用于伤口愈合的体内基因转移的制作方法

专利名称：用于伤口愈合的体内基因转移的制作方法
用于伤口愈合的体内基因转移本申请是分案申请，原申请的申请日为1997年4月11日，申请号为 971953 . 0(PCT/US97/07301)，发明名称为“用于伤口愈合的体内基因转移”。1.介绍本发明涉及将编码感兴趣治疗蛋白的DNA提呈和直接转移到哺乳动物修复细胞中的新型体内方法。该方法涉及将含有感兴趣DNA的基质(本文称为“基因活化基质”)植入新鲜的伤口部位。正常起源于伤口周围活组织的修复细胞增殖并迁移到该基因活化基质中，在其中它们遇到该DNA，将其吸收并进行表达。转染的修复细胞因此用作原位生物反应器(定位于该伤口部位中)，产生使该伤口愈合的药物(DNA编码的RNA、蛋白等等)。本发明还涉及可以用于实施本发明以转移该感兴趣DNA的药用组合物。这类组合物包括与该感兴趣DNA联用的合适的基质。2.
背景技术：
2. 1 伤口愈合目前可利用的伤口愈合疗法涉及给与治疗蛋白。这类治疗蛋白可以包括参与正常愈合过程的调节因子，诸如系统性激素、细胞因子、生长因子和调节细胞增殖和分化的其它蛋白。报道具有这种伤口愈合能力的生长因子、细胞因子和激素包括例如蛋白转化生长因子-β 超家族(TGF-β) (Cox，D.A.，1995，Cell Biology International，19 :357-371)、 酸性成纤维细胞生长因子(FGF) (Slavin, J.，1995，Cell Biology International, 19 431-444)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和诸如甲状旁腺激素(PTH)之类的钙调节剂。许多问题与在伤口愈合疗法中使用治疗蛋白(即细胞因子)有关。首先，治疗蛋白的纯化和/或重组生产常常是一个昂贵耗时的过程。尽管进行了最大的努力，但是纯化的蛋白制剂常常不稳定，使得贮存和使用麻烦，蛋白的不稳定性可能导致意外的对该宿主有毒的炎症性反应(对于蛋白分解产物)。第二，治疗蛋白(即细胞因子)的系统性传递可能与未受伤组织的严重的不良副作用有关。由于传递到机体特定细胞和组织的效率低，需要给与高剂量的蛋白，以确保足够量的该蛋白到达合适的组织靶。由于蛋白水解降解，所述蛋白在机体内的半衰期短，所述蛋白也必须重复给与，这可能导致对所述治疗蛋白的免疫反应。由于给与的蛋白的多效性，高剂量的治疗蛋白的循环常常是有毒的，并且可能产生严重的副作用。第三，重组蛋白的外源传递的效率低。已经试图通过治疗蛋白的固定化将高剂量的蛋白的给与限制在靶部位。然而，该治疗方法对于重复给药而言使该蛋白的再给与复杂化。第四，对于诸如膜受体、转录因子和胞内结合蛋白之类的各种蛋白而言，生物学活性取决于正确地表达和在该细胞中的定位。对于许多蛋白而言，当所述蛋白在所述细胞内进行翻译后修饰时，发生正确的细胞定位。因此，这类蛋白不能以这一方式外源给与来进行吸收和正确地在该细胞内定位。正如这些问题所证明的，目前用于伤口愈合的重组蛋白疗法是有缺点的，因为它们不能提供一个合理的方法用于传递外源蛋白。这些蛋白(即细胞因子)通常是以生理量在其作用位点产生的，并且有效地传递到细胞表面的信号受体。2. 2基因治疗基因治疗最初设想为将功能活性的治疗基因传递到靶细胞中用于更正遗传缺陷的特异性基因置换疗法。最初对体细胞基因治疗的努力曾依赖于将基因导入组织的间接方法，称为离体基因治疗，例如从机体取出靶细胞，用携带重组基因的载体转染或感染，然后再植入机体中(自体细胞转移)。目前可利用各种各样的转染技术，将DNA体外转移到细胞中；包括磷酸钙-DNA沉淀法、DEAE-葡聚糖转染法、电穿孔、脂质体介导的DNA转移或用重组病毒载体转导。已经提出将DNA转移到各种不同细胞类型的这类离体治疗方案，所述细胞包括上皮细胞(美国专利4，868，116 ；Morgan和Mullligan的W087/00201 ； Morgan 等，1987，Science 237 :1476-1479 ；Morgan 和 Mulligan，美国专利 4，980，沘6 号)、 内皮细胞(W089/05345)、肝细胞(W089/07136 ；Wolff 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :3344-3348 ；Ledley 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5335-5339 ；Wilson 和 Mulligan, W089/07136 ；Wilson 等，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :8437-8441)、成纤维细胞(Palmer 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 :1055-1059 ；Anson 等，1987，Mol. Biol. Med. 4 :11-20 ；Rosenberg 等，1988，kience 242 :1575-1578 ；Naughton 禾口 Maughton， 美国专利4，963，489)、淋巴细胞(Anderson等，美国专利5，399，346号；Blaese，R. Μ.等， 1995，Science 270 :475-480)和造血干细胞(Lim, B.等，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8892-8896 ；Anderson 等，美国专利 5，399，346 号)。最近已经试图用脂质体中捕获的(Ledley等，1987，J. PediatricsllO 1)、或在含有病毒包膜受体蛋白的蛋白脂质体中(Nicolau等，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 80 1068)捕获的DNA制剂以及用偶联到聚赖氨酸-糖蛋白载体复合物的DNA进行体内的直接基因转移。另外，“基因枪”已经用来将基因传递到细胞中(澳大利亚专利9068389号)。甚至已经推测可以在液体载体溶液中配制裸露的DNA或结合脂质体的DNA，以用于注射到胞间隙将DNA转移到细胞中(Feigner，W090/11092)。与目前设计的无论是离体还是体内的基因治疗有关的一个最大的问题，也许是不能有效地将DNA转移到靶细胞群体中，以达到该基因产物在体内的高水平表达。病毒载体被认为是最有效的系统，已经用重组复制缺陷型病毒载体离体和体内转导(即感染)细胞。 这类载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒以及疱疹病毒载体。尽管病毒载体高度有效地进行基因转移，但与其使用有关的主要缺点包括许多病毒载体不能感染非分裂细胞； 与插入诱变有关的问题；对该病毒的炎症性反应和潜在的辅助病毒的产生，和/或有害病毒的产生和传播给其它人类患者。除了大多数细胞类型吸收和表达外源DNA的效率低外，还发现许多靶细胞群体在机体中的数目是如此的低，使得将DNA提呈给特定靶细胞类型的效率甚至进一步减小。目前，没有将DNA导向靶细胞群体的效率提高的方案或方法。3.发明概述本发明涉及将DNA特异性地导向和转移到参与伤口愈合的哺乳动物修复细胞中以在该伤口部位表达治疗产物的新方法。本发明的方法包括将基因活化基质给与到机体的新鲜伤口部位。在这种设定中，修复细胞定位到该伤口部位，在此它们受转染，最后产生DNA 编码的促进伤口愈合的药物(RNA、蛋白等等)。
本发明部分基于下述发现在伤口愈合过程中有活性的修复细胞增殖并从周围组织迁移到该伤口区域，然后浸润该基因活化基质。该基质作为一个支架，促进细胞向内生长，进而通过该DNA附近局部累积修复细胞而促进基因转移。在该基质中，修复细胞令人惊讶地有效吸收该DNA，并将其表达为翻译产物(即蛋白)或转录产物(即反义产物和核酶)。 然后，所述转染的修复细胞作为局部的生物反应器，在体内放大该基因产物的生产。尽管在本方法中可以使用任何数目的DNA序列，但优选的DNA序列是编码翻译产物(即蛋白)或转录产物(即反义产物或核酶)的DNA序列，所述产物(a)促进组织修复； 或(b)能够破坏疾病过程(由此允许正常组织发生愈合)。本发明克服了目前用于涉及给与治疗蛋白的伤口愈合方法的缺点。首先，既稳定又无毒的DNA可以安全地以高剂量体内给与。第二，重复的给药尽管是可能的，但它是不需要的。吸收和表达该DNA的细胞在该伤口部位提供基因产物的供应源。第三，本发明可以以满足短暂给药要求的方式实施。例如，该DNA可以存在于整合到所述靶细胞基因组中的载体中。这样，所有的子细胞都将含有并表达所述转染的DNA，由此作为连续的该治疗药物源起作用。相反，可以利用非整合系统，其中该DNA不整合到该基因组中，该基因不传递给子细胞。在这样一种情况下，当伤口愈合过程完成而不再需要该基因产物时，将不表达该基因产物。通过实施例证明本发明，所述实施例表明基因可以在多种受伤软组织和硬组织中可重现地体内转染和表达。具体地说，表明本发明的方法克服了目前可利用的基因治疗方法相关的问题。本发明方法提供将基因转移到适量的修复细胞中，以实现功能作用，即在无任何医师进一步的寻靶或细胞鉴定的情况下实现。基因治疗的体内方法需要不常起作用的某种形式的寻靶。在本发明方法中，寻靶不是问题。照此类推，该DNA非常象“诱捕器”中的“诱饵”:已经增殖的无意的修复细胞遇到该DNA，然后迁移到该基因活化基质中。这些细胞再意外地能够吸收DNA，并将其表达为治疗剂。在本发明的一个实施方案中，本发明方法用作药物传递系统，通过将DNA转移到哺乳动物修复细胞中，以刺激软组织和硬组织的修复和组织再生。所述修复细胞是正常到达待治疗伤口区域的那些细胞。因此，没有与获得合适的本发明治疗组合物所应该应用于的靶细胞相关的困难。所需的即是将基因活化基质植入该伤口部位。该生物学环境的性质使得合适的修复细胞在医师没有进一步寻靶或细胞鉴定的情况下，主动地吸收和表达该 “诱饵” DNA。在另一实施方案中，采用生物学基质和合成基质的本发明方法可以用来将DNA转移到哺乳动物的修复细胞中，以刺激骨骼再生。在再一实施方案中，采用生物学基质和合成基质的本发明方法可以用来将DNA转移到哺乳动物细胞中，以刺激韧带和腱的修复。采用生物学基质和合成基质的本发明方法还可以用来将DNA转移到哺乳动物修复细胞中，以刺激骨骼肌的修复和/或血管的修复。用于实施本发明的DNA可以包括编码促进组织修复或能够破坏疾病过程的翻译产物(即蛋白)或转录产物(即反义产物或核酶)的任何DNA。例如，该DNA可以包括编码诸如生长因子、细胞因子、激素等等之类的治疗上有用的蛋白的基因。另外，该DNA可以编码反义分子或核酶分子，这些分子可以抑制编码抑制伤口愈合或诱导炎症的蛋白的mRNA 的翻译。
编码感兴趣治疗产物的DNA与基质结合或浸入基质，以形成基因活化基质。一旦制备了该基因活化基质，则将其置于该哺乳动物的伤口部位。通过实施例证明本发明，在所述实施例中证明基因有效地在体内转移到正在修复和再生的组织中并进行表达。3. 1 定义本文所用的以下术语具有下面指出的含义。基因活化基质(GAM)本文定义为含有编码感兴趣治疗剂的DNA的任何基质材料。 例如，将基因活化基质置于哺乳动物宿主机体的伤口部位，以增强伤口愈合。修复细胞本文定义为对组织损伤作出反应而被刺激进行迁移和增殖的任何细胞。 修复细胞是伤口愈合反应的一个组分。这类细胞包括成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、毛细血管外膜细胞、单核炎症细胞、分叶核炎症细胞和肉芽组织细胞。伤口部位定义为该宿主中由创伤性组织损伤产生的或者由外科手术或者诱导或者引起的组织损害产生的任何位置。4.附图描述

