一种测定娑罗子提取物纯化过程中多指标成分含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速测定娑罗子提取物七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程中多指标成分含量并快速判断洗脱终点的方法。该方法包括以下步骤：（1）扫描近红外光谱并收集大孔树脂流出液样本；（2）采用参比方法测定样本中多元指标含量；（3）建立大孔树脂纯化过程的近红外多元校正模型；（4）模型评价；（5）洗脱终点快速判断。本发明具有快速、无损、可同时检测多组分等优点，可用于中药生产过程的在线分析，为中药生产质量控制提供一种新的思路。
【专利说明】一种测定娑罗子提取物纯化过程中多指标成分含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药生产过程的质量检测方法，涉及一种近红外光谱技术快速测定娑罗子提取物大孔树脂纯化过程中多指标成分含量的检测方法。
【背景技术】
[0002]近年来，中药注射剂安全性事件频发，不良反应报告的数量也有所增多。中药注射剂生产过程中工况不稳定以及人为操作差异等原因，常常造成中药注射剂质量不稳定，产品安全性无法得到保证，因此，加强中药注射剂生产过程的质量检测对提高中药注射剂的安全性、保障患者的切身利益具有重大意义。
[0003]注射用七叶皂苷钠可用于脑水肿创伤和手术后引起的肿胀的治疗，也用于静脉回流障碍性疾病，其原药材是七叶树科植物天师栗的干燥成熟果实(娑罗子)。娑罗子化学成分复杂，包含皂苷类、黄酮类、香豆素类、有机酸类、留醇类化合物和其他氨基酸等，主要药效成分是α-七叶皂苷钠和β-七叶皂苷钠。药理研究表明，七叶皂苷钠具有很强的消炎、抗渗出、消除肿胀和增加静脉张力及促进淋巴回流的作用。七叶皂苷钠作为娑罗子的主要药效成分，其含量对最终产品药效有着较大的影响，而大孔树脂纯化工艺是影响七叶皂苷钠含量的关键工艺。另外，由于七叶皂苷钠上带有两个糖基，由于工艺的波动，可能会带来糖苷键断裂和糖的生成，检测大孔树脂纯化过程中糖含量的变化有助于了解产品质量变化。固含量也在一定程度上可以明显反应中药生产过程的质量变化。因此，大孔树脂纯化工艺中多指标成分含量的在线检测对于注射用七叶皂苷钠产品质量稳定性研究十分必要。
[0004]目前，传统的测定方法如HPLC，样品处理过程复杂，操作繁琐且分析时间过长，难以实现在线检测。近红外光谱分析技术是一种快速无损的现代分析技术，它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量学等多个学科的最新研究成果，以其独特的优势在石油化工、农业食品、烟草工业以及医药行业等多个领域得到了日益广泛的应用。与传统分析方法相比，近红外光谱技术具有快速分析、样品处理简单等特点，并且近红外光在光纤中具有良好的传输特性，因此可以用于样品的快速检测，非常适合用于中药生产过程的在线分析和远程监控。“一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法”(专利申请号:201010125515.6)通过构建近红外光谱定量校正模型快速计算丹参提取液中鞣质含量，可有效解决丹参提取液中鞣质含量监控问题，保证丹参注射液质量。但是目前还极少有将近红外光谱技术应用于大孔树脂纯化过程的快速检测中，本发明将近红外光谱技术应用于七叶皂苷钠大孔树脂纯化过程在线检测中。文献已报道过采用高效液相色谱法测定注射用七叶皂苷钠中七叶皂苷钠A和B的含量，注射用七叶皂苷钠产品中主要含有七叶皂苷钠Α、Β、C、D，还含有少量的糖元、苷元、脱酰基的降解产物和其他杂质，本发明利用近红外光谱技术对七叶皂苷钠大孔树脂纯化过程中七叶皂苷钠Α、B、C、D以及含糖量和固含量进行同时监测，可以更为全面地评价七叶皂苷钠有效成分含量。此外，高效液相色谱法耗时长，每次分析需要20min，难以达到实时监测的效果，而近红外则可以在Imin内获得各个指标成分的含量结果，可以真正做到实时监测生产过程质量变化，因此，可以更加有效地降低批次间的差异性，有助于提高产品的稳定性、安全性和有效性。
[0005]另外，大孔树脂洗脱终点是大孔树脂纯化过程的一个关键点，洗脱终点的快速判断可以使大孔树脂纯化过程操作更为合理，对实现大孔树脂在线监测具有重要意义。洗脱过程终点是指有效成分含量相对浓度变化率RRCR趋于设定阈值时的取样点。移动块标准偏差法(MBSD法)是一种常用的终点判断方法，已有文献报道采用MBSD法快速判断中药提取终点，但还未见将其用于大孔树脂洗脱过程终点的快速判断中。MBSD法基本原理为:连续几次采集的光谱信号之间的标准偏差变化率小于一定值时，可认为己经到达提取工艺终点。具体操作步骤:首先确定用于计算标准偏差的连续光谱条数n，即确定移动块窗口宽
