专利名称：抗体模拟物支架的制作方法
技术领域：
本文中提供了可用于生成并筛选具有新结合特征的产物的蛋白质支架及其文库。
背景技术：
杂交瘤和重组DNA技术已经导致几种高度成功的治疗性单克隆抗体药物的开发。单克隆抗体(单抗)占1000亿美元生物制剂市场的主要部分，并且预期是接下去十年里生物制剂成长的关键驱动者。然而，尽管有进展和成功，作为生物制剂种类的单抗是昂贵的，并且由于其大小(150kDa)和复杂性(多聚的、糖基化的重和轻链)而难以制造。在功能上，单抗展现出较差的组织渗入，并且Fe区的存在可以导致不期望的Fe受体相互作用和补体激活。为了避开这些问题，已经开发出更小的基于抗体和非抗体的备选形式，称作抗体模拟物(antibody mimetics),其很容易工程化改造并生成。已经显示了与具有可以根据祀标适应性(indication)而化学或遗传纳入的其它效应器功能的传统抗体相比,抗体模拟物展现出相等或卓越的结合亲和力和特异性。已经将几种抗体模拟物支架工程化改造成以与传统抗体匹配的效力和选择性结合治疗性靶物。已经利用免疫球蛋白样折叠，例如纤连蛋白III型、NCAM和CTLA-4来开发抗体模拟物。已经成功验证不含与免疫球蛋白折叠的相似性的其它模拟物支架，并且处于临床前或临床开发。“三指”折叠在来自毒蛇类(Elapid)(海蛇和眼镜蛇(cobra))的蛇毒神经毒素中第一次鉴定，并且已经在此大的多基因超家族中鉴定出超过275种序列，它们都共享共同的结构特征。尽管其相似的结构特性，三指毒素以极度的选择性和高效力结合多种多样的分子靶物。例如，短和长链神经毒素结合a I烟碱乙酰胆碱受体(AChR)，即一种离子通道，蕈毒碱毒素结合毒蕈碱AChR(即一种G偶联蛋白受体(GPCR)), dendroaspin和心脏毒素A5分别革巴向整联蛋白a IIb ￠3和a vP 3,并且I丐抑蛋白(calciseptine)和FS2毒素结合L型钙通道。在哺乳动物中，TFPD主要作为细胞表面蛋白存在，其展现出多种多样的结合特性，包括充当配体诸如尿激酶(尿激酶受体)、TGF-0、激活蛋白、和骨形态发生蛋白(TGF-3受体家族)、和补体蛋白C8和C9 (⑶59)的配体。发明概述本文中提供了特异性结合祀分子的包含三指蛋白质域(three finger proteindomain)的蛋白质支架，例如抗体模拟物支架、编码此类蛋白质的多核苷酸、及使用此类蛋白质例如以治疗和/或诊断人疾病的方法。还提供了此类支架的文库。
因而，提供了一种包含三指蛋白质域(TFPD)的多肽，其中所述TFH)具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合特定的靶分子的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的TFPD结合的靶分子不被天然存在的TFPD结合。在一些实施方案中，修饰在所述TFPD的指I (Fl)、所述TFPD的指2 (F2)、所述TFPD的指3(F3)或两个或更多个选自下组的指的组合中的某个位置处F1、F2、和F3。此类修饰可以是取代或插入，并且可以进一步明确工程化改造或随机生成以覆盖一大批可能的靶分子。在一些实施方案中，TFPD是哺乳动物TFPD。在一些实施方案中，TFPD是人TFPD。在一些实施方案中，人TFPD选自下组Ly-6/uPAR(LU)蛋白质域家族内的基因，其由⑶59、尿激酶受体(uPAR)域I、uPAR域2、uPAR域3、TFPD的TGF- ^受体家族，包括TGFR域I、TGFR 域 2、ACVRl、ACV1B、ACV1C、ACVLl、AMHR2、AVR2A、AVR2B、BMRlB, BMP1A、BMPR2,人 uPAR基因簇的成员，包括 LYPD3-1、LYPD3-2、LYPD4-1、LYPD4-2、LYPD5-1、LYPD5-2、TXlO 1-1、TX101-2、CD177-1、CD177-2、CD177-3、CD177-4 和 LU 家族中含有 TFPD 的其它人基因，包括LYPDl、LYPD2、LYPD6、LPD6B、LY6E、LY6D、LY6DL、LY66C、LY6K、LYG6E、LY65C、LY65B、LY66D、LY6H、LYNXI、PATE、PATEB、PATEDJ、PATEM、PSCA、SLURl、SLUR2、ASPX、HDBPI、SACA4、C9orf57、 和BAMBI组成。另外，在一些实施方案中，TFPD是无活性突变体。另外，提供了包含多个三指蛋白质域(TFPD)的多肽文库，其中所述TFH)具有相对于相应的天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合特定的靶分子的氨基酸序列。还提供了使用三指状蛋白质域(TFPD)作为支架以生成抗体模拟物的方法，包括将氨基酸序列插入所述TFPD的一个或多个指中。在一些实施方案中，TFPD是⑶59或uPAR域3。在一些实施方案中，插入的氨基酸序列是随机序列。还提供了编码本文中所公开的多肽的多核苷酸、和含有此类多核苷酸的载体和宿主细胞。附图简述图I显示了人TFPD序列的比对。自UniProt数据库获得53种含有人TFPD的序列，并进行比对。⑶59和uPAR域3以箭标示。图2显示了物种间TFH)拓扑学保守。自全世界蛋白质数据库获得蛇毒a、人⑶59、和人uPAR域3的结构(分别为pdb登录号liq9、2uwr、和2fd6)。显示了主链多肽链，并且对每种结构显示了三个“指”或环(FI、F2、和F3)。图3显示了人TFPD序列多样性图。比对编码细胞表面受体的可溶性蛋白质或胞外域的17种人TFPD序列，并获得共有序列。显示了所述序列相对于TFPD三个指的位置。如通过Wu-Kabat蛋白质变异性图所显示的，表示每个位置处的序列多样性。图4显示了两种TFPD，即⑶59和uPAR域3在物种间的序列比对。图4⑷显示了⑶59的序列比对,而图4⑶显示了几种物种间uPAR D3的序列比对。SwissProt/UniProtID 表不以下生物体HUMAN,人；A0TTR,桌猴(owl monkey) ；CALSQ,滅(marmoset) ；CERAE,非洲绿猴；MACFA,食蟹称猴(crabeating macaque) ；PAP SP,狒狒(baboon) ;P0NAB,猩猩(orangutan) ;SAISC,松鼠猴(squirrel monkey) ;PANTR,黑猩猩(chimpanzee) ;RABIT,兔；PIG，猪；RAT，大鼠;M0USE，小鼠。图5显示了 h⑶59RGD插入变体的设计。将来自Eristostatin的含有RGD的序列RGDU RGD2、和RGD3(分别由7、9、或11个残基组成)工程化改造入h⑶59的每个指尖中，如显示的。每个指内的插入点以环形残基标示，由此用插入残基取代环形残基。图6显示了 h⑶59及其RGD环插入变体的表达和功能性分析。在用IPTG诱导3_4小时(0D600达到2左右)后，收获携带加有Flag标签的wt⑶59或其RGD环插入变体的HB2151细胞的Iml等分试样。从这点看，从每Iml HB2151细胞提取100 周质级分。图6A中显示了在4-12%Bis-Tris凝胶上分离的来自大肠杆菌表达的wtCD59或CD59F2RGD1、RGD2、和RGD3变体的周质级分，其中通过HPR抗Flag单克隆抗体检测蛋白质表达。给每道上样3. 25 ill周质级分，其中三叶草因子UTrefoil Factor 1，TFF1)作为对照。图6B中显示了对⑶59 F2环插入变体的功能性分析的图，如通过C9或GPIIb/IIIa结合测定法测量的。图6C和6D显示了对Fl和F3环中的h⑶59 RGD插入变体的表达(C)和功能性分析⑶。图7显示了 uPAR域3 (uPARD3)及其F2RGD环插入变体的表达及测试其对GPIIb/IIIa的结合能力。图7A显示了 HB2151周质级分中的加有Flag标签的wt uPARD3和UPARD3F2变体的表达，如通过抗Flag抗体检测的。图7B显示了用于uPARD3 F2 RGD插入 变体的GPIIb/IIIa结合测定法。使用TFFl作为阴性对照。图8显示了 h⑶59 F2 RGD变体对GPIIb/IIIa的竞争性结合能力。将连续稀释的(1:5逐步稀释)竞争物RGD肽Integri I in (整联蛋白)和血纤蛋白原与2. 5 iUCD59/F2/RGD3周质级分一起预温育，然后添加至经GPIIb/IIIa包被的96孔板，接着进行与GPIIb/IIIa结合测定法相同的规程。作为阴性对照，使用2. 5 u Iwt⑶59。图9显示了 Western印迹分析以证明⑶59-pIII融合蛋白在曬菌体颗粒表面上的展示。将2xl09个携带wt⑶59或其RGD变体的噬菌体颗粒或M13K07对照噬菌体在4-12%Bis-Tris凝胶上分离。通过抗pill单克隆抗体和抗Flag抗体探查曬菌体表面上展示的CD59。
