用于基因转移的方法

专利名称：用于基因转移的方法
技术领域：
本发明涉及使用逆转录病毒载体用于将外源基因转移到靶细胞内的方法。
背景技术：
近来，用于治疗严重遗传疾病、癌症等的基因疗法已得到开发。已检查对于人的临床应用的大多数基因疗法迄今为止涉及使用重组逆转录病毒载体将基因转移到细胞内。逆转录病毒载体可以将目的外源基因稳定整合到靶细胞的染色体DNA内。因此，通过逆转录病毒载体的基因转移是特别用于其中希望长期基因表达的基因疗法的基因转移的优选方式。
已报道使用逆转录病毒载体的基因转移效率通过使用细胞粘合物质得到增加，所述细胞粘合物质结合逆转录病毒，例如纤连蛋白或纤连蛋白片段CH-296 [RetroNectin (注册商标)](例如专利文献I)。此外，已报道基因转移效率通过这样的方法进一步增加，所述方法包括将含有逆转录病毒载体的溶液加入用RetroNectin (注册商标)包被的容器，随后温育一定时间段以仅允许病毒载体结合在RetroNectin (注册商标)上，去除含有针对感染的抑制物质的上清液，并且随后加入祀细胞(RetroNectin Bound Virus Infection方法RBV方法)(专利文献2，非专利文献I)。在RBV方法中病毒载体与RetroNectin (注册商标)的结合可以通过利用离心力(离心RBV方法)得到增强。然而，离心RBV方法需要可以忍受离心力的容器和用于离心操作的昂贵仪器，并且该操作包括多步。此外，还存在当需要基因转移到大量细胞内时，难以按比例扩大处理能力的问题。引用列表 专利文献
专利文献I W0 95/26200 专利文献2 W0 00/01836 非专利文献
非专利文献 I J. Biochem.，第 130 卷，第 331-334 页(2001)。发明概述 技术问题
本发明的目的是提供使用逆转录病毒载体用于将基因转移到靶细胞内的方便和有效方法。问题的解决方案 具体地，本发明涉及
[I]使用逆转录病毒载体将外源基因转移到靶细胞内的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)
(a)将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器；和
(b)将靶细胞加入通过步骤(a)获得的培养容器内，随后温育；
[2]根据项目[I]的方法，其中在步骤(a)中的温育时间是超过5小时且不超过48小
时；
[3]根据项目[I]的方法，其中在步骤(a)中的温育是伴随振荡的温育；
[4]根据项目[I]用于转移基因的方法，其包含下述步骤(a)至(b2):
(a)将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器内，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器；
(bl)洗涤通过步骤(a)获得的培养容器；和
(b2)将靶细胞加入在步骤(bl)洗涤的培养容器内，随后温育；
[5]根据项目[I]的方法，其中逆转录病毒结合物质是选自下述的至少一种纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、胶原V型、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖、及其片段；
[6]根据项目[I]的方法，其中逆转录病毒结合物质还具有细胞结合活性；
[7]根据项目[I]的方法，其中在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器是在其上固定逆转录病毒结合物质和细胞结合物质的培养容器；和
[8]根据项目[7]的方法，其中具有的细胞结合物质是选自下述中的至少一种细胞粘附蛋白质、激素、细胞因子、抗体、糖链、碳水化合物和代谢产物。发明的有利效应
根据本发明，提供了方便和有效的基因转移方法。用于实施本发明的方式
