专利名称：一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。
背景技术：
心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)是一类严重危害人类生命和身体健康的高风险疾病。目前，已成为我国城市和农村人口的第一大死因，也是造成死亡率最高的非传染性疾病。WHO指出对CVD疾病的早期诊断和预防可有效降低临床突发事件和过早死亡的发生。近年来，多种心血管疾病标志物相继问世，由于大多数能够反映心肌坏死损伤的指标多在心肌发生实质性损伤之后才被检测到，在发病早期很难提供科学的预防依据。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,ΜΡ0)是一种大量存在于嗜中性多核白细胞(粒细胞)的血红素蛋白，其表达和活性增加促进动脉粥样硬化形成，可以诱发心血管功能障碍，进而对心肌造成损伤。人体MPO的表达和释放常在心肌损伤之前，并与其他心肌类标志物无明显相关性，因此对患者心血管疾病的早期诊断和疗效观察具有更加重要的医学价值。MPO被认为是目前最有前景的心脏标记物之一。已被证实患者血清中MPO浓度的升高可作为动脉粥样硬化和冠心病的风险指标，并预示着心肌梗死的早期风险。 近年来，用于临床诊断领域的免疫分析方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫法、荧光免疫法及化学发光免疫法等。放射免疫法检测灵敏度相对不高，又存在一定的放射性污染，已经逐渐被替代；酶联免疫法虽无放射性污染，但受影响因素多，很容易造成结果失真，准确性较差；胶体金法检测速度快，但是稳定性和可靠性不理想；荧光法也存在着稳定性差的缺点。化学发光免疫分析技术是继放免分析、酶免分析、突光免疫分析和时间分辨突光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。它将化学发光分析的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性相结合，与目前常用的其他免疫分析法相比具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、测量线性范围宽、稳定性好，可实现自动化、使用简便、安全、无放射性污染等诸多优点，因此倍受人们的青睐，该技术已广泛应用于传染性疾病、肥胖及相关疾病、内分泌系统、遗传病、肿瘤的早期诊断、动植物检验检疫等众多领域。目前，化学发光免疫分析技术在人MPO免疫分析产品的应用方面仍是空白。本发明所述试剂盒可供开放式化学发光分析仪使用，方法简便快捷，成本低廉，易于在临床诊断和科研工作中推广使用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。本发明的技术方案概述如下
一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组份I)人髓过氧化物酶标准品；2)包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体；3)酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物；5)浓缩洗涤液，其中，所述包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体经过以下步骤制备I)采用pH值为9. 6的50mM碳酸盐缓冲液为溶剂与人髓过氧化物酶单克隆抗体混合，配成浓度为5 μ g/mL的混合液，负载于载体上；2 )用pH值为7. 3-7. 5的PBS或用pH值为7. 3-7. 5的PBST清洗载体；3)将pH值为7. 2-7. 5的封闭液负载于清洗后的载体上；所述封闭液用下述方法制成:取 8gNaCl、l. 43g 无水 Na2HP04、0. 24g 无水 ΚΗ2Ρ04、0· 2g KClUOg BSA、25g 蔗糖及 0. 5mLProclin300,加水 10OOmT,；4)将封闭液倒掉，干燥，得到包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体。
人髓过氧化物酶标准品是用下述方法制成将O. 02mol/L，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将人髓过氧化物酶稀释成浓度为 0、25、64、160、400、1000ng/mL。所述载体为微孔板、磁性颗粒、塑料管或塑料珠。步骤3)用于标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺，(金刚烷)-1，2_ 二氧乙烷、3- (2’ -螺旋金刚烧)_4~甲氧基_4_ (3’ _憐酸氧基)苯基_1，2- _■氧乙烧、CSPD或CDP-Star。所述浓缩洗涤液是用下述方法制成取24g三羟甲基氨基甲烷、160g NaCl,O. 5mLTween-20,0. 5mL Proclin300 加水至 lOOOmL，调节 pH 值为 7. 2-7. 5。本发明的试剂盒采用的是“双抗体夹心一步法”的反应模式，可以对病人血清样本中的人髓过氧化物酶(MPO)分子进行非常专一的定量检测。它既有效地利用了化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，提高了检测的灵敏度，同时也具有稳定性高、特异性好、准确性佳、操作简单及无放射性污染的优点，可为动脉粥样硬化(AS)、急性冠脉综合征(ACS)、冠心病(CAD)等心血管疾病的临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