图10显示的图显示了对携带Wt⑶59或其RGD变体的噬菌体颗粒的功能性分析。通过C9或GPIIb/IIIa结合测定法来测量噬菌体wt⑶59或其RGD变体对C9或Ilb/IIIa的结合能力。图11显示了噬菌体⑶59F2RGD变体对GPIIb/IIIa的竞争性结合能力。将连续稀释的(I: 10逐步稀释)竞争物R⑶肽Integrilin、和血纤蛋白原及阴性对照KG与噬菌体⑶59/F2/RGD1预混合，然后添加至经GPIIb/IIIa包被的96孔板，接着进行与GPIIb/IIIa结合测定法相同的规程。使用噬菌体wtCD59作为阴性对照。图12描绘了在A)C9和B)GPIIb/IIIa结合测定法后的CD59/F2/RGD1噬菌粒DNA的分析。将等量的噬菌体wt⑶59和噬菌体⑶59/RGD1预混合，并与经C9包被的或经IIb/IIIa包被的板一起温育。在洗去未结合的噬菌体后，用IOmM甘氨酸pH2. 8洗脱结合的噬菌体，并用IM Tris缓冲液pH8.0中和。然后，用洗脱的噬菌体感染指数生长的TGl细胞，在具有氨苄青霉素的2xYT琼脂板上铺板，并于30° C温育过夜。自源自经C9包被的或经GPIIb/IIIa包被的噬菌体洗脱液的每孔板随机挑出20个克隆。将噬菌粒DNA分离，并通过PstI或DraIII消化来分析。具有奇数的孔是PstI消化，而具有偶数的孔是DraIII消化。图13描绘了显示对⑶59/F2/7聚体文库的序列分析的表。对来自⑶59/F2/7聚体文库的超过90个克隆测序。此表显示了 69个符合读码框的序列的7个位置之每处的每种氨基酸(20种氨基酸中)的频率。图14显示了对自F27聚体随机文库表达的⑶59蛋白的Western分析。挑出在HB2151细胞中表达⑶59/F2/7聚体的二十二(22)个个别克隆，并用IPTG诱导。将周质级分分离，并在4-12%Bis-Tris凝胶上分离。用经HRP缀合的抗Flag抗体检测可溶性蛋白质。使用HB2151细胞中的wtCD59周质级分作为阳性对照(“pos”)。图15显示了对GPIIB/IIIa阳性⑶59F27聚体结合剂的特异性和序列分析。图15(A)显示了通过ELISA进一步表征来自初始淘选的6种GPIIb/IIIa阳性结合剂的特异性。用GPIIb/IIIa(特异性靶物)或间皮蛋 白(Mesothelin)(非特异性靶物)或BSA(非特异性靶物)包被Immulon 96孔板。将周质级分分离，并与经靶物或非靶物包被的96孔板一起温育。通过使用经HRP缀合的抗Flag抗体检测结合。数据呈现为ELISA信号，如以OD 405nm测量的。图15(B)显示了阳性结合剂的插入氨基酸序列。顶部序列是具有7聚体插入的亲本序列。X代表20种氨基酸之任一种。以灰色覆盖的区域是在7聚体的任一末端侧翼的部分⑶59序列。C3-C16 :克隆名称。图15(C)显示了通过针对整联蛋白GPIIb/IIIa筛选CD59F27聚体文库获得的三种独特结合剂C3(SEQ ID NO: 111)、CIO (SEQ ID NO: 112)和C16(SEQ ID NO: 113)的全长序列。图16显示了对GPIIB/IIIa阳性⑶59F19聚体结合剂的序列分析。显示了阳性结合剂的氨基酸序列。顶部序列是具有9聚体插入的亲本序列。X代表20种氨基酸之任一种。以灰色覆盖的区域是在9聚体的任一末端侧翼的部分CD59序列。图17显示了对GPIIB/IIIa阳性UPARD3 F29聚体结合剂的序列分析。显示了阳性结合剂的氨基酸序列。顶部序列是具有9聚体插入的亲本序列。X代表20种氨基酸之任一种。以灰色覆盖的区域是在9聚体的任一末端侧翼的部分UPARD3序列。发明详述应当理解，本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建体、和试剂，并且因而可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语仅为了描述特定的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限定。为了描述并公开例如可以结合目前描述的发明使用的在出版物中描述的构建体和方法，在此通过提及而将本文中所提及的所有出版物和专利收入本文。上文及遍及整个文本讨论的出版物仅以其在本申请的提交日前的公开内容提供。凭借在先发明，本文中的任何文字都不应解释为承认发明人没有资格早于所述公开。定义除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文中所描述的那些方法、装置、和材料相似或等同的任何方法、装置、和材料，但是现在描述优选的方法、装置和材料。如本文中及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。如此，例如，提及“抗体”指提及一种或多种抗体，并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。如本文中所使用的，术语“三指状蛋白质域”或“三指状域”或“TFPD”可互换使用，并且指以3个独特的含有P -片层的环或指(在本文中称为指I (Fl)、指2 (F2)和指3 (F3))为特征的特定蛋白质域。通常，TFPD的长度为约60-90个氨基酸，并且以三个形成大的5至6条链的反平行beta-片层的环或“指”为主导。一般地，四个保守的二硫键存在于三个环自此延伸的域基部。第五个二硫化物可以存在于一些TFPD蛋白质中，例如在一些人TFPD的第一个指的尖端。在长链蛇神经毒素中，第五个二硫化物存在于第二环的尖端中。4-5个二硫键的网络对TFPD支架赋予结构稳定性。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经修饰过(例如二硫键形成、糖基化、脂质化(Iipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，诸如与标记构件缀合)的氨基酸聚合物。如本文中所使用的，术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L光学异构体两者，及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单或三字母 代码来指明氨基酸。特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸、和三字母缩写如下A，丙氨酸(Ala) ;C，半胱氨酸(Cys) ;D，天冬氨酸(Asp) ;E，谷氨酸(Glu) ;F，苯丙氨酸(Phe) ;G，甘氨酸(Gly) ;H，组氨酸(His) ;1，异亮氨酸(lie) ;K，赖氨酸(Lys) ;L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨酸(Met) ;N，天冬酰胺(Asn) ;P，脯氨酸(Pro) ;Q，谷氨酰胺(Gln) ;R，精氨酸(Arg) ;S，丝氨酸(Ser) ;T，苏氨酸(Thr) ;V，缬氨酸(Val) ;W，色氨酸(Trp) ;Y，酪氨酸(Tyr);和正亮氨酸(Nle)。术语“域/结构域”指一种稳定的三维结构，而不管大小。典型结构域的三级结构在溶液中是稳定的，并且无论此类成员是分离的还是与其它结构域共价融合的，保持相同。如本文定义的，结构域具有通过二级结构元件，诸如beta-片层、alpha螺旋、和未结构化环的空间关系形成的特定三级结构。在微生物蛋白质(microprotein)家族的结构域中，二硫桥一般是决定三级结构的主要元件。在一些情况中，结构域是可以赋予特定功能活性，诸如亲合性(针对相同靶物的多个结合位点)、多特异性(不同靶物的结合位点)、半衰期(使用结构域、环肽或线性肽)的模块，其结合血清蛋白质样人血清清蛋白(HSA)或IgG (hlgGl、2、3或4)或红细胞。多肽的“折叠”主要以二硫键的连接样式(即1-4、2-6、3_5)限定。此样式是一种拓扑学常数，并且在没有诸如通过还原和氧化(氧化还原剂)解连接和再连接二硫化物的情况中一般不适合转化成另一种样式。一般地，具有相关序列的天然蛋白质采用相同的二硫键合样式。主要的决定因素是半胱氨酸距离样式(rap)和一些固定的非-cys残基及金属结合位点(若存在的话)。在少数情况中，蛋白质的折叠还受到周围序列(即，肽原)及在一些情况中受到容许蛋白质结合二价金属离子(即Ca++)的残基的化学衍生化(即，ga_a-羧化)(这帮助其折叠)影响。对于大多数多肽，不需要此类折叠帮助。然而，根据大得足以给予蛋白质以相当不同的结构的环的长度和组成的差异，具有相同键合样式的蛋白质仍可以包含多个折叠。蛋白质折叠的决定因素是相对于不同折叠极大改变结构的任何属性，诸如半胱氨酸的数目和键合样式、半胱氨酸的间隔、半胱氨酸间环的序列基序(尤其是固定的环残基，其有可能是折叠需要的)，或者钙(或其它金属或辅因子)结合位点的位置或组成的差异。术语“支架”指用于以改编的功能和特征工程化改造新产物，例如蛋白质或抗体模拟物的多肽平台。此类支架可用于构建蛋白质文库。支架通常以序列相关蛋白家族的比对中观察到的保守残基限定。固定的残基可以是折叠或结构需要的，尤其若比对蛋白质的功能不同的话。如此，在设计来自支架的蛋白质时，保留对于框架有利的特性重要的氨基酸残基，而可以将其它残基随机化或突变。蛋白质支架的完整描述可以包括半胱氨酸的数目、位置或间隔和键合样式，及环中的任何固定残基的位置和身份。“随机化”或“突变”意图包括相对于模板序列的一个或多个氨基酸修饰。“随机化”或“突变”意指将此类氨基酸修饰引入序列中的过程。可以经由一般对核酸编码序列的有意的、盲目的、或自发的序列变异来实现随机化或突变，并且可以通过任何技术，例如PCR、易错PCR、或化学DNA合成来发生。“相应的非突变蛋白质”意指除了引入的氨基酸突变外在序列上相同的蛋白质。可以通过取代，即用一种氨基酸替换不同氨基酸来修饰氨基酸。也可以通过插入或删除氨基酸残基来修饰氨基酸。如本文中所使用的，术语“抗体模拟物”或“模拟物”意指展现出与抗体相似的结