本发明的基因转移方法包括步骤(a) “将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器”;和步骤(b) “将靶细胞加入通过步骤Ca)获得的培养容器内，随后温育”。如本文使用的逆转录病毒共同意指属于逆转录病毒科的RNA病毒，所述逆转录病毒科的基因组由RNA组成且在受感染细胞中具有将RNA转换为DNA的生命周期，并且包括致癌逆转录病毒(oncoretroviruses)和慢病毒。致癌逆转录病毒的例子包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒I型(HIV-I)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)0如本文使用的，逆转录病毒载体指通过重组DNA技术在逆转录病毒例如致癌逆转录病毒或慢病毒的基础上产生的病毒颗粒，并且包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体及其假型载体。致癌逆转录病毒载体的例子包括基于MMLV的载体。慢病毒载体的例子包括基于HIV-I的载体和基于SIV的载体。假型载体指具有衍生自不同于Gag和Pol蛋白质起源的病毒的Env蛋白质的重组逆转录病毒载体。假型载体的例子包括具有衍生自下述等的Env蛋白质的致癌逆转录病毒和慢病毒载体水泡性口炎病毒(VSV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫内源病毒RD114、鼠白血病病毒(亲嗜性-env、双嗜性-env、10Al-env等)。在本发明中，优选使用复制缺陷型重组逆转录病毒载体。消除复制缺陷型重组逆转录病毒载体的复制能力，从而使得载体不能在受感染细胞中自主复制，并且因此载体是非致病性的。载体可以感染宿主细胞例如脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞，且将由载体携带的外源基因稳定整合到宿主细胞的染色体DNA内。在步骤(a) “将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器”中使用的含有逆转录病毒载体的液体并无具体限制，并且其例子包括含有逆转录病毒载体的病毒生产细胞的培养上清液。在步骤(a)中，在将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中之后，可以将所述含有液体的培养容器冷冻且贮存一定时期。在这种情况下，可以对已冷冻且贮存的具有含有逆转录病毒载体的液体的培养容器直接实施在小于25°C的温度4小时或更久的温育。即，用于解冻的另外步骤不是特别要求的。在这种情况下，希望在步骤(a)中的温育可以是伴随振荡的温育。用于产生逆转录病毒载体的一般过程的例子包括包含将携带外源基因和包装信号的转移载体引入逆转录病毒包装细 胞内的过程，其中编码逆转录病毒结构蛋白质的基因例如gag-pol基因和env基因先前整合到其染色体内，和包含用上述转移载体和具有编码逆转录病毒结构蛋白质例如gag-pol基因和env基因的包装质粒共转染不含逆转录病毒结构蛋白质的细胞的过程。在合适启动子例如逆转录病毒载体中存在的LTR启动子或外源启动子的控制下，可以通过由重组逆转录病毒载体携带使用待转移到靶细胞内的外源基因。此外，与启动子和转录起始位点合作的另一种调节元件(例如增强子序列、终止序列或内含子序列)可以存在于载体中，以便完成外源基因的有效转录。待转移到靶细胞内的外源基因可以是天然存在的基因或人工制备的基因。可替代地，外源基因可以是其中不同起源的DNA分子通过已知方法例如连接结合在一起的那种。希望转移到细胞内的任何基因可以选择为由逆转录病毒载体携带的外源基因。例如，编码与待治疗的疾病相关的酶或蛋白质的基因、细胞内抗体(参见例如WO 94/02610)、T细胞受体基因、生长因子、反义RNA、引起RNA干扰的RNA、核酶、假引物(参见例如WO90/13641)等可以用作外源基因。例如，表达其为序列特异性核糖核酸酶的MazF的基因可以作为外源基因转移到CD4阳性T细胞，以获得显示抗HIV活性的CD4阳性T细胞(参见例如TO 2007/020873和WO 2008/133137)。此外，对于特异性药物赋予敏感性的基因例如胸苷激酶激基因可以转移到细胞内，以获得对于药物具有敏感性的细胞。在本发明中使用的逆转录病毒载体可以含有合适的标记基因，其致使能够选择基因转移的细胞。例如，对细胞赋予针对抗生素的抗性的药物抗性基因、通过检测酶促活性或荧光使得能够区分基因转移的细胞的报道基因、位于细胞表面上的细胞表面标记基因等可以用作标记基因。