 26,ERG 27,HMGl 和 CYB5 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(b)选自GAL3、GAL4、GAL11、PGM2、HXT4、HXT5、HXT 6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。
4.权利要求I的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株还包含 (a)选自BIKl、GLK1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24 和 ERG28 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加； (b)ALD3的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。
5.权利要求2的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株还包含 (a)选自BIKl、GLK1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24 和 ERG28 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；或 (b)ALD3的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。
6.权利要求I的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的葡萄糖发酵为乙醇。
7.权利要求2的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的葡萄糖发酵为乙醇。
8.权利要求I的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的阿拉伯糖发酵为乙醇。
9.权利要求2的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的阿拉伯糖发酵为乙醇。
10.权利要求I的改良酵母，其中所述菌株是酵母属。
11.权利要求2的改良酵母，其中所述菌株是酵母属。
12.权利要求10的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的导入基因。
13.权利要求11的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的导入基因。
14.权利要求12的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株相对于所述亲代酵母菌株还包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的导入基因的拷贝数或表达增加。
15.权利要求13的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株相对于所述亲代酵母菌株还包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的导入基因的拷贝数或表达增加。
16.权利要求10的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株包含编码木酮糖激酶以及一种或多种木糖异构酶的导入基因。
17.权利要求11的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株包含编码木酮糖激酶以及一种或多种木糖异构酶的导入基因。
18.权利要求I的改良酵母菌株，其中所述一个或多个基因的拷贝数或表达增加或减少是适应性进化技术的结果。
19.权利要求2的改良酵母菌株，其中所述一个或多个基因的拷贝数或表达增加或减少是适应性进化技术的结果。
20.权利要求I的改良酵母菌株，其中所述一个或多个基因的拷贝数或表达增加或减少是遗传工程的结果。
21.权利要求2的改良酵母菌株，其中所述一个或多个基因的拷贝数或表达增加或减少是遗传工程的结果。
22.权利要求10的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株是LNH-ST。
23.权利要求11的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株是LNH-ST。
24.权利要求22的改良酵母菌株，其中能够将木糖发酵为乙醇的所述改良酵母菌株是Y108-1 (ATCC 保藏号 No. PTA-10567)。
25.权利要求23的改良酵母菌株，其中能够将木糖发酵为乙醇的所述改良酵母菌株是Y108-1 (ATCC 保藏号 No. PTA-10567)。
26.一种能够利用木质纤维素水解产物中的木糖生长或发酵的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株包含 (a)选自AREl、VBA3、RNQl、FUSl、PDII、BUD23、IMGU DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C、tE(UUC) B、GALl、GAL7、GALlO、GAL80、PGMl、HXTl、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRRl、ERGl、ERG8、ERGlO、ERGl I、ERG20、ERG25、ERG 26、ERG 27、HMGl 和 CYB 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；以及(b)选自ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILS1、PRP6、YBL100W-C、YBR201C-A、ALD3、tE(UUC)G2、GAL3、GAL4、GALlI、PGM2、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数或表达减少。
27.一种将木质纤维素水解产物中的木糖转化为发酵产物的方法，包括以下步骤 (a)使所述木质纤维素水解产物与能够木糖发酵的改良酵母菌株接触，其中所述改良酵母菌株相对于衍生出其的亲代酵母菌株包含(i)选自AREl、VBA3、RNQl、FUSl、PDII、BUD23、IMGU DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C、tE(UUC) B、GALl、GAL7、GALlO、GAL80、PGMl、HXTl、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRRl、ERGl、ERG8、ERGlO、ERGlI、ERG20、ERG25、ERG 26、ERG 27、HMGl 和 CYB5 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(ii)选自ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILS1、PRP6、YBL100W-C、YBR201C-A、ALD3、tE(UUC)G2、GAL3、GAL4、GALlI、PGM2、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或者 (iii)同时⑴和( );以及 (b)回收所述发酵产物。
28.权利要求27的方法，其中所述发酵产物是醇或糖醇。
29.权利要求28的方法，其中所述醇是乙醇并且所述糖醇是木糖醇。
全文摘要
公开了一种与亲代菌株相比具有增强的发酵木糖的能力的改良酵母属菌株Y108-1(ATCC保藏号No.PTA-10567)，以及一种使用所述改良菌株共发酵木质纤维素水解产物中的木糖和葡萄糖以产生发酵产物，例如醇或糖醇的方法。
文档编号C12N1/16GK102947440SQ201080060364
公开日2013年2月27日 申请日期2010年12月29日 优先权日2009年12月30日
发明者J·唐纳森, J-M·A·吉尔特曼, G·D·芒克沃德, G·皮若, P·J·迪弗雷纳, L·古达内特-塞维奇 申请人:埃欧金能源公司