合，但是是更小的备选抗体或非抗体蛋白质的蛋白质。如本文中所使用的，“非抗体蛋白质”意指不是由哺乳动物的B细胞天然或在免疫哺乳动物后生成的蛋白质。如适用于蛋白质的，“非天然存在的”意指蛋白质含有至少一个与相应的野生型或天然蛋白质不同的氨基酸。可以使用例如最低最小和概率(sum probability)通过实施BLAST搜索来确定非天然序列，其中比较窗是感兴趣(询问)序列的长度，并且此时使用BLAST 2. 0与Genbank的非冗余(“nr”)数据库比较。BLAST 2. 0算法,其记载于Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。用于实施BLAST分析的软件经由国立生物技术信息中心是公共可获得的。如本文中所使用的，术语“分离的”意指与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在自然界中通常关联的组分(细胞的和其它方面的)分开。术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以实施任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段的编码或非编码区、通过连锁分析限定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。若存在的话，可以在装配聚合物之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸构件中断。可以在聚合后诸如通过与标记构件缀合来进一步修饰多核苷酸。如适用于多核苷酸的，“重组体”意指多核苷酸是生成与存在于自然界中的多核苷酸截然不同的构建体的克隆、限制和/或连接步骤及其它规程的各种组合的产物。“载体”或“质粒”指将插入的核酸分子转移入宿主细胞中和/或在宿主细胞间转移的核酸分子，优选地自我复制型。该术语包括主要发挥将DNA或RNA插入细胞中的功能的载体、主要发挥复制DNA或RNA功能的复制载体、和发挥DNA或RNA转录和/或翻译功能的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。“表达载体”指在导入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意味着由可以发挥功能以生成期望的表达产物的表达载体构成的合适的宿主细胞。“宿主细胞”包括可以是或者已经是主题载体的接受体的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代。后代由于天然的、偶然的、或有意的突变而可以不必与初始亲本细胞完全相同的(在形态学或总DNA互补物的基因组中)。宿主细胞包括在体内用本文中所描述的载体转染的细胞。本文中所描述的宿主细胞的例子是CHO Kl细胞。“药物组合物”意图包括活性剂与药学可接受载体(惰性或活性)的组合，使组合物适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。如本文中所使用的，术语“药学可接受载体”涵盖任何标准的药用载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、和乳剂，诸如油/水或水/油乳剂，及各种类型的湿润剂。组合物还可以包含稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和赋形剂的例子，见Martin, REMINGTON’ SPHARM. SCI.，第 15 版(Mack PubI. Co.，Easton(1975))。
三指状蛋白质域抗体模拟物代表一类新颖的源自非传统的基于抗体的蛋白质域或支架的生物制齐U。稳健的模拟物的结构特征包括固有的总体构象稳定性和耐受在支架内的可变环区的广泛修饰的能力。此类特征容许生成具有新的结合特征的产物的大文库。经由用与新颖的且稳健的模拟物的期望概况(profile) —致的特定结构和功能标准对公共蛋白质数据库进行系统搜索将三指状蛋白质域(TFPD)鉴定为新型抗体模拟物。TFPD是小的，具有约60至90个氨基酸残基，富含二硫化物，包含约4或5个二硫键，并且含有三个独特的含有￠-片层的环或“指”，如图2中所描绘的。三指蛋白质域遍及脊椎动物存在，并且展现出较宽的功能多样性，从有力的且致命的蛇毒(例如a-银环蛇毒素)到生理学重要的细胞表面受体(例如尿激酶受体)。使用与表现良好的模拟物的概况匹配的搜索标准将人TFPD鉴定为潜在的模拟物支架。该标准选择如下的蛋白质域，其是小的(长度为50-100个氨基酸)，稳定的(可溶的，胞外的)，且人起源的。另外，寻找会适合于生成并展示文库以筛选新型靶物，特别地整合膜蛋白，诸如GPCR和离子通道的结构。如此，具有可以在组成上有所变化并且在长度上延伸的环的蛋白质域在某些靶蛋白中找到的结合袋或深裂缝中可以有很大的价值。还已经显示了，源自骆驼(camelid)和鲨鱼的抗体中找到的延伸的⑶R3环也展现出此特征。已经显不了存在于对来自原质团的顶膜抗原(AMAl)特异性的S鱼IgNAR的可变重链中的延伸的CDR3环渗入蛋白质的深疏水性裂缝。TFPD含有三个环区或“指”，并且诱变研究已经显示了牵涉结合靶蛋白诸如乙酰胆碱受体的几种蛇毒素的接触残基驻留于环内。文库设计策略通过构建支架环区内的多样性利用TFPD的天然结合特性。这样做时，认为可以针对过去已经证明难以靶向的蛋白质，诸如整合膜蛋白(例如，G蛋白偶联受体和离子通道)开发出TFPD结合剂。鉴定为潜在的模拟物支架的TFPD包括但不限于那些在图I中所列的。此类TFPD包括 Ly-6/uPAR(LU)蛋白质域家族内的基因，例如 CD59 (SwissProt/UniProt ID#P13987)、尿激酶受体(uPAR)域 I (Q03405)、uPAR 域 2 (Q03405)、和 uPAR 域 3 (Q03405)。TFPD 还包括转化生长因子受体(TGFR)家族内的基因诸如TGFR域I (P36897) ,TGFR域2(P37173)、ACVRl (Q04771)、ACVlB (P36896)、ACVlC (Q8NER5)、ACVLl (P37023)、AMHR2 (Q16671)、AVR2A (P27037)、AVR2B (Q13705) ,BMRlB (P36894) ,BMRlA (000238)、和 BMPR2 (Q13873)。其它TFPD 包括人 uPAR 基因簇的成员诸如 LYPD3-1 (095274)，LYPD3-2 (095274)，LYPD4-1 (Q6UWN0)，LYPD4-2(Q6UWN0)，LYPD5-1(Q6UWN5)，LYPD5-2(Q6UWN5), TX101-1(Q9BY14)，TXl01-2(Q9BY14)，CD177-1 (Q8N6Q3)，CD177-2 (Q8N6Q3)，CD177-3 (Q8N6Q3)和 CD 177-4 (Q8N6Q3)。另外，TFPD 包括 LU 家族的人基因，诸如 LYPD I (Q8N2G4)，LYPD2 (Q6UXB3)，LYPD6 (Q86Y78)，LPD6B (Q3NI32)，LY6E(Q16553)，LY6D(Q14210)，LY6DL(Q99445)，LY66C(095867)，LY6K(Q 17RY6)，LYG6E (Q9UMP8)，LY65C(Q6SRR4)，LY65B(Q8NDX9)，LY66D(095868)，LY6H(094772)，LYNXl(Q9BZG9)，PATE (Q8WXA2)，PATEB (P0C8F I)，PATEDJ(B3GLJ2)，PATEM(Q6UY27)，PSCA(043653)，SLURl(P55000)，SLUR2(Q86SR0)，ASPX(P26436)，HDBPl(Q8IV16)，SACA4(Q8TDM5)，C9orf57(Q5W0N0)和 BAMBI(Ql3145)。另外，人TFPD的无活性突变体也可以充当潜在的模拟物支架。此类无活性的突变体作为潜在的支架是有用的，因为它们容许在仍保留总体构象稳定性的情况中引入具有中 性功能的新结合特征。对于⑶59，已知第24位或第40位的突变生成无活性突变体。在Huang Y等，J.Biol. Chem. (2005)280:34073-79中描述，凭借对人CD59蛋白的丙氨酸扫描显示了与表达CD59野生型的CHO细胞相比，Asp24Ala和Trp40Ala CD59突变体两者在CHO细胞中表达时在其抑制对CHO细胞的补体裂解的能力方面几乎是100%无活性的。另外，在Bodian DL等，J. Exp. Med. (1997) 185:507-16中，实施对人CD59的突变分析，并且对突变体表征功能活性和被活性构象特异性CD59抗体识别的能力。此分析表明CD59突变体Trp40Glu是无活性的，但是仍然正确折叠，如通过构象特异性抗体所测定的。