当新霉素磷酸转移酶基因用作标记基因时，基因转移的细胞可以基于其对G418的抗性作为标记进行证实，分离且纯化。当编码低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)的细胞外结构域的基因用作细胞表面标记基因时，基因转移的细胞可以通过利用抗LNGFR抗体进行分离且纯化。可以在本发明中使用的逆转录病毒载体的例子包括载体例如MFG载体(ATCC编号68754)、a -SGC 载体(ATCC 编号 68755)和 LXSN 载体[BioTechniques,第 7 卷，第 980-990页(1989)]，由TAKARA BIO INC.制造的DON-5、D0N-AI-2和MEI-5逆转录病毒载体和pLVSIN-CMV慢病毒载体，由Clontech制造的Retro-X Q载体系列和Lenti-X载体系列等。
载体可以通过使用已知的包装细胞系例如PG13 (ATCC CRL_10686)、PA317 (ATCCCRL-9078)、GP+E-86 (ATCC CRL-9642)、GP+envAml2 (ATCC CRL-9641)和 ￥CRIP [Proc.Natl. Acad. Sci. USA,第85卷,第6460-6464页(1988)]进行制备。载体还可以通过用表达重组病毒的结构蛋白质的包装质粒和逆转录病毒载体质粒瞬时转染293T-细胞(ATCCCRL-11268)、G3T-hi细胞(由TAKARA BIO INC.制造)等，且随后收集培养上清液进行制备。已知培养基例如达尔贝科改良伊格尔培养基和Iscoves改良达尔贝科培养基可以用于培养病毒生产细胞或用于培养靶细胞，所述病毒生产细胞通过将逆转录病毒载体转移到包装细胞内而产生。此类培养基例如由Gibco商购可得。多种组成成分可以加入这些培养基中，取决于用于基因转移或其他目的的靶细胞类型。例如，血清、多种细胞因子或还原剂可以加入培养基中，以便促进或抑制靶细胞的生长或分化。例如，小牛血清(CS)、胎牛血清(FCS)、人血清等可以用作血清。代替血清，还可以使用血清替代物或纯化的血清白蛋白(例如人血清白蛋白)。细胞因子包括白细胞介素(IL-2、IL-3、IL-4、IL-6等)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF等)、干细胞因子(SCF)、促红细胞生成素和多种细胞生长因子，并且衍生自人的这些细胞因子中的许多是商购可得的。对于细胞因子的使用，选择具有用于该目 的的合适活性的细胞因子。任选地，细胞因子可以组合使用。当收集病毒时，培养基可以替换为适合于培养靶细胞的培养基。例如，当靶细胞是人淋巴细胞时，可以使用适合于培养淋巴细胞的GT-T503培养基、GT-T-RetroI培养基、GT-T-RetroIII培养基(都由TAKARA BIOINC.制造)、X_VIV015培养基(由LONZA制造)、或AM-V培养基(由Invitrogen制造)。已知在病毒生产细胞培养过程中丁酸钠的添加增加在上清液中产生的病毒颗粒的量[Human Gene Therapy，第6卷，第1195-1202页(1995)]。因此制备的高滴度病毒上清液可以用于本发明的基因转移方法中，而没有问题。在步骤(a)中使用的含有逆转录病毒载体的液体的病毒滴度的例子包括但不限于IO7拷贝/mL或更多，优选IO8 - IO12拷贝/mL，且更优选IO9 - IO12拷贝/mL。上述病毒滴度是基于使用由TAKARA BIO Inc制造的Retrovirus Titer Set (用于实时PCR)测量的RNA拷贝数的计算结果。在描述显示病毒传染性的生物学滴度的情况下，滴度是上述数目值的 1/102 - 1/103。在本发明中使用的逆转录病毒结合物质并无具体限制，只要该物质显示与逆转录病毒的结合亲和力，并且其例子包括选自下述的至少一种物质纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、胶原V型、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖、及其片段。这些物质可以进行化学修饰，以增强与逆转录病毒结合的活性(例如专利文献2)。