图1A.纤维性骨不连合的股骨切骨术模型。在成年不再作为种鼠的(retired)雄性Sprague-Dawley大鼠的股骨手术进行5mm的切骨术。这里所示的裂缝代表整个对照组的特征，哺乳动物宿主或者接受单独的切骨术(n = 3)、切骨术加上胶原海绵(n = 10)或和切骨术加上含有对照(标记基因)质粒DNA的胶原海绵(n = 23)。普通的X光片显示刚刚手术后的对照大鼠的股骨。所述裂缝用由一块板和四个钉构成的外部固定器固定。所述皮肤切口用金属小夹闭合。图1Β.普通X光片，显示手术后9周的对照大鼠股骨切骨术。圆形的手术边缘(箭头)是由反应性骨形成产生的，并与骨不连合性骨折的典型放射照片外观一致。图1C.手术后3周的裂缝组织的组织学切片，显示正在增殖的修复成纤维细胞和包埋在水肿的胞外基质中的毛细血管。也存在由淋巴细胞和巨噬细胞组成的病灶性炎性浸润。图1D.来自9周对照裂缝的组织学切片，显示致密的纤维性组织。Icm = 20 μ m(C 和D)。图2.编码小鼠BMP-4的pGAMl构建物(construct)的示意图。显示CMV启动子、 BMP-4编码序列、HA表位和牛生长激素多腺苷酸化信号的位置。图3A.修复成纤维细胞的BMP-4的表达。在植入含有pGAMl质粒DNA的基因活化基质后4周，利用抗HA抗体和免疫过氧化物酶法在经Bouins固定、脱矿质、石蜡包埋的组织切片中检测到质粒编码的BMP-4的表达。箭头指示成纤维细胞细胞质(左上角的显微照片)的阳性(红褐色)染色的例子。这些细胞基于纺锤形形态、成束生长和I型前胶原免疫染色阳性(未显示)被鉴定为成纤维细胞。与兔免疫前血清或不与第一抗体一起温育的连续切片为阴性。用与抗HA. 11抗体温育的假手术对照(单独的胶原海绵)也获得了阴性结果(右上角的显微照片)。在与该HA. 11抗体温育的对照切片中一致观察到巨噬细胞、破骨细胞和成骨细胞的假阳性染色。左下角的显微照片中显示了 PGAMl转移后3周新形成的骨岛。新骨与肉芽组织的形成有关。在右下角的显微照片中显示新形成骨的高倍视图。箭头指示新的骨小梁表面上推定的成骨细胞。用苏木精和曙红(上部显微照片)或用Gomori三色法(Gomori trichrome mothod)将裂缝组织染色(富含胶原蛋白的组织出现绿色，下部显微照片)。Icm = 20mm(上部显微照片)。图3B.该动物的平片放射照片(手术后23周)。在平片放射照片(左图)中，箭头指示该切骨术裂缝的大致位置，该裂缝充满放射性密集的组织。请注意，已经除去了外部固定器。案如杂色图示所表明的，发生骨质重建。箭头指出邻近该裂缝处的骨中缺损(放置钉的结果)。这时两个远侧钉子部位完全愈合(未显示)。全封固照片(右图)显示来自所示动物裂缝的Gomori三色染色的组织切片(处死后)。箭头指出该裂缝，它由于充分整合的骨皮质而成为平面。骨髓间隙(或该裂缝间隙)中的圆形缺损由放置最内侧的固定器的钉子而产生。显微照片底部的组织破裂是样品处理的人工产物。图4A.编码人PTH1-34的pGAM2构建物的示意图。显示驱动PTHl-M表达的上游长末端重复(箭头)、ΡΤΗ1-34编码序列、驱动neo表达的SV40启动子(箭头)、ne0编码序列、pBR序列和下游长末端重复的位置。图4B. PTH1-34的基因转移和表达驱动体内的新骨形成。平片放射照片显示在接受含有pGAM2质粒DNA的基因活化基质的动物中植入后9周时5mm的切骨术裂缝的新骨桥连(bridging)。箭头指出该裂缝中的放射性密集的组织。这里所示的结果代表用另一只动物试验的特征。图5.通过双质粒GAM的体内新骨形成。(顶部)平片放射照片显示在接受含有 PGAMl加上pGAM2质粒DNA的基因活化基质的动物中植入后4周时5mm裂缝的新骨桥连。 箭头指出该裂缝中的放射性密集的组织(组织学上证明为骨)。(底部)除去该外部固定器后(5周前；总共为手术后17周)，顶部照片中所示裂缝的平片放射照片。箭头指出该裂缝的位置，该裂缝除在近侧手术边缘附近有一条矿质化不足的组织外，其中充满放射性密集的组织。正如杂色图案所示，发生广泛的重建反应。这里所示结果代表用另一只动物进行实验的特征。图6.腺病毒介导的体内将基因转移到骨修复和再生细胞中。将UltraFiber 植入物在AdCMVlacZ病毒溶液(IOici-IO11空斑形成单位或PFU/ml)浸泡6分钟，然后植入该切骨术部位。让该缺损愈合3周，在此期间通过每周的放射照片检查监测该伤口的愈合反应进程。到3周为止，估计该缺损的40%充满骨痂组织。处死该哺乳动物宿主，将组织在Bouins 固定液(fixation)中固定，然后采用标准甲酸溶液脱矿质7天。拍摄手术后3周时在该切骨术部位中形成的新骨(骨痂)横切面的显微照片。左上图请注意来自UltraFiber 腺病毒植入物的骨痂组织细胞的阳性(红色)β -gal细胞质染色。该结果表明骨折愈合过程中骨痂细胞(至少一个群体)表达介导感染并由此介导病毒转导的细胞表面受体。左上图用β-gal抗体载体加上非特异性兔LgG抗体混合剂(cocktail)染色的连续切片的阴性对照。下图注意到在充满UltraFiber 和AdRSVntlacZ的切骨术部位中软骨细胞的阳性(红色)β-gal核染色。该结果证明该抗β-gal抗体灵敏的特异性，并确实证明该切骨术裂缝中该标记基因产物的表达。图7. pGAM2质粒基因转移到修复成纤维细胞导致该大鼠切骨术模型中的新骨生长。平片放射照片显示接受含有PGAMl加上pGAM2质粒DNA的基因活化基质的动物中植入后6周时5mm裂缝的新骨桥连。箭头指出该裂缝中放射性密集组织(组织学证明为骨)。5.发明详述
本发明涉及将DNA提呈和转移到哺乳动物修复细胞中以表达治疗剂的体内方法。 本发明方法涉及将基因活化基质植入或置于新鲜的伤口部位。伤口愈合通常是协调固定不变的事件顺序，包括(a)组织破坏和正常组织结构的丧失；(b)细胞坏死和出血；止血(形成血块)；(c)分叶核炎症细胞和单核炎症细胞的浸润，同时血管充血和组织水肿；(d)单核细胞(巨噬细胞)溶解该血块以及损伤细胞和组织 (e)形成肉芽组织(纤维组织形成和血管生成)。已经在大量哺乳动物种中产生的所有组织和器官的伤口中观察到这种细胞事件的顺序(feiilet等，1994，Curr. Opin. Cell. Biol. 6 717-725)。因此，上述细胞顺序是所有哺乳动物组织修复的普遍方面。本发明基于以下发现参与伤口愈合过程的修复细胞通常增殖并迁移到组织损伤部位，并浸润该基因活化基质。令人惊讶的是，通常难以有效地体外或体内转染的这些修复细胞被该伤口愈合过程激活增殖时，极其有效地吸收和表达DNA。利用该特征，设计本发明方法以有效地将一种或多种编码治疗剂的DNA分子转移到正在增殖的修复细胞中。所述方法涉及在哺乳动物宿主的伤口部位给与含有编码翻译产物(即治疗蛋白)或转录产物(即反义产物或核酶)的基因活化基质。该伤口可以由创伤性组织损伤产生，或者由外科手术诱导或引起的组织损伤产生。当增殖中的修复细胞迁移到基因活化基质中并与其接触时，它们吸收并表达感兴趣DNA，由此放大该治疗剂(蛋白质或RNA)的量。所述转染的修复细胞因此作为局部的生物反应器起作用，产生影响该局部修复环境的治疗剂。例如所述转染修复细胞产生的生长因子或细胞因子将结合并刺激表达同源细胞表面受体的靶效应细胞，由此刺激和放大与伤口愈合过程正常相关的生理事件级联。另一方面，所述修复细胞可以吸收并表达抑制伤口愈合过程拮抗剂活性的蛋白质的编码DNA。该DNA也可以编码反义或核酶RNA分子，这些分子可以用来抑制编码炎症蛋白或抑制伤口愈合或引起过度纤维化的其它因子的mRNA的翻译。可以采用各种各样的技术，将本发明的基因活化基质转移给所述患者。例如，当刺激伤口愈合和再生时，可以将所述基质直接转移到该伤口部位，即骨折的骨、损伤的结缔组织等等。对于皮肤修复方面的使用，将于皮肤表面给与所述基质。对于器官再生方面的使用，将所述基质手术置于该器官的伤口中。由于本发明方法基于修复细胞正常迁移到伤口部位并进行增殖，以及浸润到位于该伤口部位的基因活化基质中，然后吸收DNA，因此应该理解，所述基质必须转移到机体已经诱导上述愈合过程的部位中。本发明的一个特别重要的特征在于，可以工程改造该修复过程，以导致或者形成瘢痕组织和/或者组织再生。例如，所述治疗蛋白在该伤口部位的过量表达可以导致损伤组织再生，而不形成瘢痕组织。在诸如骨修复的许多情况下，需要这种再生，因为瘢痕组织不能理想地用来支持正常的机械功能。另一方面，可能希望在缝线周围形成疤痕组织，以将固有的弱组织保持在一起。因此，本发明方法可以用来刺激伤口愈合，或者形成瘢痕组织， 或者不形成瘢痕组织，这取决于所表达的治疗蛋白的类型和水平。将质粒DNA直接从基质转移到哺乳动物修复细胞中通过促进刺激伤口愈合过程， 具有多种优点。首先，与昂贵的常规蛋白质生产方法的相比，有利的是DNA构建物的产生和纯化容易。第二，基质可以用作其中或其本身促进细胞向内生长并增殖的结构支架。因此，它们促进基因转移靶向修复细胞。第三，直接基因转移可能是药物传递的一个良好方法，用以传递正常进行复杂的生物合成加工的分子或必须正确定位于细胞膜中的受体。这些类型的分子如果外源传递到细胞，则不能起作用。本发明也涉及药用组合物，它包含含有用于伤口愈合的DNA的基质。本发明的组合物一般由生物相容的、或骨相容的基质材料组成，所述材料含有编码感兴趣治疗蛋白的 DNA。本发明克服了与目前用于伤口愈合应用的重组蛋白治疗具体相关的缺点。首先， 直接基因转移是一个合理的策略，它允许转染的细胞(a)制造生理量的、以组织特异性和顺序特异性(context-specific)方式修饰的治疗蛋白，以及(b)在适当的环境下将该蛋白传递到合适的细胞表面信号受体。由于上述原因，预期这类分子的外源传递与显著的给药和传递问题有关。第二，重复的给药尽管是可能的，但用基因活化基质技术并不需要重复给药可以用很好建立的缓释传递技术精细地控制细胞摄取DNA，或者转染DNA的整合可能与长期的重组蛋白表达有关。本发明方法可以普遍适用于涉及许多不同的细胞、组织和器官的伤口 ；肉芽组织的修复细胞(feiilet等，1994，Curr. Opin. Cell. Biol. 6 :717-725)是使用本发明方法的靶。 本文在3种动物模型(狗、大鼠和兔)和5种组织(骨、腱、韧带、血管和骨骼肌)中，应用三种标记基因(β-半乳糖苷酶、荧光素酶和碱性磷酸酶)、三种启动子系统(CMV、RSV、LTR和 SV40)、两种类型的基质(生物学的和合成的)证明了本发明。在所有情况下，迁移到该基因活化基质中的修复细胞都被成功地转染。详细地说，在将或者编码BMP-4的质粒构建物、或者编码PTH1-34的质粒构建物基因转移到修复成纤维细胞后，功能性结果(骨生长)已得到证实，其中BMP-4作为成骨细胞分化和生长的信号传导开关起作用(WoZney，1992，Mol. Reprod. Dev. 32 :160-167 ；Reddi,1994, Curr.Opin.Genet. Deve. 4 :737-744)， M PTH1-34 募集(recruit)骨原细胞(Orloff 等，1992，Endocrinology 131 :1603-1611 ；Dempster 等 1995，Endocrin. Rev. 4 :247-250)。51所述基因活化基质可以按照本发明配制和使用任何生物相容性的、含有编码感兴趣治疗剂的DNA的基质材料，所述感兴趣治疗剂诸如翻译产物(即治疗蛋白)或转录产物(即反义分子或核酶)。本发明的基因活化基质可以得自任何生物相容材料。这类材料可以包括(但不限于)生物可降解性或非生物可降解性材料，所述材料配制成支持细胞附着和生长的支架、 粉末或凝胶。基质可以得自合成聚合物或天然存在的蛋白，诸如胶原、其它胞外基质蛋白或其它结构大分子。加入该基质中的DNA可以编码各种治疗剂中的任何一种，这取决于设计的治疗用途。这类蛋白可以包括生长因子、细胞因子、激素或能够调节细胞生长、分化或生理功能的任何其它蛋白。所述DNA也可以编码反义分子和核酶分子，所述分子抑制抑制伤口修复和 /或诱导炎症的蛋白的翻译。所述转染DNA不需要整合到靶细胞中，实际上，在该基因活化基质中使用非整合性DNA是本发明的最佳实施方案。这样，当伤口愈合过程完成，不再需要该基因产物时，将不表达该基因产物。