还显示了 hCD59突变体Asp24Arg的活性被破坏,但根据构象灵敏性CD59抗体,仍正确折叠。如此，可以使用无活性CD59突变体作为供展示、文库生成、和筛选用的模板支架。在一些实施方案中，无活性CD59突变体个别和组合具有在位置Asp24和Trp40处的修饰。在一些实施方案中，无活性⑶59突变体可以包含修饰Asp24Ala、Asp24Arg> Trp40Ala> Trp40Glu、或其组合。此外，对于uPAR域3，已经显示了与uPAR 240-248对应的特异性9聚体肽阻断整联蛋白结合，此外在位置245处的单一氨基酸突变体uPAR Ser245Ala完全消除整联蛋白结合和信号传导。如此，在一些实施方案中，可以使用uPAR域3的无活性突变体作为供展示、文库生成、和筛选用的模板支架。在一些实施方案中，uPAR域3的无活性突变体包含在位置Ser245处的修饰，且在一些实施方案中，修饰包含Ser245Ala。还涵盖的是，可以使用来自其它物种的TFH)作为供展示、文库生成、和筛选用的模板支架。图4A显示了来自HUMAN，人；A0TTR，枭猴；CALSQ，狨；CERAE，非洲绿猴；MACFA，食蟹猕猴；PAPSP，狒狒；P0NAB，猩猩；SAISC，松鼠猴；PANTR，猩猩；RABIT，兔；PIG，猪；RAT，大鼠；和MOUSE，小鼠的⑶59的比对。这些物种展现出保守的二硫化物，并且因此应当保留相似的三级结构。相似地，图4B显示了来自几种物种的uPAR域1-3的比对，其也展现出保守的二硫化物。因而，本申请的一方面是包含三指蛋白质域(TFPD)的多肽，其中所述TFH)具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合特定的靶分子的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰在所述TFPD的指I (Fl)、所述TFPD的指2 (F2)、所述TFPD的指3(F3)、或两个或更多个指的组合中的某个位置处。在一些实施方案中，由经修饰的TFPD结合的特定的靶分子不被天然存在的TFPD结合。在一些实施方案中，特定的靶分子包括但不限于感兴趣的蛋白质、核苷酸、抗体、小分子或其它抗原。在一些实施方案中，特定的靶分子是治疗性靶物。通过结合治疗性靶物，经修饰的TFro可以发挥靶蛋白的激动剂或拮抗剂的功能。如此，出于治疗或诊断目的，经修饰的TFPD潜在地用作药用化合物。可以通过用一个氨基酸残基取代不同氨基酸残基，例如通过突变、定向进化、或其它合适的方法来做出修饰。可以选择单一或多个特定氨基酸进行取代或者备选地可以产生随机取代。在一些实施方案中，多肽包含特定的预定取代。在其它实施方案中，多肽包含任何氨基酸残基的随机取代。也可以通过插入氨基酸残基的序列来做出修饰。插入可以小到I个残基。或者，
插入可以是任何长度的。例如，可以将如下文实施例中所描述的7个残基、9个残基、和11个残基的插入物插入F1、F2或F3中。插入也可以在沿着每个指的任何残基间做出。此外，插入可以牵涉取代一个或多个现有的残基以及添加一个或多个氨基酸残基。例如，可以用7个氨基酸残基取代2个氨基酸残基，由此给出5个氨基酸残基的净插入。在一些实施方案中，修饰也可以通过缺失来做出。此类缺失将必须谨慎完成以阻止三维结构的剧烈变化。在一些实施方案中，可以在两个或更多个指的组合中做出修饰。例如，可以在Fl和F2、F2和F3、Fl和F3、或FI、F2和F3中做出修饰。另外，修饰可以取代或插入或其组合。例如，可以在Fl中做出取代，并在F3中做出插入。本申请的另一方面提供了包含多个三指蛋白质域(TFPD)的多肽的文库，其中所述TFPD具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合特定的靶分子的氨基酸序列。此类文库可以包括在单个指，例如F2中产生的随机修饰，或者可以包括在多个指中产生的随机修饰。还提供了编码本文中所描述的多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、和含有这些载体的宿主细胞。多特异性支架双特异性抗体代表一种备选的抗体形式，其可以以单一分子同时靶向并接合两种不同靶分子。可以将多价抗体模拟物的概念延伸至对支架添加效应器功能。例如，已经设计出双特异性模拟物，其中一个域结合人血清清蛋白，由此延长模拟物的半衰期，而另一个域结合IE分子。在另一个实施方案中，也可以用牵涉肿瘤发生的配体工程化改造TFPD。例如，可以用靶向T细胞上的CD3的一个结合域和靶向癌症特异性细胞表面抗原的另一个域来工程化改造TFPD。抗CD3域在T细胞和肿瘤细胞间创建免疫学突触，最终诱导肿瘤细胞中称为凋亡或程序性细胞死亡的自身破坏过程。在一些实施方案中，TFro支架可以进一步包含赋予效应器功能的元件。例如，效应器功能会包括特异性结合人血清清蛋白(HSA)的TFPD结合剂，其延长循环中的TFPD半衰期。在另一个例子中，TFH)可以包含效应器功能，使得它可以与聚乙二醇(PEG)分子或羟乙基淀粉01ES)分子化学偶联以延长循环中的TFPD半衰期。在另一个例子中，将TFPD与免疫球蛋白的Fe区融合以增强Fe y受体(Fe y R)介导的效应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)。在另一个例子中，将肿瘤特异性TFPD与会实现肿瘤特异性TFPD靶向和细胞毒性的细胞杀伤性毒簇化学缀合。在本申请的另一方面，可以在单个域内生成双特异性或多价TFPD，使得个别指或环结合不同靶物。例如，可以生成单个TFPD，使得Fl环结合特定的靶蛋白，而F2环结合不同靶蛋白。或者，可以设计TFPD多聚体，并以融合蛋白表达，其中每个TFPD单体结合不同靶物。例如，可以生成TFPD 二聚体，其中每个TFPD单体结合并阻断肿瘤细胞上过表达的两种不同受体的功能。在另一个例子中，可以生成具有延长的半衰期的TFH) 二聚体，其中一个TFPD单体以高亲和力结合人血清清蛋白，而另一个TFPD单体结合肿瘤细胞上过表达的靶受体。TFPD多聚体的证据实际上来自哺乳动物中的几种TFPD，其以细胞表面受体，例如尿激酶受体(uPAR)和TGF-P受体家族成员的胞外域表达。在uPAR的情况中，已经显示了构成uPAR的胞外区的三个TFPD具有不同结合特性，其中域I和2主要牵涉结合uPAR配体尿激酶，而域3牵涉结合整联蛋白a 53 I。 用途本文中所描述的TFPD支架可用于生成具有新结合特征的蛋白质文库。在一些实施方案中，TFPD支架可用于生成抗体模拟物。此类抗体模拟物可以进化成结合任何感兴趣的靶抗原。这些蛋白质具有优于天然抗体的特性，并且可以在体外快速进化。因而，可以在使用抗体的所有领域，包括在研究、治疗和诊断领域中采用这些抗体模拟物替换抗体。另外，因为这些支架拥有优于抗体的溶解度和稳定性特性，所以也可以在会破坏或灭活抗体分子的条件下使用本文中所描述的抗体模拟物。最后，因为支架容许结合实质上任何化合物，所以这些分子提供完全新的结合蛋白质，其也在研究、诊断和治疗领域中得到应用。在另一个实施方案中，可以在溶液中实施结合靶物。例如，该技术由Viti F等Methods in enzymology (2000)第 326 卷第 480-505 页;Huang L 等 J. of Mol. Recognit.(2005) 18:327-333所描述。携带抗体模拟物支架的噬菌体结合溶液中的生物素化的靶物，然后通过使用经链霉抗生物素蛋白偶联的Dynabeads来捕捉复合物。也可以在细胞表面上实施结合祀物。例如，一种方法已经被描述为使用磁分选技术(Antibody phagedisplay:methods and protocols by Philippe M. O’Brien, Robert Aitken,第 18 章，第219-226页)来选择针对细胞表面抗原的抗体。Eisenhardt SU等(2007，Nature Protocols第2卷3063-3073)也描述了一种如下的方案，其容许选择能够区别细胞表面受体(靶物)的各种构象状态的高度特异性scFv抗体。在一个具体的例子中，可以使用TFPD支架作为选择靶物。例如，若需要结合10个残基的环中呈现的特定肽序列的蛋白质，则构建单一 TFro克隆，其中其环之一已经设置为长度10和期望的序列。将新克隆在细菌中表达并纯化，然后在固体支持物上固定化。然后，容许基于合适支架的噬菌体展示文库与支持物相互作用，然后将其清洗，并将期望的分子洗脱，并再选择，如上文所描述的。类似地，可以使用本文中所描述的支架，例如TFPD支架来寻找与由支架(例如在TFro指中)展示的肽序列相互作用的天然蛋白质。如上文所描述的，将支架蛋白质诸如TFro蛋白固定化，并对噬菌体展示文库针对展示环的结合剂。经由多轮选择富集结合剂，并通过DNA测序来鉴定。基于支架的结合蛋白的定向进化可以在用于进化新的或改善的结合蛋白的任何技术中使用本文中所描述的抗体模拟物。在一个具体的例子中，将结合靶物在固体支 持物，诸如柱树脂或微量滴定板孔上固定化，并将靶物与候选的基于支架的结合蛋白的文库接触。此类文库可以由抗体模拟物克隆，诸如经由TFPD指的序列和/或长度的随机化自野生型TFPD支架构建的TFPD克隆组成。