逆转录病毒结合物质还可以具有细胞结合活性，或逆转录病毒结合物质可以与细胞结合物质组合使用。细胞结合物质并无具体限制，只要该物质显示与细胞的结合亲和力，并且例如它选自细胞粘附蛋白质、激素、细胞因子、抗体、糖链、碳水化合物、代谢产物等。特异性结合靶细胞的抗体用于将基因特异性转移到特定细胞内。可以在本发明中使用的抗体并无具体限制。可以适当地选择针对在基因转移到其内的靶细胞上表达的抗原的抗体用于使用。通过使用识别在靶细胞上表达的⑶抗原的抗体，可以以高特异性将基因转移到靶细胞内。例如，基因转移可以通过使用抗CD4抗体针对辅助T细胞，通过使用抗CD8抗体针对杀伤T细胞，通过使用抗⑶34抗体针对造血干细胞。抗体可以根据已知方法产生。目前，许多抗体是商购可得的，并且它们也可以使用。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，只要它具有所需性质例如细胞特异性。另外，还可以使用用已知技术修饰的抗体或抗体的衍生物，例如人源化抗体、Fab片段或单链抗体。具有细胞粘附活性的蛋白质(纤连蛋白、层粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、玻连蛋白等)、其含有细胞结合结构域的片段、和多种糖蛋白及其糖链(例如高甘露糖型N联糖链)也可以用作细胞结合物质。此外，附着至逆转录病毒结合物质的细胞结合物质可以优选用于基因转移。上述物质可以得自天然存在的物质，人工制备(例如通过重组DNA技术或化学合成技术)，或通过组合天然存在的物质和人工制备的物质制备。对于使用上述物质的基因转移，也可以使用具有逆转录病毒结合位点的物质和具有细胞结合位点的另一种物质的混合物，或具有逆转录病毒结合位点和细胞结合位点的物质，如WO 97/18318中所述。作为上述物质，使用基本上不含与之天然结合的其他蛋白质的物质。·纤连蛋白及其片段优选用作具有逆转录病毒结合活性和细胞结合活性的物质。纤连蛋白及其片段可以以基本上纯的形式由天然存在的材料制备，根据如例如J. Biol.Chem.，第 256 卷，第 7277 页(1981)，J. Cell. Biol.，第 102 卷，第 449 页(1986)，或 J.Cell. Biol.，第105卷，第489页(1987)中所示的方法。纤连蛋白及其片段也可以使用如美国专利号5，198，423中所述的重组DNA技术进行制备。具体地，含有其为逆转录病毒结合位点的肝素-II结构域的纤连蛋白片段，例如包括纤连蛋白片段CH-296、H-271、H-296和CH-271的重组多肽以及用于获得其的方法在美国专利号5，198，423中详细描述。在如上所述的纤连蛋白片段中，H-296具有与VLA-4结合的区域的多肽，CH-271具有与VLA-5结合的区域的多肽，并且CH-296具有它们二者[Nature Medicine，第2卷，第876-882页(1996)]。CH-296在RetroNectin的注册商标下商购可得。在本发明中使用的培养容器的例子包括但不限于用于细胞培养的袋、用于细胞培养的板、用于细胞培养的培养皿、用于细胞培养的试管、和用于细胞培养的烧瓶。培养容器的材料并无具体限制，并且例如塑料或玻璃培养容器可以在本发明中使用。当希望基因转移到大量细胞内时，用于细胞培养的袋，特别是用于细胞培养的气体可渗透袋优选在本发明中使用。在逆转录病毒结合物质固定在培养容器的内表面的情况下，使用的培养容器的材料的例子包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、环烯烃树脂和氟树脂。将逆转录病毒结合物质固定至培养容器的方法可以适当地选择，取决于使用的物质类型和培养容器的类型。例如。当具有逆转录病毒结合活性的物质是多肽时，它可以通过物理吸附固定至培养容器的表面。具有逆转录病毒结合活性的物质也可以使用交联剂等通过共价键固定至培养容器。在步骤(a)中的温育温度条件并无具体限制，只要温度是小于25°C，并且其例子包括小于20°C、优选小于18°C、更优选1°C - 18°C、且进一步更优选1°C - 10°C的温度。温育时间并无具体限制，只要它是4小时或更久，并且从基因转移效率的观点来看，其例子包括超过5小时且不超过72小时、优选超过5小时且不超过48小时、更优选6小时-48小时、进一步更优选8小时-48小时、且再进一步更优选12小时-48小时。