含有生物相容性基质和DNA的治疗药盒为本发明另一方面。在某些情况下，所述药盒含有预形成的基因活化基质，由此允许医师直接在机体内给与该基质。或者，所述药盒可以含有形成基因活化基质所必需的组分。在这种情况下，在医师可以混合所述组分以形成该基因活化基质，然后该基因活化基质可以通过置于机体内而用于治疗。在本发明的一个实施方案中，所述基质可以用来包被外科装置，诸如缝合材料或植入物。在本发明的再一实施方案中，基因活化基质可以包括现成可用的海绵、管、急救绷带、冻干组分、凝胶、贴剂或粉末和telfa pad。5. 1. 1所沭基质材料在本发明的一个方面，制备这样的组合物，其中编码该感兴趣治疗剂的DNA与基质结合或浸渍到基质中，以形成基因活化基质。所述基质组合物的功能是(i)促进修复细胞的向内生长(寻靶)；和(ii)含有DNA(传递)。一旦制备该基因活化基质，则将其贮存以备将来使用，或立即置于该伤口部位。可以用于本发明的组合物、装置和方法中的基质的类型事实上是无限制的，可以包括生物学基质和合成基质。该基质具有通常与“生物相容”有关的所有特征，因为当将其给与哺乳动物宿主时，它不产生负反应、过敏反应或其它不良反应。这种基质可以由天然材料或合成材料制成。在希望在机体内留下持久结构的情况下，所述基质可以为非生物降解性的；或当仅需要短期表达该治疗蛋白时，所述基质可以为生物降解性的。所述基质采用海绵、植入物、管、telfa pad、急救绷带、绷带、垫、冻干组分、凝胶、贴剂、粉末或纳米粒子 (nanoparticle)形式。另外，基质可以设计为允许在较长时间内缓释该DNA。根据具体情况和待治疗伤口的部位，基质材料的选择会不同。可以使用诸如美国专利5，270，300(通过引用结合到本文中)中描述的那些基质。正如本领域技术人员众所周知的，在基质的选择上，可以考虑物理和化学特性，诸如生物相容性、生物降解性、强度、 刚度、界面性质和甚至美观。合适的基质既传递该DNA分子，也作为哺乳动物修复细胞可以迁移通过的原位支架。当所述基质将保持较长时间时，可以使用非生物降解性基质，诸如烧结羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、其它生物陶瓷材料和金属材料，特别是钛。合适的陶瓷传递系统是美国专利4，596，574中描述的，该专利通过引用结合到本文中。所述生物陶瓷可以在组成上改变，诸如为钙-铝酸盐-磷酸盐；可以将它们加工以改变特定的物理和化学特性，诸如孔径大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性。也可以使用聚合基质，包括如美国专利 4，521，909和4，563，489中分别描述的丙烯酸酯聚合物和乳酸聚合物，这些专利通过引用结合到本文中。有用聚合物的详细例子是原酸酯、酸酐、丙烯-延胡索酸酯共聚物的那些聚合物，或一种或多种Y-羟基羧酸单体的聚合物，这些单体例如为Y-羟基金酸(乙醇酸) 和/或Y-羟丙酸(乳酸)。本发明的一个特别重要的方面是它与矫形外科植入物和界面和人造关节结合的应用，所述植入物和界面和人造关节包括植入物本身和植入物的功能部件，诸如外科螺钉、 钉子等等。在最佳实施方案中，设想将所述金属表面或植入物或其一部分的表面(诸如钛表面)涂上对核酸具有亲和力的材料，最优选涂上羟基磷灰石，然后对所述涂布的金属进一步涂上希望转移的基因或核酸。正如本领域技术人员已知的，可以容易地对诸如羟基磷灰石之类的该吸收性材料的可用化学基团进行操作，以控制它对核酸的亲和力。
在最佳实施方案中，设想生物降解性基质可能是最有用的。生物降解性基质一般定义为能够重吸收入机体的基质。与本发明的组合物、装置和方法结合使用的潜在的生物降解性基质包括例如生物降解性和化学上确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸、 聚酐、纯化蛋白基质和半纯化胞外基质组合物。其它可以使用的生物相容的生物降解性聚合物是本领域众所周知的，包括例如(但不限于)聚酯，诸如聚乙交酯、聚丙交酯和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactic polyglycolic acid copolymer, ) ( “PLGA，，)(Langer 禾口 Folkman，1976，Nature 263 797-800)；聚醚，诸如聚己内酰胺(“PCL”)；聚酐；聚氰基丙烯酸烷基酯，诸如氰基丙烯酸正丁酯和氰基丙烯酸异丙酯；聚丙烯酰胺 ’聚(原酸酯)；聚磷腈；多肽；聚氨酯；和这类聚合物的混合物。应该理解，事实上现在已知的或后来开发的适用于缓释或控释核酸的任何聚合物都可以用于本发明。在最佳实施方案中，所述生物相容性生物降解性聚合物是乙醇酸和乳酸的共聚物(“PLGA”)，其乳酸/乙醇酸单位的比例为大约100/0至大约25/75。用市售的标准分子量的聚苯乙烯通过凝胶渗透色谱测定的该聚合物的平均分子量(“丽”)通常为大约 6，000-700, 000，最好为大约 30，000-120, 000，其特性粘度为 0. 5-10. 5。从按照本发明的基质连续缓释或控释核酸的时间长短主要取决于该聚合物的MW 和乳酸/乙醇酸的组成比率。一般而言，较高的乳酸/乙醇酸之比，诸如75/25，提供较长时间的所述核酸缓释或控释，而较低的乳酸/乙醇酸之比，提供所述核酸较快速的释放。所述乳酸/乙醇酸之比最好是50/50。缓释或控释的时间长短也取决于所述聚合物的MW。一般而言，较高MW的聚合物提供较长时间的控释或缓释。例如，在制备提供控释或缓释大约3个月的基质的情况下，当乳酸/乙醇酸的组成比为100/0时，聚合物优选的平均分子量为大约7，000-25, 000 ；当乳酸/ 乙醇酸组成比为90/10时，聚合物优选的平均分子量大约为6，000-30，000 ；当乳酸/乙醇酸的组成比为80/20时，聚合物优选的平均分子量为大约12，000-30，000。可以使用的另一种类型的生物材料为小肠粘膜下层(SIQ。该SIS移植材料可以由成年猪的一段空肠制备。可以采用诸如Badybak等1989，J. Surg. Res. 47 :74-80中描述的常规组织培养技术进行组织样品的分离。通过除去肠系膜、翻转该肠段，然后通过机械摩擦技术除去粘膜和浅表粘膜下层，可以制备SIS材料。在翻回该肠段原来的方位后，冲洗浆膜层和肌肉层，贮存以备进一步的使用。另一个合适材料的具体例子为纤维性胶原，它可以在从组织提取及部分纯化后冻干，然后灭菌。也可以由腱或皮肤胶原制备基质，同样可以由诸如Sigma和Collagen Corporation之类的各种各样的商业来源获得。也可以按美国专利4，394，370和4，975，527 中所述制备胶原基质，这些专利通过引用结合到本文中。另外，诸如Yarmas和Burke (美国专利4，505，266)中描述的由胶原和糖胺聚糖 (GAG)制成的网格(lattice)可以用于本发明的实施中。该胶原/GAG基质可以有效地用作修复细胞可以迁移其中的支持物或“支架”结构。诸如Bell的美国专利4，485，097中描述的胶原基质也可以用作基质材料。所述各种胶原材料也可以是矿化胶原形式。例如，如可以得自Norian Corp.(1025Terra Bella Ave. ,Mountain View,CA,94043)的称为 UltraFiber 的纤维性胶原植入材料可以用来形成基质。美国专利5，231，169(通过引用结合到本文中)描述了通过在中度搅拌下、在有分散的胶原纤维存在下原位形成磷酸钙矿质来制备矿化胶原。这种制剂可以在将核酸区段传递到骨组织部位方面使用。例如矿化胶原可以用作用于骨折修复的基因活化基质治疗药盒的组成部分。已经鉴定出至少20种不同形式的胶原，这些胶原中的每一种都可以用于本发明的实施中。例如，可以由透明软骨纯化胶原，同样可以从动关节或生长面分离胶原。从透明软骨纯化的II型胶原是市售的，可以购自例如Sigma Chemical Company，Μ. Louis。得自大鼠尾部腱的I型胶原可以购自例如Collagen Corporation.也可以使用任何形式的重组胶原，重组胶原同样可以得自表达胶原的重组宿主细胞，包括细菌、酵母、哺乳动物和昆虫细胞。当使用胶原作为基质材料时，可能最好除去位于该胶原分子末端、已知诱导炎症反应的、称为“端肽”的部分。用于本发明的胶原如果需要，可以补充其它矿物质，诸如磷酸钙形式的钙。天然和重组形式的胶原都可以通过与其它矿质以该方式混合、吸收或者结合进行补充。512 所沭 DNA本方法和组合物可以使用各种各样的不同类型的DNA分子。所述DNA分子可以包括基因组、cDNA、单链DNA、双链DNA、三链DNA、寡核苷酸和Z-DNA。所述DNA分子可以编码各种各样的促进伤口愈合的因子，包括胞外、细胞表面和胞内RNA和蛋白质。胞外蛋白的例子包括生长因子、细胞因子治疗蛋白、激素和激素的肽片段、细胞因子抑制剂、肽生长和分化因子、白介素、趋化因子、干扰素、集落刺激因子和血管生成因子。这类蛋白质例子包括(但不限于)TGF-β分子超家族，该超家族包括5种 TGF-β同种型和骨形态发生蛋白(BMP)、潜伏TGF-β结合蛋白LTBP ；角质形成细胞生长因子(KGF)；肝细胞生长因子(HGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；胰岛素样生长因子(IGF)； 碱性成纤维细胞生长因子(FGF-l、FGF-2等等)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)；因子VIII 和因子IX;促红细胞生成素(EPO)；组织纤维溶酶原激活物(TPA)；活化素和抑制素类。可以用于实施本发明的激素包括生长激素(GH)和甲状旁腺激素(PTH)。胞外蛋白的例子也包括胞外基质蛋白，诸如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。细胞表面蛋白的例子包括细胞粘附分子家族(例如整联蛋白、选择蛋白、诸如N-CAM和Ll的Ig家族成员和钙粘着蛋白)； 细胞因子信号受体，诸如I型和II型TGF-β受体和FGF受体；以及非信号共同受体，诸如 β聚糖和多配体聚糖。胞内RNA和蛋白的例子包括信号传导激酶家族、诸如踝蛋白和粘着斑蛋白的细胞骨架蛋白、诸如潜伏TGF-β结合蛋白家族的细胞因子结合蛋白以及核反式作用蛋白，诸如转录因子和增强因子。所述DNA分子也可以编码阻断病理过程的蛋白，由此允许天然伤口愈合过程无障碍地发生。阻断因子的例子包括破坏RNA功能的核酶和例如编码破坏组织完整的酶的组织抑制剂，例如与关节炎有关的金属蛋白酶抑制剂。人们可以采用本领域技术人员普遍已知的各种各样的分子生物学技术，获得编码感兴趣蛋白的DNA区段。例如可以采用具有基于已知核苷酸序列的序列的引物或探针筛选 cDNA文库或基因组文库。也可以用聚合酶链式反应(PCR)来产生编码感兴趣蛋白的DNA片段。另一方面，可以由商业来源获得所述DNA片段。
具有与文献所述序列不同的序列的基因也包括在本发明中，只要所述改变或修饰的基因编码的蛋白仍用来以直接或间接方式刺激伤口愈合。这些序列包括由点突变产生的序列、由遗传密码的简并性产生的序列或天然产生的等位基因变异体以及通过遗传工程 (即通过人工)导入的其它修饰。在核苷酸序列中导入用来改变所编码蛋白或多肽功能性质的改变的技术是本领域已知的。这类修饰包括导致所述氨基酸序列的改变的碱基的缺失、插入或置换。可以进行改变使所编码蛋白的活性增加、其生物学稳定性增加或半衰期增长、改变其糖基化模式、 赋予温度敏感性或改变该蛋白的表达模式等等。所有对所述核苷酸序列的这类修饰都包括在本发明内。编码感兴趣翻译产物或转录产物的DNA可以通过重组工程改造为各种各样的载体系统，所述系统提供该DNA大规模的复制，以供制备基因活化基质。这些载体可以设计为含有必需元件，以指导在伤口处修复细胞吸收的DNA序列的原位转录和/或翻译。可以使用的载体包括(但不限于)衍生于重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA 的那些载体。例如，可以使用质粒载体，诸如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp载体系列。噬菌体载体可以包括λ gtlO、AgtlU λ gtl8-23、λ ZAP/R和EMBL噬菌体载体系列。可以利用的粘粒载体包括(但不限于)pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、 PHSG274、C0S202、C0S203、pffE15, pffE16和卡隆粒9载体系列。也可以使用提供体外转录 RNA的载体(诸如SP6载体)来产生大量的可以加入基质中的RNA。另一方面，可以工程改造重组病毒载体，包括(但不限于)得自病毒的载体，这些病毒诸如疱疹病毒、逆转录病毒、 痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒或牛乳头瘤病毒。尽管可以使用整合型载体，但对于伤口愈合最好使用不将该基因产物传递给许多代子细胞的非整合型载体。这样，该基因产物在伤口愈合过程中表达，由于该基因在后代中被稀释掉，因此表达的基因产物量减少。