图1为实施例1所制备的试剂盒中标准品线性图。图2说明了本发明的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒临界值的确定。图3显示了本发明的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒和德国IBL公司MPO酶联免疫测定试剂盒检测103例心血管病人相关性的结果。其中，IBL试剂盒测定的值为X轴，本发明的试剂盒的测定值为Y轴，结果经统计学处理得相关系数 r = 0. 9866，y = 0. 9775x+ll. 633。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组份I)人髓过氧化物酶标准品；2)包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板；3)碱性磷酸酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物AMPH)；5)浓缩洗涤液；6)半成品及成品组成；其中1.人髓过氧化物酶标准品用下述方法制成将O. 02mol/L, pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将人髓过氧化物酶分别稀释成浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL。2.包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备步骤为I)采用pH值为9. 6的50mM碳酸盐缓冲液为溶剂与人髓过氧化物酶单克隆抗体混合，配成浓度为5 μ g/mL的混合液，加入微孔板各孔中，每孔120 μ L，4°C放置24h ；2)用pH值为7. 4的PBS清洗微孔板，清洗3次，每孔每次用300 μ L ;3)将pH值为7. 3的300 μ L封闭液加入每个清洗后的微孔板中，4°C放置过夜，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干，室温除湿干燥24h后立即真空封装，保存于4°C ；所述封闭液是用下述方法制成取8g NaCl、l. 43g无水Na2HP04、0. 24g无水ΚΗ2Ρ04、0· 2gKCl、10g BSA、25g 蔗糖及 O. 5mL Proclin300，加去离子水至 IOOOmL ；3.碱性磷酸酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体人髓过氧化物酶的单克隆抗体用戊二醛交联法与碱性磷酸酶偶联，用pH值为7. 3的PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，用20%牛血清酶稀释液进行稀释至酶标抗体的浓度为1:10000，-200C以下保存；所述20%牛血清酶稀释液的配方为
NaH3PO4 · 2ΗΛO. 2g
Na2HPO1 · 12H20 2. 9gNaCl8.8g
新生牛血清200mL
Proclin300ImL
食品红0.05mL
去离T水 记容至IOOOmL4.上述酶所作用的化学发光底物3- (2’_螺旋金刚烷)-4_甲氧基-4- (3’_磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPro)所述AMPH)化学发光底物的配方为三羟甲基氨基甲烷24g
NaCl160g
KCl4g
Proclin3000. Sg
AMPPD200mL
去离子水定容至IOOOmL5.浓缩洗涤液所述浓缩洗涤液的配方为
二羟甲基氨基甲烷24g
NaCl160g
Tween-200.5raL
Proclin3000. 5mL
去离T水定容至IOOOmL溶解后混合均匀，调整pH至7. 3。6.半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。随机抽取三份进行特异性、精密度、灵敏度及稳定性检验，合格后组装为人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。实验证明用塑料管替代实施例1步骤2的微孔板，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。用磁性颗粒或塑料珠替代实施例1步骤2中的微孔板，并在所述试剂盒中放入空白微孔板或塑料管，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用pH值为7. 3或7. 5的PBS，或7. 3、7· 4或7. 5的PBST替代实施例1步骤2的pH值为7. 4的PBS，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用pH值为7. 2,7. 4或7. 5的封闭液替代实施例1步骤2的pH值为7. 3的封闭液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用(金刚烷)-1，2- 二氧乙烷、CSro或CDP-Star替代实施例1步骤4的3_ (2’-螺旋金刚烧)_4_甲氧基_4_ (3’ -憐酸氧基)苯基-1, 2_ 二氧乙烧,其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用pH值为7. 2、7. 4或7. 5的浓缩洗涤液替代实施例1步骤5的pH值为7. 3的浓缩洗涤液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。实施例2一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组份1.人髓过氧化物酶标准品(同实施例1)2.包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板(同实施例1)3.辣根过氧化物酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体
溶解4mg辣根过氧化物酶(HRP)于ImL去离子水中，加入O. 4mL浓度为5OmM的过碘酸钠水溶液，室温摇动30min，经ImM醋酸钠缓冲液(pH值为4. 4)透析过夜，加入6mgMPO的单克隆抗体，2-8°C震荡过夜，用400 μ L浓度为200mM的NaBH4进行还原，后经pH值为7. 4的O. 02M PBS透析过夜，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并加入等体积甘油，于_20°C条件下保存。4.上述酶所作用的化学发光底物鲁米诺所述鲁米诺化学发光底物的配方为I)化学发光底物A液
鲁米诺1. 77g
4-羟基联苯O. 05g
4-碘苯砸酸O. 012g
砸酸11.4g
硼砂4. 5g
去离子水定容至IOOOmL;溶解后混合均匀，调整pH至8. O。2)化学发光底物B液
过氧化脲O. 34g
吐温-20ImL
Na2HPO4 · 12H20 51. 58g NaH2PO, · 2H,08. 52g