若想要的话，此文库可以由在丝状噬菌体上展示的融合蛋白文库组成，如记载于GPSmith, Science(1985), J McCafferty 等，Nature (1990)或 HB Lowman 等，Biochemistry(1991)的。也可以在酵母[见ET Boder等，Nat. Biotech. (1997)]或哺乳动物细胞(见RR Beerli 等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2008)]表面上，或使用核糖体展不[见 C Zahnd等，Nat. Methods (2007)]在体外展示文库。在另一个例子中，文库可以是例如通过记载于 Szostak 等，美国流水号 09/007,005 和 09/247，190; Szostak 等，W098/31700;及Roberts 和 Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)第 94 卷，第 12297-12302 页的技术生成的RNA-蛋白质融合物文库。或者，它可以是DNA-蛋白质文库(例如，如记载于Lohse, DNA-Protein Fusions and Uses Thereof,美国流水号 60/110，549，美国流水号09/459，190及WO 00/32823)。将融合物文库与固定化的靶物一起温育，清洗支持物以除去非特异性结合剂，并在非常严格的条件下洗脱最紧密的结合剂，并将其进行PCR以回收序列信息或者创建新的结合剂文库，其可以用于在进行或不进行序列的进一步诱变的情况中重复选择过程。可以实施许多选择轮次，直至获得对抗原具有足够亲和力的结合剂。靶蛋白捕捉和检测可以使用选定的TFPD支架结合剂群体来检测和/或定量例如样品诸如生物样品中的分析物靶物。为了实施此类诊断测定法，将选定的针对感兴趣靶物的支架结合剂在合适的支持物上固定化以形成多特征的蛋白质芯片。接着，将样品应用于芯片，并基于固定化的结合剂的靶物特异性鉴定与结合剂联合的样品组分。使用此技术，可以在样品中同时鉴定或定量一种或多种组分(例如，作为实施样品序型分析的手段)。用于靶物检测的方法容许测量结合的蛋白质靶物的水平，并且包括但不限于放射照相术、荧光扫描、质谱术(MS)、和表面等离振子共振(SPR)。使用磷光成像仪系统(Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.)的自体放射照相术可以用于检测并量化革巴蛋白，其已经例如使用35S甲硫氨酸放射性标记。使用激光扫描仪(见下文)的荧光扫描可以用于检测并量化经荧光标记的靶物。或者，可以使用荧光扫描来检测经荧光标记的配体，其自身结合靶蛋白(例如，结合靶物-生物素的经荧光标记的靶物特异性抗体或经荧光标记的链霉抗生物素蛋白，如下文所描述的)。基于其分子量，可以使用质谱术来检测并鉴定结合的靶物。可以直接自芯片表面通过激光辅助实现对结合的靶蛋白的解吸，如下文所描述的。质量检测也容许基于分子量测定靶修饰，包括翻译后修饰，如磷酸化或糖基化。可以使用表面等离振子共振来量化结合的蛋白质祀物，其中将支架-结合剂在合适的金表面(例如，如获自Biacore, Sweden)上固定化。
实施例
对于本领域技术人员会显而易见的是，本文中所描述的实施例和实施方案是作为例示而不是限制性的，并且可以在偏离本发明的精神和范围的前提下使用其它实施例，如权利要求书中所列的。实施例I :通过数据库挖掘鉴定人TFPD支架在搜索公共蛋白质数据库中采用几种标准来鉴定可以充当用于抗体模拟物的良好支架的新型蛋白质折叠。理想地，支架是小的，长度在50和100个氨基酸之间，人起源的以使免疫原性最小化，可溶性的且胞外的以确保容易处理，并且具有已知的三维结构。另夕卜，应当具有如下的数据，其表明蛋白质域的重组形式可以在异源宿主生物体，诸如大肠杆菌或毕赤酵母中以高水平表达。另外，高度期望的是，具有显示支架适合于修饰的诱变或蛋白质工程数据，所述修饰会包括引入新的结合特性。潜在的支架还选择为具有结合靶物的能力，所述靶物过去用传统的基于抗体的方法已经证明是困难的，特别地整合膜蛋白，诸如GPCR和离子通道。支架的此结构和功能适 应性在表明可以将支架再工程化改造成结合多种多样的靶物种类中是重要的。使用上文所概述的标准，自SMART(简单模块结构研究工具(Simple ModularArchitecture Research Tool), 5. I发布)数据库中的752个域鉴定出88个蛋白质域。在将这些域定位至蛋白质结构分类(Structural Classification of Proteins, SCOP)数据库并针对物种间最高度保守的序列进行Blast后，选出17种蛋白质域，并选择三指状蛋白质域[SM001526，Ly-6/uPA受体样域(LU)]以进行作为模拟物支架的实验确认。在SCOP数据库(蛋白质结构分类)内，“蛇毒素样”折叠[编号#57301]由在三个超家族(蛇毒毒素、dendroaspin、和细胞表面受体的胞外域)内的36种蛋白质结构组成。“蛇毒素样”折叠定义为长度为60-75个氨基酸，其中两个beta片层涵盖三个大环或“指”。4-5个二硫化物的网络对TFPD支架赋予结构稳定性。人TFPD支架与鼠Ly-6抗原有关，并且涵盖主要存在于细胞表面受体(例如TGF-beta受体家族、尿激酶受体uPAR)的胞外域内的至少53种已知的人蛋白质及GPI连接的蛋白质(例如⑶59、PSCA)。图I列出了 53种已知的人TFPD序列及其来自UniProt (http://www. uniprot. org/)的登录号。基于大量关于这些蛋白质域已知的结构和功能数据，包括描述无活性突变体的诱变数据，及关于与其相应配体的复合物的结构数据，两个人TFPD域，即CD59和人尿激酶受体中的第三个域(UPARD3)选择为展示候选物。TFPD在物种间共享非常相似的拓扑学(图2)。折叠以4个二硫化物的结构核心区别，自所述结构核心发出三个环或“指”。第五个二硫化物存在于人TFPD的指I中，其可以对此环的远距离部分提供额外结构稳定性。即使TFH)在人TFPD内共享显著相似的拓扑学，存在着大的序列多样性，特别地在三个指区内。图3显示了来自SCOP数据库的17种人TFPD的序列多样性图。高度序列变异反映域的功能多样性及TFPD支架容纳高度修饰同时保留总体构象的能力。大的缺口区趋于存在于环内，指示在组成上的多样性外，指可以耐受可变的长度。TFPD作为模拟物支架的确认牵涉三个阶段。第一，通过插入来自含有RGD的蛋白质eristostatin的7、9、或11个残基对每个指或环测试其容纳尖端区内的额外序列的能力。使用人CD59，表明了每种插入变体的特定整联蛋白结合活性，同时保留对C9补体蛋白的天然结合。另外，还对人uPAR域3的F2环显示了特异性整联蛋白结合。第二，表明了h⑶59野生型和插入变体可以在噬菌体上以gill融合蛋白展示，而且它们维持结合功能性。第三，在hCD59的环2的尖端内构建高度多种多样的随机文库，并且用于筛选可溶性靶蛋白 GPIIb/IIIa。实施例2 :材料和方法质粒构建将所有转基因克隆入pM197噬菌粒载体中。此载体源自pCANTAB5E (Genebank#U14321)，其中用pelB前导序列替换gill信号序列，并将FLAG-标签在E-标签前面插入。为了纯化并检测，使用FLAG或E-标签。人⑶59基因编码77个氨基酸的成熟肽。将人成熟⑶59序列(Gene bank#NM-203330)进行密码子优化以进行细菌表达。生成三个CD59/F2/RGD变体。将来自eristostatin中包含7至11个残基 的RGD环的三个肽插入⑶59的指2 (F2)中，并替换残基Gly32_Leu33 (插入位点)，见图 5。RGD 序列是 VARGDWN(RGDI，SEQ ID NO: 89), RVARGDffND (RGD2, SEQ ID NO: 90)、和RVARGDffNDDY(RGD3, SEQ ID NO:91)。经由 BlueHeron(Invitrogen)合成经密码子优化的野生型CD59和三个CD59/F2/RGD变体。这些基因侧翼有SfiI和Notl，并将它们克隆入pM197中以创建 PGT2042、pGT2043 和 pGT2044。将相同的原则应用于⑶59的指I和指3。将A11D12或N57E58缺失，并用三个RGD序列替换。还生成三个⑶59/F1/R⑶和三个⑶59/F3/RGD变体。