温育时间是例如40小时或更少、35小时或更少、30小时或更少、25小时或更少、20小时或更少、或18小时或更少。此外，温育时间是例如4小时或更久、6小时或更久、8小时或更久、12小时或更久、16小时或更久、18小时或更久、20小时或更久、或24小时或更久。在步骤(a)中温育的病毒液体的量是例如O. 5 mL - 1000 mL。尽管温育可以在保持静置的情况下执行，但逆转录病毒与培养容器的结合效率可以通过伴随振荡温育得到增加。振荡可以通过例如培养容器的水平式往复(来回)或定轨振荡、为培养容器提供倾斜的跷跷板样振荡或其组合执行。用于执行此类振荡的多种仪器是商购可得的。振荡条件并无具体限制，只要含有逆转录病毒载体的液体可以在培养容器中移动，取决于使用的培养容器的形状和大小。例如，在通过具有9°倾斜角的跷跷板样振荡的振荡情况下，振荡速率优选是20 rpm - 75 rpm、更优选30 rpm - 70 rpm、且进一步更优选30 rpm - 65 rpm。振荡的倾斜角可以在0° - 15°的范围中适当调整，其在本发明中并无具体限制。在水平式往复振荡的情况下，振荡速率是例如30 rpm - 300 rpm、优选35rpm - 280 rpm、且更优选 40 rpm - 260 rpm。当在步骤(a)中，用于细胞培养的袋用作培养容器，并且执行伴随振荡的温育时，待注射到袋内的病毒液体的容积可以考虑在振荡时在袋中病毒液体的流动性等适当地决定。注射到用于细胞培养的袋内的病毒液体容积是例如5 mL - 1000 mL、优选50 mL - 700 mL、且更优选100 mL - 500 mL。例如，当使用允许在振荡时在袋中溶液的高流动性的用于细胞培养的袋时，通过取决于袋的容积将合适量的病毒液体注射到袋内可以保证在振荡时在袋中病毒液体的足够流动性。当使用允许在振荡时在袋中溶液的低流动性的用于细胞培养的袋时，通过将无菌空气连同病毒液体一起注射到袋内增加在振荡时在袋中病毒液体的流动性，且从而可以增加预装载效率，如实施例6中所述。注射的病毒液体与注射的无菌空气的比是例如3:1 - 2:1。本发明的基因转移方法适合于制备大量基因转移的细胞，因为高度有效的基因转移可以使用用于细胞培养的袋在大规模基因转移中实现，如实施例9中所
/Jn ο当在步骤(a)中，具有约200 cm2或更多的培养面积的大规模袋用作培养容器，并且如实施例9中所述执行伴随振荡的温育时，优选振荡速率对于具有0°倾斜角的水平式往复振荡是30 - 70 rpm，或振荡速率对于具有3 - 5° (特别是4° )倾斜角的跷跷板型振荡是25 - 45 rpm，并且温育温度在1°C - 10°C的范围中，但本发明并不限于这些。温育时间优选8小时-20小时。当本发明使用用于细胞培养的袋执行时，逆转录病毒载体与袋的整个内表面结合。避免在袋的内表面之间的接触是优选的，因为它可以分开结合的逆转录病毒载体。例如，如上所述的逆转录病毒载体的分开可以通过使袋保持在硬板样产品之间得到避免。在温育后，含有逆转录病毒载体的液体可以替换为含有逆转录病毒载体的新鲜液体，并且可以如下文阐述的实施例2中所述执行进一步温育。可替代地，在温育后，可以向含有逆转录病毒载体的液体中加入含有逆转录病毒载体的新鲜液体，并且可以执行进一步温育。在执行步骤(a)后，执行下文阐述的“洗涤通过步骤(a)获得的培养容器”的步骤(bl)，并且随后可以再次重复步骤(a)。因而可以进一步改善基因转移效率。如下文阐述的实施例10中所示，当培养容器中的液体在步骤(a)中的温育后回收时，维持传染性的逆转录病毒载体保留在回收的液体中。回收的液体可以再用于本发明的基因转移方法。如果直接使用含有逆转录病毒载体的回收液体，或含有逆转录病毒载体的回收液体和含有逆转录病毒载体的未使用液体的混合物用于本发明的基因转移方法，那么使用的病毒量可以减少，并且因而提供经济优点。