可以使用本领域技术人员熟知的方法，来构建含有操作性(operatively)与合适的转录/翻译控制信号连接的该蛋白编码序列。这些方法包括体外重组DNA技术和合成技术。参见例如 Sambrook 等，1992,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.(分子克隆，实验室手册(冷泉港实验室，纽约)和Ausubel等， 1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates&ffiley Interscience, N. Y.中描述的技术。编码感兴趣蛋白的基因可以操作性地与各种各样的不同启动子/增强子元件连接。这些载体的表达元件的强度和特异性可以不同。根据所用的宿主/载体系统，可以使用多种合适的转录元件和翻译元件中的任何一种。该启动子可以为天然与该感兴趣基因连接的启动子形式。另一方面，该DNA可以位于重组或异源启动子的控制之下，所述重组或异源启动子就是不是天然与该基因连接的启动子。例如，可以使用组织特异性启动子/增强子元件来调节转染DNA在特定细胞类型中的表达。已经描述的并可以使用的表现出组织特异性的转录控制区的例子包括(但不限于)在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift 等，1984，Cell 38 :639-646 ;0rnitz 等，1986，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 :399-409 ；MacDonald，1987，Hepatology 7 :42S_51S)；在胰腺 β 细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315 :115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl 等，1984，Cell 38 :647-658 ；Adams 等，1985，Nature318 :533-538 ；Alexander 等，1987，Mol. Cell. Biol. 7 :1436-1444)；在肝脏中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel. 1 :268-276)；在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf 等，1985，Mol. Cell. Biol. 5 :1639-1648 ；Hammer 等，1987， Science 235 :53-58)；在肝脏中有活性的α-1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987， Genes and Devel. 1 :161-171)；在髓样细胞中有活性的β -珠蛋白基因控制区(Magram等， 1985,Nature 315:338-340 ；Kollias 等，1986，Cell 46 :89-94)；在脑少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48 :703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Siani，1985,Nature 314 =283-286)；和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素(gonadotropic releasing hormone)基因控制区(Mason等，1986， Science 234 :1372-1378)。可以使用从在哺乳动物细胞中生长的病毒基因组中分离的启动子(例如RSV、痘苗病毒7. 5K、SV40、HSV、腺病毒MLP、MMTR LTR和CMS启动子)以及通过重组DNA技术或合成技术产生的启动子。在某些情况下，所述启动子元件可以是组成型启动子或诱导型启动子，可以在合适的条件下使用，以指导高水平或受调节的感兴趣基因的表达。在组成型启动子控制下的基因表达不需要存在诱导基因表达的特定底物，所述表达将在所有细胞生长条件下发生。 相反，由诱导型启动子控制的基因表达对诱导物的存在或缺乏应答。插入蛋白的编码序列的充分翻译也需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。当包括起始密码子和相邻序列的完整的编码序列插入到合适的表达载体时，可以不需要额外的翻译控制信号。然而，当仅插入一部分编码序列时，必须提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，该起始密码子必须与所述蛋白编码序列在一读框内，以确保所述完整插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以来源于各种各样的来源，既可以是天然的，也可以是合成的。可以通过包含转录衰减序列、增强子序列等等，增强表达的效率和控制。除编码感兴趣治疗蛋白的DNA序列外，本发明的范围还包括可以转染到哺乳动物修复细胞中的核酶或反义DNA分子的应用。这类核酶和反义分子可以用来抑制编码抑制疾病过程或伤口愈合过程的基因蛋白的RNA的翻译，由此允许发生组织修复。反义RNA分子的表达将用来通过与靶mRNA结合并防止蛋白翻译，来直接阻断mRNA 的翻译。核酶为能够催化RNA特异性切割的酶性RNA分子，核酶的表达也可以用来阻断蛋白翻译。核酶作用机制涉及该核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交然后进行核酸内切。 特异性地和有效地催化RNA序列核酸内切的工程锤头状基元核酶分子在本发明的范围内。 可以通过编码该RNA分子的DNA序列的转录产生RNA分子。可以使用在一个或多个启动子控制下的在单个遗传构建物上结合的多个基因、或作为相同或不同类型的单独的构建物制备的多个基因，这也在本发明范围内。因此，可以使用几乎无限的不同基因和遗传构建物的组合。可以设计某些基因组合，使其达到对细胞刺激和再生的协同作用，或其使用可以以另外一种方式导致达到该目的，任何的和所有的这类组合都将在本发明范围内。实际上，在科学文献中已经描述了许多协同作用，因此本领域技术人员能够容易地鉴别可能的协同基因组合或甚至鉴别基因-蛋白组合。5. 1. 3所述基因活化基质的制备在最佳实施方案中，通过将基质材料浸泡在重组DNA贮液中，使所述基质或植入物材料与编码感兴趣治疗产物的DNA接触。将该DNA加入该基质中所需的DNA量和接触时间将取决于所用的基质类型，本领域技术人员可以容易确定，而不用过度的实验。另一方面，该DNA可以包囊于合成聚合物基质中，所述聚合物诸如为聚乳酸-聚乙醇酸的嵌段共聚物(参见Langer和Folkman，1976NatureJ63 :797_800，该文献通过引用结合到本文中)。 再者，这些参数可以容易地由本领域技术人员确定，而不用过度实验。例如，用于该基质的 DNA构建物的量将考虑到各种生物学因素和医疗因素而确定。人们可以考虑特定的基因、该基质、伤口部位、所述哺乳动物宿主的年龄、性别和膳食和可能影响伤口愈合的任何其它临床因素，诸如各种因子和激素的血清浓度。在本发明的其它实施方案中，可以将生物学基质和合成基质和DNA的组合物一起冻干，形成药用干粉。该基因活化基质可以在植入机体前再水化，或者该基因活化基质植入机体时可以自然再水化。在某些情况下，诸如植入物、缝线、伤口敷料等医疗装置可以用本领域熟知的涂布技术涂上本发明的核酸组合物。这类方法包括例如(但不限于)将该装置浸入该核酸组合物中、用该核酸组合物涂刷该装置和/或用本发明的气雾核酸组合物向该装置喷雾。然后将该装置或者于室温下或者借助于干燥烘箱进行干燥，干燥可选地在减压下进行。在所述实施例中提供涂布缝线的优选方法。对于涂有含质粒DNA的聚合基质的缝线，申请人已经发现，用含有总量为大约 0. 01-10mg、最好为大约l-5mg的质粒DNA的涂布组合物，对长70cm的缝线涂布大约5-100 次，优选大约5-50次，更优选大约15-30次涂布，产生治疗上有效的均勻涂层。在一特别优选的实施方案中，本发明提供涂布的缝线，尤其是涂有含核酸的聚合基质的缝线，所述核酸编码体内刺激伤口愈合的治疗蛋白。可以按照本发明方法和组合物涂布的缝线包括任何天然或合成来源的缝线。典型的缝合材料包括例如(但不限于)丝；棉；亚麻线；聚烯烃，诸如聚乙烯和聚丙烯；聚酯，诸如聚对苯二甲酸乙二酯；羟基羧酸酯的均聚物和共聚物；胶原(普通的或铬处理的)；肠线 (普通的或铬处理的)；和缝线代用品，诸如氰基丙烯酸酯。所述缝线可以采用任何便利的形式，诸如编带(braid)或捻线(twist)，其大小范围很宽，通常为本领域所用的大小。涂布缝线、尤其是涂有含核酸的聚合基质的缝线的优势实际上覆盖人类和动物中外科应用的每一个领域，其中所述核酸编码刺激伤口愈合的治疗蛋白。5. 2所述基因活化基质的用途本发明在人类医疗中适用于种类繁多的伤口愈合情况。这些包括(但不限于)骨修复、腱修复、韧带修复、血管修复、骨骼肌修复和皮肤修复。例如，使用该基因活化基质技术，由转染的修复细胞产生的细胞因子生长因子将通过结合细胞表面信号受体、由此刺激并放大与伤口愈合过程自然相关的生理事件级联，影响该伤口中的其它细胞。最终结果是增加组织修复和再生。当临床目的为阻断疾病过程，由此允许自然组织愈合发生时，或当该目的为替代遗传缺陷的蛋白功能时，本发明方法也是有用的。伤口可能由创伤性损伤或者由外科手术诱导或引起的组织损害产生的。可以采用各种技术将本发明的基因活化基质转移至患者。例如，医师可以用手直接将基质或者作为治疗植入物或者作为涂布装置(例如缝线、移植片固定模(stent)、涂布植入物等等)转移到该伤口部位。可以皮肤表面给与基质，也可以通过外科将其置于正常组织部位，以便治疗一定距离外的患病组织。伤口愈合过程是一个协调的事件顺序，它包括出血、形成血块、溶解该血块，同时除去受损的组织，以及沉积作为初始修复材料的肉芽组织。所述肉芽组织是一种成纤维细胞和毛细血管的混合物。所述伤口愈合过程涉及各种细胞群体，包括内皮细胞、干细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。参与伤口修复的调节因子已知包括系统性激素、细胞因子、生长因子、胞外基质蛋白和调节生长和分化的其它蛋白。本发明的DNA转移方法和基质组合物在各种各样的不同组织类型中作为刺激组织修复和再生的药物传递方法，具有广泛应用。这些包括(但不限于)骨修复、皮肤修复、 结缔组织修复、器官再生或调节血管发生和/或血管生成。基因活化基质的用途也可以用来治疗由于例如衰老或糖尿病的作用引起的愈合能力受损的患者。所述基质也可以用来治疗例如在老年患者中由于自然原因引起的愈合缓慢的伤口、以及对现有的疗法不反应的伤口，诸如慢性皮肤伤口的那些个体的伤口。本发明的一个重要特征在于，可以通过选择性地使用基因活化基质调节该伤口部位的瘢痕组织的形成。可以通过控制治疗蛋白的表达水平调节瘢痕组织的形成。在某些情况下，诸如烧伤或结缔组织损害的治疗，尤其希望抑制瘢痕组织的形成。本发明方法包括将含感兴趣DNA的基质移植入该宿主中。移植该基质的方法可以包括将所述基质手术放置或注射入该宿主中。当欲注射所述基质时，将所述基质抽入注射器中，注射到患者的伤口部位。在该伤口区域可以进行多次注射。另一方面，可以将所述基质手术置于该伤口部位。达到本发明目的-即刺激伤口修复和再生所需的基质量可随该宿主的大小、年龄和体重而改变。本发明的一个基本特征是，无论何时将基因活化基质转移到该宿主中，无论是注射还是手术，都足以诱导该局部组织损害的伤口愈合过程。这是诱导靶哺乳动物修复细胞迁移到该基因活化基质部位并进行增殖的必要条件。在以下小节中描述具体实施方案。5. 3骨再生骨具有在骨折后再生的实际能力。所述复杂但有序的修复顺序包括止血、血块溶解、肉芽组织向内生长、形成骨痂和该骨痂重建为优化结构(A.W.Ham.，1930，J. Bone Joint Surg. 12,827-844)。参与该过程的细胞包括血小板、炎症细胞、成纤维细胞、内皮细胞、外膜细胞、破骨细胞和成骨祖细胞(progenitor)。最近，已经鉴定几种肽生长分化因子，它们似乎控制与骨形成和修复有关的细胞事件(Erlebacher, A.