为了生成⑶59/F1/RGD变体，合成三对寡聚物GER283 (5，-CGGCCATGGCTCTTCAATGCTACAACTGTCCTAACCCGACTGTGGCACGTGGTGATTGGAATTGTAAAAC CGC-3’，SEQ ID NO:92)和 GER284(5’-GGTTTTACAATTCCAATCACCACGTGCCACAGTCGGGTTAG GACAGTTGTAGCATTGAAGAGCCATGGCCGGCT-3’，SEQ ID NO :93)(对于RGDI) ;GER285(5’-CGGCCATGGCTCTTCAATGCTACAACTGTCCTAACCCGACTCGCGT GGCACGTGGTGATTGGAATGACTGTAAAACCGC-3’，SEQ ID NO: 94)和GER286(5’-GGTTTTACAGTCATTCCAATCACCA CGTGCCACGCGAGTCGGGTTAGGACAGTTGTAGCATTGAAGAGCCATG GCCGGCT-3，，SEQ ID NO: 95)(对于RGD2) ；GER287 (5，-CGGCCCTTCAATGCTACAACTGTCCTAACCCGACTCGCGTGGCACGTG GTGATTGGAATGACGACTACTGTAAAACCGC-3’，SEQ ID NO:96)and GER 288(5，-GGTTTTACAGTAGTCGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGAGTCGGGTTAGGACAGTTGTAGCATTGAAGGGCCGGCT-3’，SEQ ID NO :97)(对于RGD3)。将相应的寡聚物对退火，使得双链片段侧翼有SfiI和SacII，然后将其克隆入pM197中以创建pGT2046、pGT2047和pGT2048。为了生成CD59/F3/RGD变体，还合成三对寡聚物GER289(5’-CGCGTCTCCGTGAAGTGGCACGTGGT GATTGGAATCTTAC-3’，SEQ ID NO:98)和GER290(5’-GTAAGATTCCAATCACCACGTGCCACTTCACGGAGA-3’，SEQ ID N0:99)(对于 RGD1) ;GER291(5’_CGCGTCTCCGTGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGACCTTAC -3’，SEQ ID NO:100)和 GER292(5’_GTAAGGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGTTCACGGAGA-3’，SEQ ID NO: 101)(对于RGD2) ；GER293(5’-CGCGTCTCCGTGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGACGACTA CCTTAC-3’，SEQ ID NO:102)和GER294(5’-GTAAGGTAGTCGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGTTCACGGA GA-3’，SEQ ID NO:103)(对于RGD3)。将相应的寡聚物对退火，使得双链片段侧翼有MluI和SnaBI，然后克隆入PM197 中以创建 pGT2049、pGT2050 和 pGT2051。将人uPAR域3 (gene bank#X51675，含有成熟蛋白质的氨基酸192至283)进行密码子优化以进行细菌表达，并经由BlueHeron(Invitrogen)合成。基因侧翼有SfiI和NotI,并克隆入PM197中以创建pGT2036。为了生成 uPAR D3/F2/RGD 变体，合成三对寡聚物GER297: (5，-CCGGTACTCACGAAGTGGCACGTGGTGATTGGAATAATCA ATCTTATATGGTCCGC-3，，SEQ ID NO:104)和 GER298:(5，-GGACCATATAAGATTGATTATTCCAATCACCACGTGCCACTT CGTGAGTA-3’ , SEQ IDNO:105)(对于 RGD1) ；GER299:(5， -CCGGTACTCACGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGACAATCAATCTTATATGGTCCGC-3’，SEQ ID NO:106)和 GER300:(5’ -GGACCATATAAGATTGATTGTCATTCCAATCACCACGTGCC ACGCGTTCGTGAGTA-3’ , SEQ ID NO:107)(对于 RGD2) ；GER301:(5’ -CCGGTACTCACGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGA CGACTACAATCAATCTTATATGGTCCGC -3’，SEQ ID NO:108)和 GER302: (5，-GGACCATATAAGATTGATTGTAGTCGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGTTCGTGAGTA-3’，SEQ ID NO: 109)(对于 RGD3)。将相应的寡聚物对退火，使得双链片段侧翼有AgeI和SacII，然后克隆入pM197中以创建 pGT2053、pGT2054、和 pGT2055。细囷表达和周质提取将单细菌克隆(来自HB2151细胞)在2ml具有100iig/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37° C温育过夜。将预培养物在具有100 u g/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中以1:100稀释，并于30° C摇动以给出OD6tltl=O. 5。然后，通过添加IPTG (终浓度ImM)来诱导细胞，并于30° C再培养3至4小时，之后收获以进行周质级分提取。使用PeriPr印s周质体提取(periplasting)试剂盒(Epicentre Biotechnologies, Wisconsin)依照制造商的指令来实施周质提取规程。Western印迹将细菌裂解物或重组噬菌体上样，并在4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen, Carlsbad, CA)上分离。经由 iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA)将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上，并立即在0.5%乳PBS中封闭。然后，使用iSNAP装置(Bio-Rad, Hercules, CA)来将膜与经 HPR 缀合的抗 Flag 抗体(Sigma, St.Louis, MO,在 0.05%PBST 中 1:3000) — 起温育 10 分钟。使用 ECL Plus (AmershamBiosciences, Pittsburgh, PA)来检测条带。C9结合测定法用碳酸氢盐缓冲液中的每孔50ng/50iil C9蛋白(来自Quidel，CA)于4° C将Immulon 4HBX板包被过夜。用PBS中的200 U I/孔3%BSA在摇动的情况中将板封闭I小时。将周质样品或噬菌体在期望百分比的PBS内制备为50iU/孔，并于RT温育2小时。然后，使用平板清洗仪(Bio-Tek)用0. 05%PBST(PBS缓冲液中的0. 05%Tween 20)清洗缓冲液将平板清洗4次。在用PBST (0. 05%Tween20)清洗四次后，将50 U I/孔经HRP偶联的抗E-标签抗体(GE，1:5000稀释)或抗Ml3抗体(NEB，1:2500稀释)于RT温育I小时。在添加IOOu I/孔ABTS (Sigma)后测量405nm的吸光度。GPIIb/IIIa结合和竞争测定法将Immulon IB 板用包被缓冲液(20mM Tris, pH 7. 5,150mM NaCl，各 ImM CaCl2,MgCl2、MnCl2)中的每孔 200ng/100 u I GPIIb/IIIa 蛋白(Innovative research Inc,)于4° C包被过夜。将板用包含结合缓冲液(50mM Tris pH 7. 5, IOOmM NaCl，各ImM CaCl2,MgCl2^MnCl2)中的3%BSA的200 yl/孔封闭缓冲液在摇动的情况中封闭I小时。对于直接的结合测定法，在期望百分比的结合缓冲液内制备周质样品或噬菌体(50iU/孔)，并于RT温育2小时。在竞争测定法的情况中，将连续稀释的(I: 10逐步稀释)竞争物RGD肽BHRF1、BHRFl-KG(与KG(因子VIII)连接的BHRF1)和血纤蛋白原、阴性对照KG与周质级分或噬菌体混合，然后添加至经GPIIb/IIIa包被的96孔板上，接着室温温育2小时。然后，使用洗板仪(Bio-Tek)用BB将板清洗4次。在用结合缓冲液清洗四次后，将50 U I/孔经HRP-缀合的抗E-标签抗体(GE，1:5000稀释)或抗M 13抗体(NEB，1:2500稀释)于RT温育I小时。在添加IOOu I/孔ABTS (Sigma)后测量405nm的吸光度。文库构建和克隆通过修饰⑶59的F2域来生成随机文库。将残基Gly32和Leu33缺失，并用7个氨基酸残基插入物替换，其中使用基于三亚磷酰胺(triphosphoroamidite)的合成用所有20种可能的氨基酸随机化每个位置，如此消除移码、终止密码子和自文库过度呈现一些氨基酸。