例如通过测量在通过本发明的方法最终获得的细胞中基因转移的细胞比率(基因转移效率)或在通过本发明的方法最终获得的细胞中原病毒的拷贝数，可以证实逆转录病毒载体与培养容器的结合效率。基因转移效率可以通过已知方法进行测量。例如，当编码荧光蛋白质如ZsGreen的标记基因作为外源基因转移到细胞内时，基因转移效率可以通过用流式细胞仪计数具有转基因的细胞数目进行测量。当编码在细胞表面上表达的基因产物的基因用作外源基因时，通过利用与基因产物特异性结合的标记抗体，可以如上用流式细胞术测量基因转移效率。通过“将靶细胞加入通过步骤(a)获得的培养容器内，随后温育”的步骤(b)，将靶细胞用逆转录病毒载体感染，并且因而可以有效获得外源基因转移到其内的细胞。温育可以通过关于用逆转录病毒载体感染细胞的常规方法执行。例如，温育在适合于靶细胞的培养基中在35°C - 40°C (例如37°C)和2 - 10% (例如5%)的二氧化碳浓度的条件下执行。温育条件和时间可以取决于靶细胞的类型或目的适当地改变。例如，温育时间是4小时-96小时。在使用用于细胞培养的袋作为培养容器的情况下，逆转录病毒载体通过步骤(a)与袋的内表面两侧结合。随后，在步骤(b)中，将靶细胞加入袋内，随后温育一定时间段，并且其后，将袋颠倒转动并且进一步温育一定时间段，以促进靶细胞由在袋的两个内表面上·的逆转录病毒载体的感染，由此可以进一步改善基因转移效率。当基于致癌逆转录病毒的载体用作逆转录病毒载体时，它不能在Gtl期将外源基因转移到细胞的染色体DNA内。在这种情况下，优选通过用适合于靶细胞的生长因子预刺激将靶细胞导入细胞周期内。例如，多种细胞因子例如白细胞介素_3、白细胞介素-6和干细胞因子可以用于预刺激骨髓细胞或造血干细胞用于基因转移。当使用慢病毒载体时，预刺激不是必要的。已知在细胞表面上的受体在用逆转录病毒感染细胞中是重要的。例如，已知碱性氨基酸转运蛋白和磷酸盐转运蛋白分别充当用于亲嗜性病毒和双嗜性病毒的受体[Proc.Natl. Acad. Sci. USA，第93卷，第11407-11413页(1996)]。通过在含有减少量的碱性氨基酸、磷酸盐或盐或其前体的培养基中预处理细胞，以激活转运蛋白的表达或代谢周转，可以使得靶细胞对病毒感染敏感。可以用作用于通过本发明方法的基因转移的靶的细胞例子包括但不限于干细胞(造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等)、造血细胞、单核细胞(外周血单核细胞、脐带血单核细胞等)、胚胎细胞、原始生殖细胞、卵母细胞、卵原细胞、卵子、精母细胞、精子、红细胞前体细胞、淋巴样母细胞、成熟血液细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、成纤维细胞、成神经细胞、神经细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、癌细胞、骨髓瘤细胞和白血病细胞。本发明的方法优选利用衍生自血液和骨髓的造血细胞，因为这些细胞相对容易获得且因为用于培养和维持其的技术是确定的。特别地，当希望转移基因在体内的长期表达时，多能干细胞(造血干细胞、间充质干细胞等)和多种前体细胞适合作为靶细胞。当基因疗法应用于AIDS时，免疫细胞例如CD4阳性T细胞及其前体细胞适合作为靶细胞。例如，使用⑶4阳性T细胞作为靶细胞的基因疗法可以通过下述操作执行。首先，由供体收集含有CD4阳性T细胞的材料，例如骨髓组织、外周血或脐带血。此类材料可以直接用于基因转移程序中。然而，通常对该材料实施密度梯度离心等，以制备单核细胞级分。此外，可以执行使用CD4分子作为标记的细胞纯化、CD8阳性T细胞和/或单核细胞的去除、和用于扩增CD4阳性T细胞数目的培养程序。在需要时的合适预刺激(例如，用CD3配体、CD28配体或IL-2刺激)后，通过本发明的方法用携带目的基因的重组逆转录病毒载体感染因此获得的细胞群体。因此获得的基因转移的细胞可以例如通过静脉内施用移植到接纳体内。尽管接纳体优选是供体自身，但也可以执行同种异体移植。使用造血干细胞作为靶细胞的一些基因疗法用于补救患者中的缺陷或异常基因，例如用于ADA缺乏或Gaucher氏病的基因疗法。此外，例如，药物抗性基因可以转移到造血干细胞内，以便减轻由于用于癌症或白血病治疗的化学治疗剂的造血细胞损害。此外，通过转移编码识别抗原的T细胞受体的基因给予特异性针对表达肿瘤抗原的癌细胞的淋巴细胞细胞毒性活性的方法作 为用于癌症的基因疗法进行研究[GeneTherapy，第15卷，第695-699页(2008)]。此外，作出使用基因疗法治疗AIDS的尝试。