度，接着计算终点判断开始时测得的η条光谱之间的标准偏差)然后计
I n-\ ，
m
ViSf-
算SJA平均值s —‘ 1其中Xu为第j条光谱在波数i处的吸光度值，为窗口内η条光
" m ,X
谱在波数i处的吸光度值的平均值，m为选取的波数总数。按时间顺序剔除原η条光谱中最早的那条光谱，并加入最后那条光谱的下一条的光谱，重新计算Sp S。依次重复剔除、加入和计算操作，最后对偏差平均值S作图，并根据S的变化率判断提取终点到达与否。本发明将MBSD法终点判断原理应用于七叶皂苷钠大孔树脂纯化过程，可以实现洗脱终点的快速判断。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是提供一种快速测定大孔树脂纯化过程中多种指标成分含量以及快速判断大孔树脂洗脱过程终点的方法；本方法利用化学计量学软件建立大孔树脂纯化过程中多种指标成分含量的近红外校正模型，以快速预测纯化过程中的多指标成分含量，并采用MBSD法快速判断大孔树脂洗脱过程终点，从而实现对大孔树脂纯化过程的在线分析，为产品生产过程的质量控制奠定基础。
[0007]本方案的目的是通过以下技术方案实现:
[0008](I)大孔树脂上样和洗脱过程校正集样本的收集:在大孔树脂上样和洗脱过程间隔0.5h取样。
[0009](2)校正集样本多指标成分含量参照值的测定:
[0010]a) HPLC法测定样本中总七叶皂苷钠和七叶皂苷钠A、B、C、D的含量；
[0011]色谱条件:色谱柱为Phanomenex, C18 (IOOmmX 4.6mm, 2.6 μ m);流动相:A 为 0.5%磷酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱；检测波长:220nm ;柱温:30°C ;流速:lml/min。
[0012]b)用折光计法测定大孔树脂上样和洗脱过程中流出液的含糖量；
[0013]c)用称重法测定大孔树脂上样和洗脱过程中流出液的固含量；
[0014](3)校正集样本近红外光谱数据采集:
[0015]使用近红外光谱仪扫描校正集样本，光谱范围为4000~12000CHT1，得到校正集样本近红外光谱数据。[0016](4)校正模型的建立:
[0017]采用化学计量学软件和偏最小二乘法建立大孔树脂纯化过程中多指标含量多元校正模型。首先对校正集光谱进行异常点判别，去除异常点，同时对光谱数据进行平滑、微分等预处理，并选择合适的波段进行建模。微分可以消除基线漂移，而同时会引入高频噪声，平滑可以有效去除高频噪声对信号的影响。另外，波段选择可以避免引入过多冗余信息，提闻1旲型性能。
[0018](5)校正模型的评价:
[0019]采用相关系数R、交叉验证均方差(RMSECV)、相对分析误差(RPD)等指标来分别评价所建立的各指标成分的校正模型。
[0020](6)校正模型的预测:
[0021]扫描预测集样本的近红外光谱，将所建立的校正模型用于预测集样本中有效成分含量的快速测定。
[0022](7)洗脱终点的快速判断:
[0023]采用移动块标准偏差法(MBSD法)进行洗脱终点快速判断。
【具体实施方式】
[0024]近红外光谱快速检测七叶皂苷钠大孔树脂纯化过程有效成分的方法，其检测步骤如下:
[0025](I)大孔树脂上样和洗脱过程校正集样本的收集:
[0026]收集不同批次大孔树脂上样和洗脱过程中样本80个
[0027](2)校正集样本多指标成分含量参照值的测定
[0028]A.HPLC法测定样本中总七叶皂苷钠和七叶皂苷钠A、B、C、D的含量:
[0029]色谱条件:色谱柱为Phanomenex, C18 (IOOmmX 4.6mm, 2.6 μ m);流动相:A 为 0.5%磷酸溶液，B为乙腈，按表1进行梯度洗脱；检测波长:220nm ;柱温:30°C ;流速:lml/min。
[0030]标准曲线绘制:精密称取七叶皂苷钠对照品124.0Smg置于25mL量瓶中，以甲醇溶解并定容作为储备液。将储备液按梯度进行稀释，配成5个不同浓度的工作液，进样分析，并记录各自峰面积。以色谱峰面积Y对进样浓度X进行线性回归。七叶皂苷钠A的回归方程为:Y=2225.5Χ-4.242，R2=0.9999 ;七叶皂苷钠 B 的回归方程为:Υ=1867.7Χ-17.386，R2=0.9999，结果表明七叶皂苷钠A在192.6~1540.6 μ g、七叶皂苷钠B在140.5~1123.7μ g范围内线性关系良好。
[0031]样品测定:将取得的样品稀释至相应倍数，按照上述色谱条件进行含量测定。