自Gene-Link Inc. (Hawthorne, NY)合成含有直接链引物的文库5’ -TCGATGCATGCTTAATTACTAAAGCCXXXXXXXCAGGTGTACAATAA ATGT-3’ , SEQ ID NO: 110 ;及互补链5’ -GTTCCAGCGGATCCGGATAC-3’ , SEQ ID NO:111。将文库片段合成，并用pM197作为模板通过PCR(PCR superMix HiFi, Invitrogen)扩增。然后，将此PCR产物用Sphl/Notl双重消化，并克隆入经Sphl/Notl消化的pM197噬菌粒载体中。依照Engberg等及制造提示将所得的连接反应电穿孔入电感受态大肠杆菌TGl细胞(Lucigen, Wisconsin)中，产生文库大小为6. 2xl08。将文库作为甘油储液忙存，拯救，并用于依照标准的方案进行噬菌体生成。文库表征将总共96个克隆随机挑出，并测序以确认插入物大小、移码和7个氨基酸的区域的每个位置的多样性。通过Western印迹来评估⑶59-pIII融合蛋白在噬菌体表面上的展示。使用抗PlII小鼠单抗(NEB，I 1000稀释)和经HRP偶联的山羊抗小鼠IgG (JacksonLab, 1:6000)作为检测试剂。微量滴定板上的文库淘选实施针对GPIIb/IIIa的淘选。用100 iil/孔GPIIb/IIIa蛋白(在包被缓冲液中的5 iig/ml，见GPIIb/IIIa结合测定方法)于4° C将Immulon IB板包被过夜，接着用BB缓冲液进行两次短暂洗涤，并用封闭缓冲液(具有3%BSA的BB缓冲液)于室温(RT)封闭2小时。在用BB缓冲液洗涤后，每孔添加封闭缓冲液中的IO11个噬菌体颗粒，并于RT温育2小时。通过用BBT (0. l%Tween 20) 5次并用BB5次来洗去未结合的噬菌体。用每孔IOOyl0. IM甘氨酸洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体，然后用IOiU IM Tris中和。然后，使用洗脱的噬菌体来感染指数生长的TGl细胞。对于Hyperphage衍生的文库，实施三轮微量滴定板淘选和一轮溶液淘选。实施针对GPIIb/IIIa的噬菌体ELISA以筛选阳性克隆。溶液中的文库淘选使用EZ-Iink NHS-生物素(Pierce, Rockford IL)依照制造商的用法说明书来将GPIIb/IIIa生物素化。将生物素化的GPIIb/IIIa (第I轮淘选50nM ;第2轮20nM及第3轮5nM)与预封闭的7xlOncfu (第I轮淘选，IxlO11Cfu噬菌体(对于第2和第3))噬菌体⑶59/F2/7聚体文库在旋转仪上于室温温育I小时。通过于室温再温育10分钟将噬菌体-靶物混合物在预封闭的经链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠上捕获。用磁性浓缩器实施珠与溶液的分离。然后，用BBT 0. 1%将珠清洗4次，接着用BB进行5次(对于第一轮淘选)。对于第2和第3轮淘选，提高清洗严格性。通过与0. IM甘氨酸缓冲液pH2. 5 一起温育15分钟来洗脱结合的噬菌体，然后用IM Tris中和。然后，使用洗脱的噬菌体来感染指数生长的TGl细胞。对于M13K07衍生的文库，实施三轮溶液淘选。ELISA 筛选在3至4轮淘选后，使用洗脱的噬菌体来感染指数生长的HB2151细胞或DH10BF。将个别克隆在96孔板中的200ul具有100 u g/ml氨苄青霉素和0. 1%葡萄糖的2xYT中温育。将板于37° C在摇动器培养箱中温育3小时。然后，用ImMIPTG于30° C将细胞诱导 3-4小时。将周质级分提取，并在GPIIb/IIIa ELISA中测试。实施例3 :CD59wt和F2RGD夺体的表汰和测试为了测试人TFH)充当用于掺入新结合活性的支架的能力，将一系列源自解联蛋白的肽eristostain (其含有整联蛋白识别序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD))工程化改造入h⑶59的每个指中(图5)。含有RGD的肽是可变长度(7、9、或11个氨基酸)的，并且将其掺入指尖中，如自hCD59结构测定的。将含有hCD59RGD的环插入变体在大肠杆菌中以可溶性的加有FLAG标签的蛋白质表达，并测试CD59活性(结合补体因子C9)和在GPIIb/IIIa ELISA中测试整联蛋白结合(图6)。图6A是来自表达h⑶59野生型(wt)和三种插入指2 (F2)内的hCD59R⑶变体(RGD 1、2、和3)的大肠杆菌的周质级分的提取物的SDS-PAGE凝胶免疫印迹。将野生型和变体以约13kDa的单一种类分泌入周质中。图6B显示了在C9和GPIIb/IIIa结合ELISA中测试hCD59wt和F2RGD变体。CD59wt和含有RGD的变体两者以剂量依赖性方式结合C9，指示所有这些CD59种类已经保留正确的折叠，并展现出天然的⑶59活性。在GPIIb/IIIa ELISA中，RGD变体以剂量依赖性方式结合整联蛋白，而⑶59wt展现出可忽略的结合，如预期的。这支持如下的想法，即可以将⑶59支架工程化改造成在F2环内展现出新的结合活性，而保留天然的C9结合活性。已经通过将相同的RGD环插入序列工程化改造入h⑶59的Fl和F3环区中获得相似的结果(图6C和6D)。另外，已经将相同的RGD环序列克隆入uPAR域3(uPARD3)的F2环中。对大肠杆菌表达的蛋白质测试GPIIb/IIIa结合，并展现出相似的结合(图7)。为了显示⑶59RGD变体对整联蛋白结合的特异性，实施竞争ELISA，其中将固定量的h⑶59wt或⑶59F2RGD3变体结合GPIIb/IIIa，并且与天然配体血纤蛋白原或拮抗剂Integrilin 竞争(图8)。在每种情况中，Ilb/IIIa结合存在着剂量依赖性竞争，指示插入变体以对RGD结合位点的高特异性结合整联蛋白。RGD环插入研究表明，⑶59支架能够容纳F1、F2、和F3环内的修饰，并且支持使用人TFPD作为模拟物支架的想法。数据表明CD59或uPAR域3支架的柔性和将新结合功能性工程化改造入F2环中的能力。实施例4 人⑶59wt和RGD变体可以在噬菌体上展示证实TFH)作为模拟物支架中的下一步骤是证明通过用于筛选文库的展示方法，例如核糖体、细菌、酵母、或哺乳动物展示来呈现支架的能力。在这些方法中，使用噬菌体的细菌展示是用于构建并筛选文库的最流行的且直接的技术。
将加有FLAG标签的h⑶59wt和F2RGD变体克隆入噬菌粒载体中，并在经噬菌体感染的大肠杆菌中作为与噬菌体gill蛋白的融合蛋白(CD59-gIII)表达。在过夜培养后自经感染的大肠杆菌分离表达⑶59-gIII的噬菌体，并通过SDS-PAGE分析(图9)。用抗gill抗体检测CD59-gIII融合蛋白，其以比gill蛋白略高的分子量移动(图9A)。预期相对于gill条带，融合蛋白条带的强度较低，因为⑶59-gIII蛋白以比辅助噬菌体表达的gill蛋白低的水平表达。抗FLAG抗体检出CD59wt和三种含有RGD变体的融合蛋白的强烈条带(图 9B)。显示了表达⑶59-gI 11的噬菌体在结合ELISA中结合C9及GPIIB/II Ia两者，指示蛋白质正确折叠，并且能够展现出野生型RGD结合活性两者(图10)。与用可溶性CD59wt和F2RGD变体蛋白的结果类似，表达CD59-gIII的噬菌体的结合是剂量依赖性的，并且在表达⑶59-gIII RGD变体的噬菌体的情况中，对GPIIb/IIIa的结合对RGD结合位点是特异性的，如通过用已知GPIIb/IIA配体自整联蛋白的竞争替换证明的(图11)。为了评估选择表达特异性结合剂的噬菌体的能力，将等量的表达⑶59 wt和⑶59F2 RGDl的噬菌体混合，然后使用ELISA测定法形式，结合C9或GPIIb/IIIa。将板清洗，将结合的噬菌体洗脱，并用于感染TGl大肠杆菌。对来自每块板的12个克隆的噬菌粒DNA分析显示结合C9板的表达⑶59wt和⑶59 F2 RGDl的噬菌体的比率大致相等(5个wt和7个RGD克隆)(图12A)。然而，结合GPIIb/IIIa板的噬菌体几乎仅含有表达RGD的噬菌体(I个wt和11个RGD克隆，图12B)。结果表明⑶59wt和RGD变体蛋白在噬菌体上以gill融合蛋白展示时保留其结合特性。实施例5 :⑶59F2文库的构津和确认设计TFPD文库，并通过用随机组成的7个氨基酸的插入替换Gly32_Ala33来在h⑶59的F2环尖端内构建。设计与⑶59 F2 RGDl变体类似，其中将7个氨基酸的肽插入F2环内，只是在此情况中，用存在于每个位置处的所有可能的20种氨基酸随机化7聚体的组成。使用三亚磷酰胺化学来合成随机寡核苷酸以使移码最小化，消除终止密码子的出现，并且提供所有20种氨基酸(包括半胱氨酸)的相等呈现。F27聚体文库的理论多样性是