等，1995，Cell 80，371-378)。 例如骨形态发生蛋白(BMP)是控制成骨细胞命运的可溶性胞外因子BMP基因通常由培养的胎儿成骨细胞表达(Harris, S. Ε.等，1994，J. Bone Min. Res. 9,389-394)以及在小鼠胚胎骨骼形成期间由成骨细胞表达(Lyons, K. Μ.等，1989，Genes Dev. 3，1657-1668 ； Lyons, K. Μ.等，1990，Development 190,833-844 Jones, Μ. C.等，1991，Development 111,531-542)，重组BMP蛋白引发软骨和骨母细胞分化(Yamaguchi，A.等，1991，J. Cell Biol. 113,681-687 ；Ahrens, Μ.等，1993，J. Bone Min. Res. 12，871-880 ；Gitelman, S. E 等， 1994，J. Cell Biol. 126,1595-1609 ；Rosen, V.等，1994，J. Cell Biol. 127，1755-1766)，重组BMP的传递诱导与软骨内骨形成相似的骨形成顺序(Wozney，J. Μ. , 1992, Mo 1. R印rod.Dev. 32，160-167 ；Reddi，A. H.，1994，Curr. Opin. Genet. Dev. 4，737-744)，并且 BMP-4 基因的表达在骨折修复过程中早期不受调节(Nakase，Τ.等，1994，J. Bone. Min. Res. 9, 651-659)。与BMP相关分子家族一成员成骨蛋白-KOzkaynak，Ε.等，1990，EMBO J. 9， 2085-2093)能够在体外和体内起相似的作用(Sampath，T长.等，1992，J. Biol. Chem. 267， 20352-20362 ；Cook, S. D.等，(1994) J. Bone Joint Surg. 76-A，827-838)。TGF-β 也表现出刺激体内软骨和骨形成(Centrella, M.等，1994，Endocrine Rev. 15,27-38 ；Sumner D. R.等，1995，J. Bone Joint Surg. 77A，11；35_1147)。最后，甲状旁腺激素(PTH)为一 84 个氨基酸的激素，它提高血浆和胞外液的Ca+2浓度。在骨骼组织中，间断地给与具有生物学活性结构需要的PTH片段(aa 1-34)产生真正的合成作用许多体内和体外研究提供的强有力的证据表明，在动物(包括大鼠)中给与PTH1-34由于联合的对破骨细胞的抑制作用和对成骨细胞的刺激作用导致解偶联的高质量的骨形成(Dempster，D. W.等，1993,Endocrine Rev. 14,690-709)。已知PTH1-34肽与BMP-4协同相互作用，在体外正调节分化中的破骨细胞功能性细胞表面 PTH 受体的表达(Ahrens, M.等，1993，J. Bone Min. Res. 12，871-880)。作为重组蛋白，诸如BMP和TGF-βΙ的肽生长分化因子代表有希望的骨折修复治疗替代方法(Wozney，J. M.，1992，Mol. Reprod. Dev. 32，160-167 ；Reddi，A. H.，1994，Curr. Opin. Genet. Dev. 4,737-744 ；Centrella, Μ.等，1994, Endocrine Rev. 15，27-38 ；Sumner, D. R.等，1995，J Bone Joint Surg. 77-A，1135-1147)。然而，需要相对大剂量(微克量)来刺激动物显著的新骨形成，引起人们对未来人类治疗可能是昂贵并且毒性风险可能增加的关注。在本发明的一个实施方案中，将基因活化基质通过外科手术植入大鼠5mm切骨术部位，这是人类的复合型不愈合骨折的模型。本发明人已经发现可以容易地达到将基因转移到该切骨术裂缝中的修复细胞。所述骨修复和再生过程中的缺陷与临床整形外科实践中重要的并发症有关，例如骨折后纤维性骨不连合、植入物界面失败和大同种异体移植失败。许多复合型骨折目前采用自身组织移植治疗，但该技术不是有效的，并且伴随发生并发症。自然，设计以刺激骨修复的任何新技术在治疗骨折中都可能是一种有价值的工具。相当大一部分骨折仍通过铸模治疗，允许天然机制来实现伤口愈合。尽管近几年来在骨折治疗方面取得一些进展，包括改进的设备、开发新的刺激方法或补偿，但所述伤口愈合机制仍可能代表该领域的重要进展。可以采用本发明转移骨生长基因，以促进骨折修复。该技术的其它重要方面包括采用基因转移治疗例如象骨质疏松一样的疾病的“弱质骨(weak bone)”患者；改善可能由未知原因产生的愈合不良，例如纤维性骨不连合；促进植入物整合和人造关节的功能；刺激诸如跟腱之类的其它骨骼组织的愈合；和作为修复大缺损的辅药。已知骨组织具有修复和再生的能力，对这些过程的细胞和分子基础有一些了解。 新骨形成的引发包括修复细胞的定型、克隆扩充和分化。骨形成一旦引发，则由各种各样的多肽生长因子来促进。然后新形成的骨由一系列的局部和系统性生长分化因子保持。现在已经克隆了几种骨形态发生蛋白基因(Wozney等，1988 ;R0Sen等，1989， Connect. Tissue Res. ,20 :313-319 ；Alper的综述，1994)，该研究工作在DNA序列的同源性的基础上，已经将BMP确立为转化生长因子- β (TGF-β)超家族的成员。不同BMP基因的克隆已经导致将各个BMP基因和蛋白命名为BMP-I至至少BMP-8。BMP 2_8—般认为是成骨性的，而BMP-I可能是更为普遍性的形态发生素；Shimell等，1991，Cell,67 :469-481)。 BMP-3 也称为成骨素(Luyten 等，1989，J. Biol. Chem.，264 :13377-13380)，而 BMP-7 也称为 OP-I (Ozkaynak 等，1990，EMBO J.，9 :2085-2093)。每种 TGF 和 BMP 通过与细胞表面受体家族的复杂的组织特异性相互作用作用于细胞(Roberts和Sporn，1989，Μ. B. Sporn和 Α. B. Roberts 编辑.，Springer-Verlag，Heidelberg, 95 (第 1 部分)；Aralkar 等，1991)。也已经表明转化生长因子(TGF)通过影响细胞增殖、基因表达和基质蛋白合成在调节组织愈合方面起重要作用(Roberts和Sporn，1989，Μ. B. Sporn和Α. B. Roberts编辑.， Springer-Verlag,Heidelberg,95 ( % 1 部分))。例如，TGF-β 1 和 TGF-β 2 既可以引发软骨生成，也可以引发骨生成(Joyce 等，1990，J. Cell Biol.，110 :195-2007 ；Izumi 等，1992， J. Bone Min. Res. ,7 :115—11 Jingushi 等，1992, J. Orthop. Res. ,8 :364-371)。除TGF和BMP外的其它生长因子/激素可以用于本发明的实践，以影响骨折后的新骨形成。例如，以多次高剂量(1. 0mg/50ml)注射到大鼠骨折部位的成纤维细胞生长因子 (Jingushi等，1990)导致该骨折裂缝中软骨组织的显著增加，而较低剂量没有作用。例如甲状旁腺激素(PTH)的钙调节激素也可以用于本发明的一个方面。PTH是一种84个氨基酸的钙调节激素，其主要作用是提高血浆和胞外液中的Ca+2浓度。也表明完整的PTH刺激超过30年前的器官培养物中的骨重吸收，且已知该激素增加破骨细胞的数目和活性。用该天然激素和合成肽进行的研究已经证明，该分子的氨基末端(aa-1-34)含有生物学活性所需的结构(Tregear 等，1973 ;Hermann-Erlee 等，1976，Endocrine Research Communications, 3 :21-35 ；Riond,1993, Clin.Sci. ,85 :223-228)。在本发明的一个实施方案中，将所述基因活化基质通过外科手术植入骨折部位。 这类外科手术可以包括将GAM制剂直接注射到该骨折部位、复合型骨折的外科手术修复或关节镜外科手术。在使用所述基因活化基质修复骨折的骨时，所述哺乳动物修复细胞将自然迁移到骨损害部位并在此增殖。本发明人已经意外地发现，可以容易地完成将基因转移到切骨术裂缝再生组织的修复细胞中。目前，达到基因转移的优选方法一般涉及采用在被置于人们希望促进骨生长的部位前不久浸泡在DNA溶液中的纤维性胶原植入材料，或采用包囊于合成基质中的质粒 DNA制剂，所述合成基质例如为PLGA的嵌段共聚物。正如本文提出的研究所表明的，该植入材料促进切骨术裂缝中的明显参与骨再生/修复的细胞定向摄取外源质粒构建物。正如功能性标记基因产物的体内表达所证明的，所述转基因在细胞摄取后指导重组多肽的表达。本文提出的进一步的研究证明，骨营养(osteotropic)基因的表达导致细胞表达重组骨营养分子，其表达直接与新骨形成的刺激相关。具体地说，单独的和组合的编码BMP-4的基因转移载体和编码人PTH1-34片段的基因转移载体将刺激新骨形成。考虑到相对大量的候选基因后，编码人甲状旁腺激素hPTHl-34片段的基因转移载体将刺激 Sprague-Dawley大鼠中的新骨形成，表明该人类肽可以有效地结合大鼠成骨细胞表面上的 PTH/PTHrP 受体。5. 4软组织本发明也可以用来刺激诸如韧带、腱、软骨和皮肤的软组织的生长或再生。由于创伤性损伤引起的骨骼结缔组织损害可以采用含编码各种各样生长因子的基因的基质治疗。结缔组织通常由组织成特征性组织结构的细胞和胞外基质组成。组织损伤可以破坏这种结构，并刺激伤口愈合反应。本发明方法特别适合于刺激结缔组织的生长和再生，因为重要的是受伤组织再生而不形成疤痕组织，因为瘢痕组织可以干扰结缔组织的正常机械功能。可以用各种生长因子促进软组织的修复，这些生长因子包括但不限于TGF-β超家族成员(例如TGF-β本身)，它刺激编码胞外基质蛋白和诸如EGF和PDGF的其它细胞因子的基因表达。可以使用的其它基因的例子包括(a)细胞因子，诸如肽生长分化因子、白介素、趋化因子、干扰素、集落刺激因子；(b)血管生成因子，诸如FGF和VEGF ； (c)胞外基质蛋白，诸如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白；(d)细胞粘附分子家族(例如整联蛋白、选择蛋白、 Ig家族成员，诸如N-CAM和Li，以及钙粘着蛋白)；(e)细胞表面细胞因子信号受体，诸如I 型和II型TGF-β受体和FGF受体；(f)非信号共同受体，诸如β聚糖和多配体聚糖；(g) 信号传导激酶家族；(h)细胞骨架蛋白，诸如踝蛋白和粘着斑蛋白；(i)细胞因子结合蛋白， 诸如潜伏TGF-β结合蛋白家族；和(j)核反式作用蛋白，诸如转录因子。这类基质一旦形成，则可以置于宿主哺乳动物的结缔组织伤口区域。所述基因活化基质可以直接注射到结缔组织损伤区域。或者，可以采用关节镜外科手术的外科手术技术将所述基质传递到该结缔组织伤口区域。5. 5器官再牛本发明也可以用来刺激器官组织的修复和再生。由于创伤性损伤或外科手术引起的器官损害可以采用本发明方法治疗。在肝脏的情况下，所述肝脏可能由于过量的酒精消耗或感染诸如病毒肝炎家族的各种类型的传染性因子而引起损害。肾脏同样可能由于肾病引起的损害而不能正常工作。食管、胃或十二指肠的粘膜可能存在由胃液中的酸和胃蛋白酶引起的溃疡。所述溃疡也可能是由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)细菌在胃粘膜细胞定居引起的。这些器官和疾病仅仅作为实例，实际上本发明方法可以用来治疗机体任何器官的疾病或刺激任何器官的器官再生。含刺激细胞增殖和分化和/或调节组织形态发生的细胞因子的编码DNA的基质可以移植到合适的器官部位。这类因子可以包括但不限于蛋白转化生长因子家族、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在某些情况下，表达刺激给定器官特有的细胞类型增殖的生长因子和/或细胞因子可能是有用的，所述给定器官特有的细胞类型即肝细胞、肾细胞或心脏细胞等等。例如可以表达肝细胞生长因子以刺激肝脏的伤口愈合过程。对于螺杆菌感染引起的溃疡治疗，所述基因活化基质可以含有编码抗微生物蛋白的DNA。本发明的基因活化基质可以通过外科手术植入待治疗的器官。或者，可以利用腹腔镜外科手术将所述基因活化基质转移到机体中。在该治疗响应组织损伤的情况下，所述自然伤口愈合过程将刺激所述修复细胞迁移到移植的基质中并进行增殖。另一方面，当将所述基因活化基质转移至尚未损伤的器官时，例如当植入基质以表达不参与伤口愈合的治疗蛋白时，可以通过诱导组织损伤刺激所述伤口愈合过程。5. 6血管生成的调节本发明也可以用来调节血管的形成和扩展(spreading)，即分别为血管发生和血管生成。这两种生理过程在伤口愈合和器官再生中起重要作用。首先，在伤口部位，胶原、基质和血管的混合物-肉芽组织沉积，在组织修复期间