[0032]B.用折光计法测定大孔树脂上样和洗脱过程中流出液的含糖量:
[0033]蘸取样品药液2~3滴，滴于已校正的阿贝折光计棱镜面中央，闭合棱镜，静置lmin。旋调使明暗界限清晰，并使其分界线恰在接物镜的十字交叉点上。读取目镜视野中的含糖量百分数。
[0034]C.用称重法测定大孔树脂上样和洗脱过程中流出液的固含量:
[0035]称定烘干至恒重的西林瓶(两次烘干后重量小于Smg)^，取样品约2mL至扁形瓶，称重X1，水浴蒸干，105°C烘18h，取出置干燥器内冷却30min，迅速称重X2。
[0036]含固量=(X2-X0)/ (X1-X0)[0037](3)校正集样本近红外光谱数据采集
[0038]使用近红外光谱仪扫描校正集样本，光谱范围为4000~UOOOcnT1，扫描次数32次，分辨率8CHT1，得到校正集样本近红外光谱数据。
[0039](4)校正模型的建立
[0040]采用化学计量学软件和偏最小二乘法建立七叶皂苷钠大孔树脂纯化过程中多指标含量多元校正模型。首先对校正集光谱进行异常点判别，去除异常点，同时选择合适的波段，并采用平滑、一阶导数对光谱数据进行预处理，然后采用偏最小二乘法进行定量校正模型的建立。
[0041](5)校正模型的评价
[0042]采用相关系数R、交叉验证均方差(RMSECV)、相对分析误差(RPD)等指标来分别评价所建立的各指标成分的校正模型。大孔树脂上样和洗脱过程模型评价结果分别见表1和表2。
[0043]表1大孔树脂上样过程近红外模型评价
[0044]
【权利要求】
1.一种近红外光谱快速测定七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程中多指标成分含量的方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)校正集样本的收集:收集不同批次七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程流出液样本80个; (2)校正集样本多指标成分含量的测定: a)用高效液相色谱法测定样本中总七叶皂苷钠、七叶皂苷钠A、七叶皂苷钠B、七叶皂苷钠C和七叶皂苷钠D含量； b)用折光计法测定样本中含糖量； c)用称重法测定样本中固含量； (3)校正集样本的近红外光谱采集:使用近红外光谱仪扫描样本，得到近红外光谱数据； (4)校正模型的建立:选择合适的光谱波段和预处理方法，获取特征光谱数据，使用多元校正方法，构建校正集样本上述各指标性成分含量与近红外特征光谱之间的校正模型，用于样本指标性成分含量的预测； (5)校正模型的评价:采用相关系数R、交叉验证均方差(RMSECV)、相对分析误差(RPD)等指标来分别评价所 建立的各指标成分的校正模型； (6)校正模型的预测:扫描预测集样本的近红外光谱，将所建立的校正模型用于预测集样本中有效成分含量的快速测定； (7)洗脱终点的快速判断:采用移动块标准偏差法(MBSD法)进行洗脱终点快速判断。
2.根据权利要求书I所述的一种近红外光谱快速测定七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程中多指标成分含量的方法，其特征在于，采用总七叶皂苷钠、七叶皂苷钠A、七叶皂苷钠B、七叶皂苷钠C和七叶皂苷钠D、含糖量、固含量作为定量指标。
3.根据权利要求书I所述的一种近红外光谱快速测定七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程中多指标成分含量的方法，其特征在于，近红外光谱采集方式及条件为:使用透射法采集近红外光谱，相关参数为:扫描光谱波长范围为4000~UOOOcnT1，扫描次数32次，分辨率8Crn^10
4.根据权利要求书I所述的一种近红外光谱快速测定七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程中多指标成分含量的方法，其特征在于，通过波段优化选择合适的建模波段，并采用一阶导数和平滑对近红外光谱进行预处理。
5.根据权利要求书I所述的一种近红外光谱快速测定七叶皂苷钠大孔树脂上样和洗脱过程中多指标成分含量的方法，其特征在于，应用偏最小二乘法建立多元校正模型。
6.根据权利要求书I所述的快速判断洗脱终点的方法，其特征在于，采用移动块标准偏差法结合近红外光谱快速判断洗脱终点。
【文档编号】G01N21/25GK103808665SQ201310516594
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】薛云丽, 刘雪松, 范艳丽, 丁海婴, 王龙虎, 陈勇, 吴永江 申请人:山东绿叶制药有限公司