(20)7或约I. 28xl09。通过PCR来扩增随机寡核苷酸混合物，并克隆入pM197噬菌粒载体中。自用载体DNA转化的TGl大肠杆菌分离随机克隆，并表征。在转化TGl细胞后通过有限稀释来将文库大小测定为6. 2xl08。对69个克隆的序列分析显示了每个位置处的氨基酸的预测随机分布(图13)。在转化HB2151细胞后通过对周质提取物的Western分析来将来自表达可溶性CD59的文库的克隆数目测定为约72%(表达蛋白质的22个克隆中的16个)(图 14)。针对GPIIb/IIIa筛选⑶59 F2 7聚体文库，并在三轮淘选后，对选定数目的结合剂确认特异性(图15A)。对6个克隆测序，并且揭示了已知的整联蛋白结合RGD基序(图15B)。图15C中显示了通过针对Ilb/IIIa筛选⑶59 F2 7聚体文库获得的独特结合剂的全长序列SEQ ID NO: 112-114。此数据表明⑶59 F2文库筛选并鉴定选定靶物的有力结合剂的性能，并且确认人TFPD为抗体模拟物支架。实施例6 CD59F1文库的构建和确认设计TFPD文库，并通过用随机组成的9个氨基酸的插入替换Alal2_Aspl3来在 h⑶59的Fl环尖端内构建。设计与⑶59 Fl RGD2变体类似，其中将源自eristostatin的9个氨基酸的含有RGD的序列插入Fl环内，只是在此情况中，用存在于每个位置处的所有可能的20种氨基酸随机化9聚体的组成。F19聚体文库的理论多样性是(20)9或约5. 12xlOn。针对GPIIb/IIIa筛选⑶59 Fl 9聚体文库，并且在三轮淘选后，对选定数目的结合剂确认特异性。对阳性克隆测序，并且揭示了 25种含有已知的整联蛋白结合R⑶基序的独特序列(图16)。此数据表明使用hCD59 TFPD内的Fl环来生成高度多种多样的文库的性能和用Fl文库筛选并鉴定选定靶物的有力结合剂的能力。实施例7 UPARD3 F2 f库的构律和确认设计TFPD文库，并通过用随机组成的9个氨基酸的插入替换人UPAR的第三个域(其中UPARD3的残基I对应于全长UPAR的残基192)内的Pro40_Lys41来在人UPARD3的F2环尖端内构建。设计与UPARD3 F2 RGD2变体类似，其中将9个氨基酸的含有RGD的序列插入F2环内，只是在此情况中，用存在于每个位置处的所有可能的20种氨基酸随机化9聚体的组成。F29聚体文库的理论多样性是(20)9或约5. 12xlOn。针对GPIIb/IIIa筛选UPARD3 F2 9聚体文库，并且在三轮淘选后，对选定数目的结合剂确认特异性。对阳性克隆测序，并且揭不了 2种含有已知的整联蛋白结合RGD基序的独特序列(见克隆序列M B4和 M B7)(图17)。此数据表明hUPARD3 F2文库筛选并鉴定选定靶物的有力结合剂的性能，并且使用此蛋白质家族的不同成员确认TFPD作为模拟物支架的效用。通过提及而将上述说明书中所提及的所有出版物和专利收入本文。本发明所描述的方法的各种修饰和变型在不偏离本发明的范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然本发明已经结合具体实施方案进行了描述，但是应当理解，如要求保护的发明不应过度限于此类具体实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的上文所描述的模式的各种修饰意图在所附权利要求书的范围内。本领域技术人员应当认可，可以仅使用常规的实验便能够确认本文中所描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。所附权利要求书意图涵盖此类等同方案。
权利要求
1.一种包含三指蛋白质域(TFPD)的多肽，其中所述TFPD具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合特定的靶分子的氨基酸序列。
2.权利要求I的多肽，其中所述修饰在所述TFPD的指I(Fl)中的某个位置处。
3.权利要求I的多肽，其中所述修饰在所述TFPD的指2(F2)中的某个位置处。
4.权利要求I的多肽，其中所述修饰在所述TFPD的指3(F3)中的某个位置处。
5.权利要求I的多肽，其中在两个或更多个选自下组的指的组合中做出所述修饰F1、F2、和 F3。
6.权利要求1-5中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列通过一个或多个取代来修饰。
7.权利要求6的多肽，其中所述取代包括随机氨基酸残基。
8.权利要求1-5中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列通过插入来修饰。
9.权利要求8的多肽，其中所述插入是随机氨基酸序列。
10.权利要求8的多肽，其中所述插入是预定的序列。
11.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述TFPD选自下组CD59、尿激酶受体(uPAR)域 I、uPAR 域 2、uPAR 域 3、TGFR 域 I、TGFR 域 2、ACVRI、ACVIB、ACVIC、ACVLI、AMHR2、AVR2A、AVR2B、EMRlB、EMRlA、EMPR2、LYPDl、LYPD2、LYPD3-1、LYPD3-2、LYPD4-1、LYPD4-2、LYPD5-1、LYPD5-2LYPD6、LPD6B、LY6E、LY6D、LY6DL、LY66C、LY6K、LYG6E、LY65C、LY65B、LY66D、LY6H、LYNXl、PATE, PATEB, PATEDJ, PATEM、PSCA, SLURl、SLUR2、ASPX, HDBPl、SACA4、C9orf57、TX101-1、TX101-2、CD177-1、CD177-2、CD177-3、CD177-4、和 BAMBL·
12.权利要求11的多肽，其中所述TFPD是⑶59。
13.权利要求12的多肽，其中所述CD59来自选自下组的物种人、桌猴、狨、非洲绿猴、食蟹猕猴、狒狒、猩猩、松鼠猴、黑猩猩、兔、猪、大鼠和小鼠。
14.权利要求12的多肽，其中所述CD59是无活性突变体。
15.权利要求14的多肽，其中所述CD59无活性突变体包含第24位或第40位的修饰。
16.权利要求11的多肽，其中所述TFPD是uPAR域3。
17.权利要求16的多肽，其中所述uPAR域3来自选自下组的物种人、桌猴、狨、非洲绿猴、食蟹猕猴、狒狒、猩猩、松鼠猴、黑猩猩、兔、猪、大鼠和小鼠。
18.权利要求16的多肽，其中所述uPAR域3是无活性突变体。
19.权利要求18的多肽，其中所述uPAR域3无活性突变体包含第245位修饰。
20.权利要求I的多肽，其中所述天然存在的TFPD不结合所述规定的靶物。
21.权利要求I的多肽，其中所述规定的靶物选自下组感兴趣的蛋白质、核苷酸、抗体、小分子和抗原。
22.权利要求I的多肽，其进一步包含赋予效应器功能的元件。
23.权利要求22的多肽，其中所述元件延长循环半衰期。
24.权利要求22的多肽，其中所述元件容许化学缀合。
25.—种分离的多核苷酸,其编码权利要求1-21中任一项的多肽。
26.一种表达载体，其包含如权利要求25中所限定的核苷酸序列。
27.—种宿主细胞，其包含如权利要求26中所限定的表达载体。
28.一种药物组合物，其包含如权利要求I中所限定的多肽和至少一种药学可接受载体或赋形剂。
29.—种包含多个三指蛋白质域(TFPD)的多肽文库，其中所述TFH)具有相对于相应的天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合特定的靶分子的氨基酸序列。
30.权利要求29的文库，其中随机修饰所述氨基酸序列。
31.权利要求29的文库，其中所述文库包含含有不同经修饰的TFPD的至少100种不同多肽。
32.—种多核苷酸文库，其编码权利要求29的多肽文库。
33.一种包含三指蛋白质域(TFPD)的多特异性多肽，其中所述TFH)具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合两种或更多种特定的靶分子的氨基酸序列。
34.权利要求33的多特异性多肽，其中所述靶分子结合所述经修饰的TFPD的不同指。
35.一种多特异性化合物，其包含两个或更多个三指蛋白质域(TFPD)的融合物，其中所述TFPD具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFPD结合不同靶分子的氨基酸序列。
36.使用三指状蛋白质域(TFPD)作为支架以生成抗体模拟物的方法，包括将氨基酸序列插入所述TFPD的一个或多个指中。
37.权利要求36的方法，其中所述TFPD是⑶59。
38.权利要求36的方法，其中所述TFPD是uPAR域3。
39.权利要求36的方法，其中所述氨基酸序列是随机序列。
40.一种包含三指蛋白质域(TFPD)的多肽，其中所述TFPD具有相对于天然存在的TFPD的氨基酸序列已经进行过修饰，使得经修饰的TFH)结合GPIIb/IIIa的氨基酸序列。
41.权利要求40的多肽，其中所述TFPD具有如SEQID NO: 112中所显示的氨基酸序列。
42.权利要求40的多肽，其中所述TFPD具有如SEQID NO: 113中所显示的氨基酸序列。
43.权利要求40的多肽，其中所述TFPD具有如SEQID NO: 114中所显示的氨基酸序列。
全文摘要
本文中提供了特异性结合靶分子的包含三指蛋白质域的蛋白质支架，例如抗体模拟物支架、编码此类蛋白质的多核苷酸、使用此类蛋白质的方法、及此类支架的文库。
文档编号C12P21/08GK102711811SQ201080060225
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月1日 优先权日2009年10月30日
发明者M.赛托, R.哈金斯, 金夷, 金方 申请人:拜耳医药保健有限公司