19提供伤口强度。新血管的形成包括血管肉皮细胞的增殖、迁移和浸润，且已知受各种各样的多肽生长因子调节。已经鉴定出具有肉皮细胞生长促进活性的几种多肽，包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血管肉皮细胞生长因子(VEGF)和胎盘衍生生长因子(PDGF)。为了刺激血管的形成和扩展，可以将编码这类生长因子的DNA加入基质中，并可以将这些基质植入该宿主中。在某些情况下，可能必须通过组织损伤诱导所述的伤口愈合过程。可能最好是在诸如与依赖于血管形成而生长的实体瘤生长相关的血管生成中抑制血管形成的增殖。可以通过转移编码诸如血小板反应蛋白或制管张素之类的血管生成负抑制剂的DNA，抑制肿瘤血管生成。在本发明的具体实施方案中，可以将编码例如血小板反应蛋白或制管张素的DNA加入基质中，然后将该基质植入患者的该肿瘤部位。5. 7皮肤修复本发明也可以用来刺激皮肤组织的生长和修复。在涉及皮肤区域损伤的伤口中， 特别是在大面积烧伤(massive burn)的情况下，重要的是该皮肤非常快速地生长来防止感染、减少体液损失和减小潜在的瘢痕形成面积。由烧伤、穿刺、切伤和/或擦伤引起的皮肤损伤可以采用本发明的基因活化基质治疗。诸如牛皮癣、特应性皮炎或由真菌、细菌和病毒感染或治疗诸如黑色素瘤的皮肤癌引起的皮肤损伤可以采用本发明方法治疗。含刺激皮肤细胞增殖和分化的细胞因子的编码DNA的基质可以用来治疗皮肤损伤和皮肤疾病，所述皮肤细胞包括中央基底干细胞(central basal stem cell)、角质形成细胞、黑素细胞、朗格罕氏细胞和梅克尔细胞。所述基因活化基质起两个作用，即保护该伤口免于感染和脱水以及供应DNA以供修复细胞摄取。本发明的基因活化基质可以包括皮肤贴剂、尸体皮肤、急救绷带、纱布垫、诸如美国专利4，505，266或美国专利4，485，097中公开的胶原网格、局部乳膏或凝胶。在将所述基质用于所述伤口部位之前，可以除去受损的皮肤或失活的组织。被加入所述基质的DNA可以编码各种各样的不同生长因子，包括角质形成细胞生长因子(KGF)或表皮生长因子(EGF)。已经表明IL-I是作为所述愈合过程部分的表皮细胞迁移和增殖的有效诱导物，编码IL-I的DNA也可以加入本发明的基质中。6.实施例用于骨基因转移的植入材料可以使用各种植入材料将基因体内转移到骨修复和/或再生部位中。将这些材料浸泡在含拟转移到骨再生长部位的DNA或基因的溶液中。或者，作为制备的优选方法，可以将DNA加入该基质中。合适材料的一个具体例子是纤维性胶原，它可以在从组织提取和部分纯化后冻干，然后除菌。另一特别优选的胶原是II型胶原，最特别优选的胶原或者是重组II型胶原， 或者是矿化II型胶原。在置于切骨术部位之前，将植入材料在无菌条件下浸泡于DNA(或病毒)溶液中。可以浸泡适当的和便利的时间，例如从6分钟至过夜。该DNA(例如质粒) 溶液将为无菌水溶液，诸如无菌水或可接受的缓冲液，浓度一般为大约0. 5-1. Omg/ml。目前优选的质粒是诸如 PGL2 (Promega)、pSV40 β -gal、pAd. CMVlacZ 和 pcDNA3。7.实施例转基因表达后的体内蛋白检测7. 1. 半乳糖苷酶转基因可以通过免疫组织化学检测细菌的β -半乳糖苷酶。将切骨术组织样品在Bouins 固定液中固定、脱矿质，然后沿纵向平面劈为两半。每个样品的一半包埋在石蜡中用于随后的细菌半乳糖苷酶蛋白的免疫组织化学鉴定。关于免疫组织化学，将横切片(厚2_3mm)转移到包被聚_L_赖氨酸的显微镜玻片上，在丙酮中于0°C固定至少20分钟。切片在PBS中再水化。通过于室温下将组织切片浸入0. 过氧化氢(在95%甲醇中)10分钟猝灭内源性过氧化物酶活性，将猝灭的切片在PBS中洗涤3次。在某些情况下，将切片的颅盖(calvariae)通过于4°C浸入4% EDTA、 5%聚乙烯吡咯烷酮和7%蔗糖，pH 7. 4中脱矿质M小时。在应用抗体之前，将脱矿质切片洗涤3次。第一抗体不用稀释，以杂交瘤上清液形式使用。将纯化的抗体用于组织切片， 浓度为5mg/ml。用生物素化兔抗鼠IgG和过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Zymed Histostain-SPkit)的检测第一抗体。在过氧化物酶染色后，切片用苏木精复染色。也可以采用市售试剂盒(例如Promega)，按照厂商的说明，通过底物利用测定检测细菌半乳糖苷酶。7. 2.荧光素酶转基因采用市售试剂盒(例如!Iomega)，按照厂商的说明，通过底物利用测定测定荧光素酶。7. 3. PTH 转基因例如采用两种市售放射免疫测定试剂盒，按照厂商的方案(Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano，CA)，在切骨术裂缝组织均浆中分析重组PTH，诸如 hPTHl-34 肽。一种试剂盒是完整的PTH-甲状旁腺激素IOOT试剂盒(the Intact PTH-parathyroid Hormone 100T Kit)。这种放射免疫测定利用抗所述完整激素羧基末端的抗体，用它测定裂缝切骨术组织中激素的内源水平。该测定可以用来建立大鼠切骨术模型中PTH表达的基线值。第二种试剂盒是用于测定大鼠PTH的双位点免疫放射试剂盒。该试剂盒采用对所述完整大鼠激素氨基末端(PTH1-34)特异性的亲和性纯化抗体，由此测定内源PTH的产生以及所述重组蛋白。先前的研究已经表明，这些抗体与人PTH交叉反应，并且这能够识别体内重组分子。从用2号试剂盒(抗所述氨基末端的抗体)获得的值减去用1号试剂盒(抗所述羧基末端的抗体)获得的值，获得精确和敏感的测定值。因此，重组肽的水平与新骨形成程度相关。7. 4. BMP 转基因采用识另IjHA 表位(Majmudar 等，1991，J. Bone and Min. Res. 6 :869-881)的特异性抗体，例如得自Boehringer-Marmheim的单克隆抗体，通过免疫组织化学检测BMP蛋白， 诸如鼠BMP-4转基因肽产物。也可以使用抗BMP蛋白本身的抗体。在美国专利4，857，456 中描述了这类抗体以及各种免疫测定方法，该专利通过引用结合到本文中。将切骨术组织样品在Bouins固定液中固定，脱矿质，然后沿纵向平面劈为两半。 每个样品的一半包埋在石蜡中，以用于随后的重组鼠BMP-4分子的免疫组织化学鉴定。8. 实施例转移骨营养基因在体内刺激骨再生/修复设计以下实验以研究基因转移是否可以用来产生体内组成型表达重组hPTHl-34 的转染细胞、以及该转基因是否可以刺激骨形成。如下分析新骨形成的速率。尸体解剖时，仔细解剖所述切骨术部位，以进行组织形态分析。用卡尺测量所述骨痂组织的A-P和M-L大小。然后将样品在Bouins固定液中浸渍固定，在乙醇中洗涤，在缓冲的甲酸中脱矿质。采用脱钙材料的塑料包埋，因为在样品制备和切片期间，甲基丙烯酸酯有优越的大小稳定性。在增加的乙醇浓度中将组织块脱水并进行包埋。采用Reichert Polycot切片机， 以冠状平面切下厚5mm的切片。从中间贯穿骨髓腔的宽度制备切片，以防止取样偏差。用于光学显微镜的切片用改良的Goldner氏三色染色法染色，以鉴别骨组织、骨样组织、软骨组织和纤维组织。用Eukitt氏封固剂(Calibrated Instruments，Ardsley，NY)给切片盖上盖玻片。采用Nikon Optiphot Research显微镜，在亮视野下进行组织形态分析。采用 IOmmXlOmm目镜方格网(grid reticular)的标准点计数立体学技术。在放大125倍下测量总骨痂面积，作为所述愈合反应总强度的指标。在放大250 倍下测量骨、软骨和纤维组织的面积部分，以检查每种组织对骨痂形成的相对作用。由于所述切骨术裂缝的大小反映所述基线(时间为0)，因此用随后时间间隔时的骨面积大小表示骨填充(infill)的速率。采用方差分析评价统计学显著性，采用Tukey氏学生氏化极差检验(studentized range test)进行组间的 post-hoc 比较。在上述5mm大鼠切骨术模型中，发现PTH转基因表达可以刺激活动物的骨再生/ 修复。这是特别重要的发现，因为已知hPTHl-34不是连续给予而是间断给予时，它是一个更有效的合成代谢剂，由于这里所用的基因转移方法，它是连续类型的传递。9.实施例将基因在体内直接转移到正在再生的骨中将含哺乳动物表达质粒DNA的基因活化基质植入成年雄性股骨中产生的大段裂缝中。植入含半乳糖苷酶或荧光素酶质粒的基因活化基质导致生长于该裂缝中的修复细胞摄取DNA并表达功能酶。另外，植入或者含骨形态发生蛋白-4质粒或者含甲状旁腺激素片段(氨基酸1-34)编码质粒的基因活化基质引起新骨填充该裂缝的生物学反应。最后，已经表明骨形态发生蛋白-4和所述甲状旁腺激素片段在体外协同作用，植入编码这两者的双质粒基因活化基质引起新骨的形成比单独使用任一因子要快。这些研究证明，首次可以在体内遗传操作骨中的修复细胞。本发明的基因活化基质尽管可用作研究修复成纤维细胞和伤口愈合反应的生物学，但本发明的基因活化基质也有广泛的治疗应用。9. 1.材料和方法9. 1. 1.哺乳动物宿主模型为了产生5mm的切骨术，将4个直径为1. 2mm的钉子在全身麻醉和恒定的刺激下， 旋入正常成年Sprague-Dawley大鼠的股骨骨干中。外科手术模板(template)引导钉子平行放置，这通过荧光X线射线照相证实(钉子设置在距固定板(fixator place)边缘3. 5mm 处，间隔为2. 5mm)。然后将一个外部固定板(30X 10X5mm)用所述钉子固定。外部固定板在CNC磨(mill)上用铝合金制造，以确保耐受性高。预制的具有相连锁紧垫圈和螺钉的固定器由不锈钢制造。在外科手术之前，所有固定器零件都用环氧乙烷气体灭菌。用Hall Micro 100往复式锯(Zimmer Inc. ,Warsaw，IN)，在中轴产生5mm的节段缺损。放置胶原海绵，并将其保持在切骨术裂缝中，直至被凝固的血液包围；初步研究表明，这种操纵将所述海绵固定在切骨术部位。所述皮肤切口用钉皮钉(staple)闭合。该固定器提供必需的稳定性，使得所述哺乳动物宿主的行走在几周内不受限制。9. 1. 2.免疫组织化学