去离子水定容至IOOOmL;溶解后混合均匀，调整pH至7. 6。5.浓缩洗涤液(同实施例1)6.半成品及成品组成(同实施例1)实验证明用塑料管替代实施例2步骤2中的微孔板，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。用磁性颗粒或塑料珠替代实施例2步骤2中的微孔板，要在所述试剂盒中放入空白微孔板或塑料管，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用pH值为7. 3或7. 5的PBS，或7. 3、7· 4或7. 5的PBST替代实施例2步骤2的pH值为7. 4的PBS，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用pH值为7. 2,7. 4或7. 5的封闭液替代实施例2步骤2的pH值为7. 3的封闭液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明用异鲁米诺替代实施例2步骤4的鲁米诺，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；实验证明 用pH值为7. 2、7. 4或7. 5的浓缩洗涤液替代实施例2步骤5的pH值为7. 3的浓缩洗涤液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。实施例3本发明的试剂盒的使用方法以实施例1制备的人MPO化学发光免疫检测试剂盒的使用，具体操作如下I)自4°C冰箱中取出本发明的试剂盒，平衡至室温；2)取一块实施例1步骤2制备的微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；3)在所述微孔板的孔中分别加入浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL的校准品和待测样本各25 μ L，每次实验设空白一孔，随后除空白孔外每孔各加入实施例1步骤3制备的酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体100 μ L ;4)振荡器上振荡30s混匀；5)用封口膜封板,于37°C孵育45分钟；6)甩去反应液，自 动洗板机或手工洗板5次，每次加入稀释好的洗涤液300 μ L，在吸水纸上拍干；所述浓缩洗涤液的稀释方法为使用时与去离子水按1:19体积比进行稀释。7)每孔各加100 μ L实施例1步骤4制备的化学发光底物液，在振荡器上充分振荡混匀，室温(20-270C )避光反应20分钟；8)在化学发光测量仪上依次测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间为I秒/孔；9)以标准品浓度值为横坐标，RLU值为纵坐标绘制标准曲线(参见附图1)。以各待测样本的RLU值在建立的双对数曲线上查出该样本的MPO浓度。实施例4本发明的试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见表1:表I
权利要求
1.一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征包括以下组份1)人髓过氧化物酶标准品；2)包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体；3)酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物；5)浓缩洗涤液，其中，所述包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体经过以下步骤制备1)采用pH值为9.6的50mM碳酸盐缓冲液为溶剂与人髓过氧化物酶单克隆抗体混合，配成浓度为5 μ g/mL的混合液，负载于载体上；2)用pH值为7.3-7. 5的PBS或用pH值为7. 3-7. 5的PBST清洗载体；3)将pH值为7.2-7. 5的封闭液负载于清洗后的载体上；所述封闭液用下述方法制成取 8gNaCl、l. 43g 无水 Na2HP04、0. 24g 无水 ΚΗ2Ρ04、0· 2g KCl、IOg BSA、25g 蔗糖及 0. 5mLProclin300,加水至 10OOmT,；4)将封闭液倒掉，干燥，得到包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于人髓过氧化物酶标准品是用下述方法制成将O. 02mol/L，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将人髓过氧化物酶稀释成浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述载体为微孔板、磁性颗粒、塑料管或塑料珠。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于步骤3)用于标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺，(金刚烧)_1，2_ 二氧乙烧、3_ (2’-螺旋金刚烧)_4_甲氧基_4_ (3’-憐酸氧基)苯基-1,2- 二氧乙烷、CSPD 或 CDP-Star。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液是用下述方法制成取24g三羟甲基氨基甲烷、160g NaCl.O. 5mL Tween-20,0. 5mL Proclin300加水至 lOOOmL，调节pH值为 7. 2-7. 5。
全文摘要
本发明公开了一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组份1)人髓过氧化物酶标准品；2)包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体；3)酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物；5)浓缩洗涤液，本发明的试剂盒可以对病人血清样本中的人髓过氧化物酶(MPO)分子进行非常专一的定量检测。它既有效地利用了化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，提高了检测的灵敏度，同时也具有稳定性高、特异性好、准确性佳、操作简单及无放射性污染的优点，可为动脉粥样硬化(AS)、急性冠脉综合征(ACS)、冠心病(CAD)等心血管疾病的临床诊断提供更为特异、快速、可靠依据。
文档编号G01N21/76GK103033624SQ20121054325
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月16日 优先权日2012年12月16日
发明者单存海, 潘学继, 王立凯, 曹青, 洪宇霞 申请人:天津市协和医药科技集团有限公司