在这种情况下，考虑将编码干扰HIV的复制或基因表达的核酸分子(例如单链特异性内切核糖核酸酶、反义核酸或核酶)的基因转移到T细胞例如由HIV感染的CD4阳性T细胞内，HIV是 AIDS 的成因因子[例如 WO 2007/020873, Human Gene Therapy,第 22 卷，第 35-43 页(2011)]。在步骤(b)中的加入靶细胞之前，如果含有逆转录病毒载体的液体含有对于基因转移和细胞培养不需要的物质，那么可以执行“洗涤逆转录病毒载体与之结合的培养容器”的步骤，以去除对于基因转移和细胞培养不需要的物质。更具体而言，包括“将含有携带外源基因的逆转录病毒的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器内，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒与之结合的培养容器”的步骤(a)、“洗涤通过步骤(a)获得的培养容器”的步骤(bl)、和“将靶细胞加入在步骤(bl)洗涤的培养容器内，随后温育”的步骤(b2)的基因转移方法，也是本发明的方面。在“洗涤逆转录病毒载体与之结合的培养容器”的步骤(bl)中，例如，可以使用磷酸盐缓冲盐水、Hanks盐水、用于培养靶细胞的液体培养基等。此外，人血清白蛋白等可以适当地加入上述盐水或培养基中。通过这个步骤，可以去除对于基因转移不需要的物质。通过所述步骤去除的物质的例子包括衍生自在病毒上清液中含有的包装细胞的逆转录病毒感染抑制物质[Human Gene Therapy,第 8 卷,第 1459-1467 页(1997), J. Virol.,第 70卷，第6468-6473页(1996)]，在培养逆转录病毒生产细胞过程中加入以便增强逆转录病毒生产的物质，例如佛波醇12-肉豆蘧酯13-乙酸酯(TPA)和地塞米松[Gene Therapy，第2卷，第547-551页(1995)]，以及如上所述的细胞废物和丁酸钠。
实施例在下文中，本发明通过实施例进一步具体描述。然而，本发明并不仅限于下述实施例。实施例I
通过多种病毒预装载方法将基因转移到SupTl细胞内 (I) DON-ZsGreen逆转录病毒载体的制备
将 pZsGreen 载体(由 Clontech 制造)用限制性酶 BamHI 和 EcoRI(由 TAKARA BIO INC.制造)消化，且实施琼脂糖凝胶电泳，以回收含有编码绿色荧光蛋白质ZsGreen的序列的约0.7 kbp片段。使用DNA Blunting Kit (由TAKARA BIO INC.制造)使回收的片段形成平端，并且随后插入pDON-AI DNA (由TAKARA BIO INC.制造)内，以获得重组逆转录病毒载体质粒pDON-ZsGreen。接下来,使用重组逆转录病毒载体质粒pDON-ZsGreen和RetrovirusPackaging Kit Eco (由 TAKARA BIO INC.制造)制备亲嗜性 DON-ZsGreen 病毒。其后，用亲嗜性DON-ZsGreen病毒感染GaLV逆转录病毒包装细胞PG13。由受感染细胞克隆具有高滴度的病毒生产细胞，以建立逆转录病毒载体生产细胞系PG13/D0N-ZSGreen。此外，使用在含有5 mM 丁酸钠的培养基中的生产细胞，通过常规方法获得GaLV/DON-ZsGreen病毒溶液(下文称为DON-ZsGreen逆转录病毒载体)。所得到的病毒溶液具有I. 88 X 101°拷贝/mL的RNA滴度。(2) ZsGreen基因转移到SupTl细胞内向未处理的24孔板(由Becton Dickinson制造)的每个孔中加入500 μ L 20 μ g/mLCH-296(产品名RetroNectin ;由TAKARA BIO INC.制造)，这是纤连蛋白片段。将板在4°C温育过夜，并且随后用500 UL PBS洗涤两次。将因此制备的板在本说明书的实施例中称为CH-296包被板。板根据需要进行制备。将实施例I-(I)中制备的DON-ZsGreen逆转录病毒载体用RPMI培养基稀释60倍，并且将I mL稀释的逆转录病毒载体加入CH-296包被板的每个孔中。研究三个类型的在预装载过程中(逆转录病毒载体通过RBV方法与培养容器的结合)板的振荡条件板在预装载的过程中无振荡(保持静置)，板以35 rpm和倾斜角9°用跷跷板型振荡器[Mild Mixer,SI-36 (由TAITEC Co.