制备用于光学显微镜的组织，按已描述的方法(Wong等，1992，J Biol. Chem. 267 5592-5598)进行免疫组织化学。组织切片与市售抗β-gal抗体(稀释度为1 200， 5Prime - 3Prime)以及与市售抗ΗΑ· 11多克隆抗体(稀释度为1 500，MAbC0) —起温育。9. 1.3.荧光素酶和β-gal酶测定采用荧光素酶测定系统(!Iomega)和β -半乳糖苷酶酶测定系统(Promega)，按照厂商提供的方案测定荧光素酶和β-gal活性。9.1.4. pGAMl 表汰质粒为了装配pGAMl，用试剂盒试剂和方案(Poly AT Tract mRNA分离系统I， Promega)由第13. 5天饭后(p. c)⑶_1小鼠胚胎制备mRNA。采用市售试剂(逆转录酶系统，Promega)、用一等份mRNA来产生cDNA。采用以下条件通过聚合酶链式反应(PRC)产生全长小鼠BMP-4cDNA编码序列，所述条件为94°C 4分钟，1个周期；94°C 1分钟，65°C 1 分钟，72°C 1分钟，30个周期；72°C 8分钟，1个周期。所述PCR引物的序列基于已知的小鼠 BMP-4 序列(GenBank)上游引物-5，CCATGATTCCTGGTAACCGAATGCTG 3，；下游引物-5，CTCAGCGGCATCCGCACCCCTC 3，。通过琼脂糖凝胶电泳纯化预期大小(1. 31Λ)的单一 PCR产物，将其克隆到TA克隆载体(Invitrogen)中。通过加入编码HA表位的27个核苷酸的序列，进一步修饰(PCR)所述BMP-4插入片段的5’端，将所述BMP-4插入片段克隆到 pcDNA3表达载体(Invitrogen)中。制备质粒DNA并进行测序(两条链)，以确保所述BMP-4 插入片段的方向和完整。采用体外转录和翻译试剂盒(TNF T7偶联网织红细胞裂解液系统，Promega)，按照厂商提供的方案表达PGAMl质粒。蛋白的放射性标记、免疫沉淀、样品制备和SDS-PAGE、 放射自显影、瞬时转染和Western分析按已描述的方法(Yin等，1995，J. Biol. Chem. 270 10147-10160)进行。9.1.5. PGAM2 表达质粒通过PCR产生编码氨基酸前原1-34的人甲状旁腺激素cDNA片段。所述PCR引物基于已知的人 PTH 序列(GenBank)上游引物 _5，GCGGATCCGCGATGATACCTGCAAAAGACATG 3，；下游引物-5，GCGGATCCGCGTCAAAAATTGTGCACATCC 3，。该引物对在所述PCR片段的两个末端产生BamHI位点。所述片段用BamHI消化，并连接到PLJ逆转录病毒载体(Wilson等， 1992，Endocrinol. 130 =2947-2954)中的一个BamHI克隆位点中。最后分离具有编码方向插入片段的克隆(PGAM2)，并通过DNA序列分析进行特征鉴定。为了产生逆转录病毒贮液，采用磷酸钙法，用10 μ g重组载体DNA转染Ψ CRIP包装细胞系(Wilson，J.M.等，1992，Endocrinology 130 =2947-2954) 过夜培养后，收获含有逆转录病毒颗粒的补充10%胎牛血清、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100mg/ml) (所有试剂都得自Gibco-BRL Life Technologies, Inc.)的培养基(Dulbecco氏的改进 Eagle氏培养基)，将其用于培养的Rat-I细胞。通过标准感染和选择步骤，获得成功转导的Rat-I细胞的独立的克隆。简而言之，让培养的Rat-I细胞生长至汇合，以1 10分开， 并在 G418(lmg/ml，Gibco-BRL Life Technologies, Inc.)中选择。在某些情况下，将抗生素抗性菌落合并为单个培养物。在其它情况下，保持抗性细胞的单个菌落。用相似的方法产生用编码细菌b-gal酶的BAGT逆转录病毒转导的Rat-I细胞的克隆。用市售放射免疫测定试剂盒(INS-PTH，Nichols)，按照厂商的方案估计细胞培养基中 hPTHl-34 的浓度。按已描述的方法(McCauley 等，1994，Mol. Cell. Endocrinol. 101 331-336)评价pGAM2编码肽的生物学活性。9. 1.6.基因活化胶原海绵的制备关于每个切骨术裂缝，将冻干的牛气管胶原(10mg，Sigma)在植入前在0. 5_lmg质粒DNA的无菌溶液中充分润湿，让其于4°C温育1-16小时。9. 1. 7.射线照相术在哺乳动物宿主清醒时，用便携式X-射线装置(GE，100型)获得每周的平片射线照片(前后视图)。于57KV和15ma下曝光1/10秒。9.2.结果9. 2. 1.切骨术樽型我们的模型系统采用成年大鼠股骨中的5mm中轴切骨术。切骨术裂缝用四钉的外部固定器稳定。修复方式取决于该裂缝的大小2mm裂缝通过骨连合愈合，但5mm的裂缝通过纤维性骨不连合愈合(Rouleau，J. P.等，Trans. Ortho. Res. Soc. 20 )，而大鼠的切骨术修复在手术后9周时完成。对照哺乳动物宿主保持至手术后13周，证实5mm的裂缝通常通过纤维性骨不连合愈合的观察。每周的平片射线照相术和组织学(图1A-D)证明，在或者仅接受5mm切骨术(n = 3)、或者接受5mm切骨术加上胶原海绵(n = 10)、或者接受5mm切骨术加上含标记基因裸露质粒DNA的胶原海绵(n = 23)的哺乳动物宿主中不形成骨。所有36个对照裂缝都通过沉积纤维组织愈合。对照股骨表现出病灶性骨膜性新骨形成(钉放置并发症)。手术后也观察到裂缝组织中的病灶性一过性炎症反应(淋巴细胞和巨噬细胞)。9. 2. 2.标记基因研究在初步的可行性研究中，在体内成功地转移IacZ和β -gal表达质粒DNA。该目标是使所述基因活化基质制备方案和术后时间进程标准化。将编码荧光素酶的GAM置于1只大鼠的切骨术裂缝中，将一个编码β-gal的基因活化基质置于第二只动物的裂缝中。3周后，在小心地解剖周围骨、软骨和骨骼肌后，制备裂缝勻浆(包含肉芽组织)。通过底物利用测定评价每种勻浆的等分样品的酶表达。在每种勻浆样品中都检测到预期的酶活性。在条件改变(例如DNA剂量、分析蛋白表达的时间)的其它实验中获得阳性结果。9. 2. 3. BMP-4 的基因转移在证实裂缝细胞从基质摄取质粒DNA后表达功能酶之后，我们问基因转移是否可以用来调节骨再生。我们选择过量表达骨折修复期间祖细胞正常表达的一种骨诱导因子-BMP-4。通过PCR产生全长的小鼠BMP-4CDNA，并将其亚克隆到pcDNA3 (Invitrogen)真核表达载体中(图幻。为了特异性地检测重组蛋白，加入血凝素(HA)表位修饰所述BMP-4 编码序列的3’端。采用体外转录和翻译方案，由该构建物(pGAMI)表达重组BMP-4。免疫沉淀研究证实抗-HA多克隆抗体识别HA表位的能力。用PGAMI质粒DNA瞬时转染培养的 293T细胞后，评价重组BMP-4的生物合成。通过免疫沉淀证明，BMP-4分子如所预期的装配为同二聚体，分泌并加工。综合这些结果，确立所述HA表位被抗HA多克隆抗体识别。将含pGAMI DNA的胶原海绵置于9只成年大鼠的所述裂缝中，保持4-M周。在术后4周处死的一只哺乳动物宿主中，采用抗HA抗体的免疫组织化学研究证明，该裂缝中的修复成纤维细胞表达PGAMI。这是有意义的，因为已知我们在来自13只对照哺乳动物宿
24主的裂缝组织的检查中没有观察到假阳性染色。在4周的样本中也观察到源自两侧手术边缘的新骨显微病灶(focus)。与通过自身诱导形成骨的典型描述⑴rist，1965，Science 150 :893-899) 一致，这些病灶由表面覆盖大立方形成骨细胞的骨板组成，并由多型纺锤形成纤维细胞和毛细血管构成的细胞结缔组织支持。在术后5-12周处死的7只哺乳动物宿主中，放射照相的新骨的量稳定的增加(图3A)，即使通过免疫组织化学没能检测到所述转基因编码的BMP-4。到9周时观察到定义为新骨、从手术边缘延伸横跨所述切骨术裂缝的桥连。第9只哺乳动物宿主术后存活M周，没有并发症。至18周时，形成足够的新骨，允许除去所述外部固定器，所述哺乳动物宿主在另外6周行走良好(图3A)。处死时，除该裂缝远侧边缘附近的一条薄的射线可透过的(radiolucent)的组织外，所述裂缝充满了进行活跃重建的新骨。已知所述哺乳动物宿主已经不用固定而成功地行走，因此假定该条为部分矿质化。与该假设一致，生物机械测试(Frankenburg等，1994，Trans. Ortho. Res. Sco. 19 513)证明，所述愈合裂缝的机械强度基本上与同一哺乳动物宿主的未手术股骨相同(差异为6.3%，最大扭矩试验)。在所有9个病例中，对侧(未手术)股骨的放射照相外观未改变，暗示基因转移和BMP-4过量表达的作用限于所述切骨术裂缝。
9. 2. 4.质粒混合剂(BMP-4+PTH1-34)的转移和表汰骨再生通常由按一受调节序列起作用的多种因子控制，因此我们想知道，表达几种合成代谢因子是否能够比仅单个因子更有效地刺激骨形成。为了评价这种假设，我们选择传递编码BMP-4加上甲状旁腺激素(PTH)片段的双质粒GAM。PTH是一种84个氨基酸的激素，它提高血浆和胞外液的Ca+2浓度。在骨骼组织中，间断地给与具有生物学活性所需结构的PTH片段(aa 1-34)产生真正的合成代谢作用大量的体内和体外研究提供的有力证据表明，在哺乳动物宿主(包括大鼠)中给与PTH1-34由于联合的对破骨细胞的抑制作用和对成骨细胞的刺激作用导致解偶联的高质量的骨形成(Dempster等，1993，Endocrine Rev. 14,690-709)。已知PTH1-34肽与BMP-4协同相互作用，正调节分化中的成骨细胞中功能性细胞表面 PTH 受体的表达(Ahrens 等，1993，J. Bone Min. Res. 12 :871-880)。通过PCR产生编码人PTH1-34的cDNA片段。为了确立其生物学活性，将该片段亚克隆到 PLJ 逆转录病毒载体(Wilson 等，1992，Endocrin, 130 :2947-2954)中，产生 pGAM2 表达载体(图4A)。制备复制缺陷型重组逆转录病毒贮液，将其用于培养中的Rat-I细胞。 获得转导的Rat-I细胞的独立的克隆，通过Southern和Northern分析证实逆转录病毒DNA 稳定地整合并表达。用放射免疫测定确定各个克隆的条件培养基中人PTH1-34的浓度。ROS 17/2. 8细胞具有PTH细胞表面受体，它属于G蛋白偶联受体超家族(Dempster等，1993， Endocrin. Rev. 14 :690-709)。ROS 17/2. 8细胞与等份的稳定转导的细胞系的条件培养基 (通过放射免疫测定，分泌> 2pg/ml)温育，导致与所述对照相比CAMP反应提高2. 7倍，该结果确立所述分泌的PTH1-34具有生物学活性。仅含有pGAM2质粒DNA的GAM刺激骨，然后将含有BMP-4和PTH1-34表达质粒DNA 的GAM植入另外3只哺乳动物宿主的切骨术裂缝中。至4周时，在所有3只哺乳动物宿主中均观察到桥连(1只哺乳动物宿主在此时处死用于组织学分析)，植入后12周时，在其余的哺乳动物宿主中形成足够的新骨，允许除去所述外部固定器(图幻。在植入后15周和 26周公开时，两只哺乳动物宿主都行走自如。基于平片射线照相术，基因转移和过量表达的作用又似乎限于所述切骨术裂缝。
用胶原海绵研究后，也已经表明质粒DNA在包囊于聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物颗粒制剂中后，可以以缓释方式传递到细胞。所述结果证明，培养的细胞可以被聚乳酸-聚乙醇酸颗粒中释放的质粒DNA所转染。结果也表明修复成纤维细胞(大鼠切骨术模型)体内吸收并表达从聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物颗粒释放的质粒DNA。图7证明，修复成纤维细胞(大鼠切骨术模型)体内吸收从聚乳酸-聚乙醇酸颗粒释放后的PGAM质粒DNA并表达该DNA。正如图7所示，质粒编码的PTH1-34的表达与所述切骨术裂缝中显著的新骨形成有关。总而言之，这些研究表明，所述基因活化基质技术的成功不依赖于胶原基质。因此，该技术的应用范围足够宽，它可以与生物学基质和合成基质联用。10. _仿丨丨辆ΦΦ白麵瞎砠在跟腱和韧带(肩膀和膝盖)修复期间，临床上需要刺激瘢痕形成，以增强受伤组织的机械反应能力。已经开发了一个模型系统，其中在跟腱中产生节段缺损，并用新型生物材料小肠粘膜下层或SIS作为腱植入物/分子传递剂。在本实施例中，证明用所述SIS移植物将标记基因构建物传递到再生中的腱组织并表达的能力。10. 1.材料和方法已经产生跟腱的节段缺损，并将SIS制剂用作腱植入物/分子传递系统。按照标准方案(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社)制备质粒(pSVogal， Promega)贮液。由成年猪的一段空肠制备SIS移植物(Badylak等，1989，J. Surg. Res. 47 74-80)。收获时，除去肠系膜组织，将该节段外翻，通过机械摩擦技术除去粘膜和浅表粘膜下层。在翻回该肠段至原来的方位后，冲洗浆膜层和肌肉层，用稀过氧乙酸灭菌，然后于4°C 贮存直至使用。将Mongrel狗(所有研究)麻醉，插管，将其右侧侧卧于加热垫上，并用吸入麻醉维持。采用从肌腱接合点至足底筋膜(plantar fasia)的侧切口暴露跟腱。用双倍厚度的 SIS片层包裹所述腱中心部分周围，将两端缝上，通过所述移植材料中的侧开孔除去所述腱的1.5cm节段，封闭所述移植物和手术部位。将该腿固定6周，然后自由使用6周。