，Ltd.制造)]的振荡，和板以100 rpm、倾斜角O。和振荡宽度3 cm用水平式往复振荡器(Personal 10 INCUBATOR PERSONAL，由 TAITEC Co. ,Ltd.制造)的振荡。预装载在每种振荡条件下在4°C - 37°C的温育温度和2小时-24小时的温育时间执行。在温育后，去除病毒溶液，并且将每个孔用I mL含有I. 5% HAS的PBS/孔洗涤。随后，将SupTl细胞(ATC CCRL-1942)以5 X IO5细胞/mL悬浮于含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的培养基中，以I mL/孔加入上述病毒预装载的孔中，并且随后在37°C和5% CO2的温箱中培养，以执行逆转录病毒感染(通过逆转录病毒载体的基因转移)。在培养开始后第I天时(培养第I天)，将细胞悬液转移到新鲜的未处理的24孔板。随后，将4 mL/孔的含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的培养基加入板中，以将细胞悬液稀释5倍。将细胞悬液连续培养直至培养第3天时。(3)基因转移效率的分析
基因转移效率用流式细胞仪FACS CantoII (由Becton Dickinson制造)计算为在实施例I- (2)中获得的培养第3天时在细胞中的ZsGreen阳性细胞比率。结果显示于表I中。[表 I]
权利要求
1.一种使用逆转录病毒载体将外源基因转移到靶细胞内的方法，所述方法包括下述步骤(a)和(b) (a)将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器；和 (b)将靶细胞加入通过步骤(a)获得的培养容器内，随后温育。
2.根据权利要求I的方法，其中在步骤(a)中的所述温育时间是超过5小时且不超过48小时。
3.根据权利要求I的方法，其中在步骤(a)中的所述温育是伴随振荡的温育。
4.根据权利要求I用于转移基因的方法，其包含下述步骤(a)至(b2) (a)将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器内，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器； (bl)洗涤通过步骤(a)获得的培养容器；和 (b2)将靶细胞加入在步骤(bl)洗涤的培养容器内，随后温育。
5.根据权利要求I的方法，其中所述逆转录病毒结合物质是选自下述的至少一种纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、胶原V型、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖、及其片段。
6.根据权利要求I的方法，其中所述逆转录病毒结合物质还具有细胞结合活性。
7.根据权利要求I的方法，其中在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器是在其上固定逆转录病毒结合物质和细胞结合物质的培养容器。
8.根据权利要求7的方法，其中具有的细胞结合物质是选自下述中的至少一种细胞粘附蛋白质、激素、细胞因子、抗体、糖链、碳水化合物和代谢产物。
全文摘要
本发明公开的是使用逆转录病毒载体用于将基因引入靶细胞内的方法，其是简单和高度有效的。具体公开的是使用逆转录病毒载体用于将基因引入靶细胞内的方法，其包括步骤(a)将含有逆转录病毒载体(在其上具有携带的外源基因)的液体置于在其上已固定逆转录病毒结合物质的培养容器内，并且在低于25℃的温度温育液体4小时或更久，从而产生具有与之结合的逆转录病毒载体的培养容器，和(b)将靶细胞加入已在步骤(a)中产生的培养容器内，并且温育培养容器。该基因引入方法是简单和高度有效的，并且在医学、细胞技术、基因技术、发育技术等领域中是特别有用的。
文档编号C12N15/09GK102959080SQ201180032519
公开日2013年3月6日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年6月30日
发明者百百克行, 齐藤尚纪, 蝶野英人, 峰野纯一 申请人:宝生物工程株式会社