在以下所示时间点时收取移植组织，在Bouins固定液中固定，并包埋于石蜡中。切下组织切片 (Sum)用于免疫组织化学。10. 2.结果在初步研究中，在Mongrel狗中产生节段缺损后，移植单独的SIS材料(仅SIS的移植物)，促进跟腱再生长达术后6个月。重建过程包括肉芽组织的快速形成和该移植物的最终降解。不形成瘢痕组织，没有观察到免疫介导的排斥的证据。在第二个研究中，将SIS浸泡在质粒DNA溶液(SIS+质粒移植物)中，随后在正常 Mongrel狗中作为跟腱移植物(n = 2只狗)或交叉韧带移植物(n = 2只狗)植入。采用特异性抗体，在4/4哺乳动物宿主中通过免疫组织化学检测到pSVi3 gal质粒，pSVi3 gal采用猿猴病毒40调节序列驱动半乳糖苷酶(β-gal)活性。作为阴性对照，在这些哺乳动物宿主的未手术的跟腱和交叉韧带中没有检测到β-gal活性。因此，似乎是SIS促进腱和韧带中的新腱细胞摄取并随后表达质粒DNA。设计第三个研究评价β -gal转基因表达的时间进程。将SIS+质粒移植物植入3、 6、9和12周(每个时间点η = 2只狗)，通过免疫组织化学分析转基因表达。切下Bouins固定、石蜡包埋组织的横向切片(811111)，并固定在1^01^011 Plus玻片(Fisher)上。按照 Histostain-SP试剂盒(Zymed)提供的方案进行免疫组织化学。简而言之，将玻片与很好表征的抗β -半乳糖苷酶抗体(稀释度为12 00，5Prime — 3Prime)温育，在PBS中洗涤， 与生物素化第二抗体温育，洗涤，用酶缀合物加上底物-色素原混合物染色，然后用苏木精和曙红复染色。在接受SIS+质粒移植物的腱(8/8哺乳动物宿主)中检测到细菌β-gal活性。尽管没有精确地定量，但转基因表达似乎在9-12周时达到峰值。在接受仅SIS的移植物的35 只哺乳动物宿主中没有检测到细菌β "gal基因表达。11.实施例将腺病毒基因内转移再生中的骨中达到将基因体内转移到再生中的组织中的另一选择方法是利用腺病毒介导的转移事件。已经达到将标记基因构建物的腺病毒基因成功地转移到大鼠切骨术模型的骨修复细胞中。11. 1.材料和方法腺病毒载体pAd. CMVlacZ为可以在允许细胞中复制的复制缺陷型腺病毒载体的一个例子(Straford-Perricaudet 等，1992，J. Clin. Invest. 90 :626-630)。在该具体载体中，使用巨细胞病毒(CMV)的早期增强子/启动子来驱动LacZ的转录，其中所述LacZ具有在所述报道基因下游克隆的SV40多腺苷酸化序列(Davidson等，1993，Nature Genetics 3 :219-223)。pAd. RSV4的骨架与pAdCMVlacZ的基本相同，然而所述CMV启动子和单一的BglII 克隆位点已经以盒样方式用由RSV启动子、一个多克隆位点和聚腺苷酸位点构成的BglII 片段取代。设想该载体更大的灵活性可用于亚克隆诸如hPTHl-34cDNA片段的骨营养基因， 以供进一步研究。在Ultra Fiber 植入物在AdCMV IacZ病毒溶液(IOici-IO11空斑形成单位或PFU/ ml)中浸泡6分钟，然后植入所述切骨术部位。让该缺损愈合3周，在此期间通过每周的射线照相检查监测所述伤口愈合反应的进程。到3周时，估计有40%的缺损填有骨痂组织。 处死该哺乳动物宿主，将组织固定在Bouins固定液中，然后用标准甲酸溶液脱矿质7天。11. 2.结果获得的结果确实证明所述标记基因产物在所述切骨术裂缝的软骨细胞样细胞中表达(图6)。在前成骨细胞中也已经观察到所述核靶向信号。12.实施例将基因转移至骨骼肌在跟腱和韧带(肩膀和膝盖)以外的软组织修复期间，临床上需要刺激瘢痕形成， 以增强受伤组织的机械反应能力。已经开发了一种模型系统，其中在成年大鼠的骨骼肌中制造切口，将涂有缓释PLGA颗粒和质粒DNA的制剂的缝线用作骨骼肌/基因传递装置。为了证明本发明涂布组合物和方法的可行性，用标记DNA (编码人胎盘碱性磷酸酶)涂布外科手术缝线，将其用来缝合大鼠肌肉组织。该实验证明，将DNA成功地转移到用所述涂布缝线修复的组织中并在其中表达。12. 1.材料和方法12. 1. 1. DNA-PLGA涂布组合物的制备向1. 5ml PLGA/氯仿溶液(3% (w/v) 50/50聚乳酸聚乙醇酸PLGA共聚物，平均分子量为90，000，特性粘度为1. 07)加入0. 2ml含编码人胎盘碱性磷酸酶的标记DNA的溶液 (lmg DNA,0. 5mM Tris_EDTA、0. 5mM EDTA，pH 7. 3)。该溶液通过涡旋混合2分钟，然后用输出功率为55瓦的微尖端探头型超声波仪，于大约0°C超声处理30秒进行乳化。该方法产生的乳液非常象乳状。12. 1. 2涂布外科手术缝线用22 号针在涂布 Teflon 的薄金属片(Norton Performance Plastic Corp., Akron, OH)上刺一个孔。在此孔上置一滴(大约60 μ 1)所述DNA-PLGA乳液。将70cm长的 3-0铬制缝线^thicon)穿过此孔以涂布该缝线。当所述缝线通过此孔时，被涂布薄(大约30 μ m厚)而均勻的涂布组合物的涂层。将所述缝线风干大约3分钟，并重复所述涂布过程15次，让每一涂层风干。用电子显微镜(150倍)检查所述涂布缝线，发现所述缝线上覆盖了均勻一致的DNA-PLGA涂层。而且，甚至在所述缝线通过组织多次后，该涂布层仍保持完整。12. 1. 3.用涂布缝线修复骨骼肌将以上制备的所述缝线缝入2只正常成年大鼠的骨骼肌组织中，获得满意的外科手术结果。所述缝线呈现良好的栓系特性。一周后，解剖肌肉加缝线，速冻于液氮中并研磨成粉。将所述粉末温育于200μ1裂解缓冲液中，冻融三次且使其澄清。于65°C温育后，用标准方法分析该澄明液体的碱性磷酸酶活性。12. 2 结果所述结果表明，1周后用涂布缝线缝上并恢复的大鼠骨骼肌表现出碱性磷酸酶活性，表明所述标记碱性磷酸酶基因在该肌肉组织中表达。对照恢复没有显示出明显的碱性磷酸酶活性。这些数据证明，可以使用乳液有效地涂布缝线，并将基因体内传递到正在增殖的修复细胞中。13.实施例将基因转移至血管因为例如在血管成形术后的血管修复期间可能发生再狭窄，临床上需要防止过度的纤维化(再狭窄)。这可能例如通过传递编码赖氨酰氧化酶抑制剂的基因或通过转移编码某些TGF-β的基因来完成。另外，例如在血管机能不全疾病中，临床上是需要调节血管生成，在此该目标可能是刺激新血管形成，以便防止组织缺氧和细胞死亡。已经开发了一个模型系统，其中用缓释PLGA颗粒和质粒DNA的制剂转染兔的大血管中的修复细胞。修复细胞是存在的，因为这些兔血管带有泡沫性细胞损伤(foam cell lesion)，模拟人类的临床动脉粥样硬化。本实验证明将标记基因构建物转移到大血管修复细胞中并在其中表达的能力。13. 1.材料和方法重3. 1-3. 5kg的任一性别的新西兰白兔用于该研究。用肌内给与氯胺酮(35/mg/ Kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉兔子，用通过边缘静脉静脉内给与氯胺酮(8mg/ml)维持麻醉。分离下行的主动脉杈和腹股沟韧带之间的大约2cm的双侧髂动脉节段，近端系起来，并将该动脉节段的所有小分枝结扎。通过耳缘静脉给与肝素(IOOmg)防止局部血栓形成。通过髂动脉切开术，将气囊血管成形术导管O. Omm气囊)导入髂动脉节段中，将气囊于Satm 压力下膨胀1分钟。气囊膨胀后，除去血管成形术导管，动脉内注射20mg肝素，以防止远端血栓形成。用10. 0号丝线将髂动脉的两端扎紧，在3分钟内，于0. 5atm下在每一髂动脉中灌注5mg/ml DNA纳米颗粒悬浮液。将该伤口缝合。气囊血管成形术和纳米颗粒传递后2周时处死兔子。 通过一个垂直的下腹部切口，分离双侧髂动脉。切下两侧的2cm的髂动脉节段。取兔子的颈动脉作为对照样品。将该组织保存于液氮中，以用于碱性磷酸酶分析。13. 2.结果磷酸酶表达分析的结果表明，纳米颗粒加上DNA制剂能够将核酸传递到用气囊导管损伤的成年兔子髂动脉中的修复细胞。髂右动脉和髂左动脉暴露于纳米颗粒加上DNA制剂后，其磷酸酶活性为阳性。在对照主动脉中没有检测到磷酸酶活性。这些阳性结果表明， 暴露于基因活化基质时，大血管中的修复细胞可以吸收并表达核酸分子。本发明不限于例举的实施方案的范围内，这些实施方案是为了说明本发明的单个方面，任何功能相同的克隆、DNA或氨基酸序列都在本发明的范围内。实际上，除本领域技术人员从以上描述和附图所见的之外可以对本发明进行各种修改。这类修改将在所附的权利要求书的范围内。也应该理解，给出有关核苷酸的所有碱基对大小是大致的，用于说明目的。
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权利要求
1.一种将DNA分子转移到哺乳动物修复细胞中的方法，其中所述DNA分子含有操作性连接基因产物编码序列的启动子，所述方法包括将含所述DNA分子的生物相容性基质用于该机体的伤口处，使得迁移到所述伤口部位的修复细胞浸润所述基质，获得所述DNA分子并在体内表达所述DNA编码的基因产物。
2.权利要求1的方法，其中所述生物相容性基质为胶原材料、金属、羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、生物陶瓷材料、纯化蛋白或胞外基质组合物。
3.权利要求1的方法，其中所述生物相容性基质为胶原。
4.权利要求3的方法，其中所述胶原为II型胶原。
5.权利要求1的方法，其中所述转移的DNA编码治疗蛋白。
6.权利要求1的方法，其中所述转移的DNA编码生长因子。
7.权利要求1的方法，其中所述转移的DNA多于一种DNA分子。
8.权利要求6的方法，其中所述生长因子为转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或骨形态发生因子 (BMP)。
9.权利要求5的方法，其中所述治疗蛋白为激素。
10.权利要求9的方法，其中所述激素为生长激素(GH)。
11.权利要求9的方法，其中所述激素为人甲状旁腺激素(PTH)。
12.权利要求1的方法，其中所述伤口部位为骨骨折部位。
13.权利要求1的方法，其中所述伤口部位为结缔组织损伤部位。
14.权利要求1的方法，其中所述伤口部位为器官损害部位。
15.一种基因活化基质，所述基因活化基质包括含DNA分子的生物相容性基质，所述 DNA分子具有操作性连接治疗蛋白编码序列的启动子。
16.一种基因活化基质，所述基因活化基质包括含DNA分子的生物相容性基质，所述 DNA分子具有操作性连接反义RNA编码序列的启动子。
17.—种基因活化基质，所述基因活化基质包括含DNA分子的生物相容性基质，所述 DNA分子具有操作性连接生长因子编码序列的启动子。
18.权利要求17的基因活化基质，其中所述生长因子为TGFi3、FGF、PDGF、IGF或BMP。
19.权利要求15的基因活化基质，其中所述基质含有一种以上的DNA分子。
20.权利要求16的基因活化基质，其中所述基质为胶原材料、金属、羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、生物陶瓷材料、金属材料、纯化蛋白或胞外基质组合物。
21.权利要求15的基因活化基质，其中所述生物相容性基质为胶原。
22.权利要求21的基因活化基质，其中所述胶原为II型胶原。
23.—种试剂盒，所述试剂盒在合适的容器中包含基因活化基质制剂。
24.一种试剂盒，所述试剂盒在合适的容器中包含一种生物相容性基质制剂和一种编码治疗蛋白的DNA制剂。
25.一种制备DNA-基质组合物的方法，所述方法包括将DNA分子与生物相容性基质接触，使得所述DNA非共价连接到所述基质上。
全文摘要
本发明涉及在体内DNA特异性地寻靶并转移到哺乳动物修复细胞中的方法。所述转移的DNA可以包括编码感兴趣治疗蛋白的任何DNA。本发明基于下述发现哺乳动物修复细胞增殖并迁移到伤口部位，在此它们主动地吸收并表达DNA。本发明还涉及可以用于实施本发明以转移感兴趣DNA的药用组合物。这类组合物包括与感兴趣DNA联用的任何合适的基质。
文档编号A61K38/27GK102274522SQ20111020337
公开日2011年12月14日 申请日期1997年4月11日 优先权日1996年4月12日
发明者J·邦纳迪奥, S·A·戈尔茨坦 申请人:密执安大学评议会