肠杆菌z0206细菌富硒多糖的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，包括以下步骤：挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，涂布于含硒的PDA加富培养基上进行驯化；通过测定细菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵；得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；将发酵液中收集上清液，再制备得到富硒粗多糖粉末；将所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；取所得的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7.0等处理后，取上清；向所得的上清液中加入Sevag试剂，得到脱蛋白富硒多糖；将所得到的脱蛋白富硒多糖配成0.5％的多糖溶液制备获得富硒多糖精品。
【专利说明】肠杆菌Z0206细菌富硒多糖的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐硒菌株驯化、富硒研究及利用该菌制备富硒多糖的方法和该富 硒多糖在提高免疫调节功能和抗氧化功能中的应用，它属于微生物学及生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 硒作为一种重要的微量元素，越来越受到科学界的重视。研究表明，硒具有提高机 体免疫力、抗氧化、解毒、抑制肿瘤、预防心血管疾病发生等功能。
[0003] 无机硒化合物毒性远高于有机硒化合物，且生物利用率低。只有将无机硒转化为 有机硒，才具有食用和保健价值。
[0004] 硒的生物有机化主要是通过动物、植物、微生物转化无机硒生产有机硒。通过生物 进行硒的有机化不仅可以为人类提供富含有机硒的食品及保健品，而且又可以为畜牧业生 产提供富含有机硒的添加剂，是一个极具有广阔前景的方法。
[0005] 部分可以进行硒有机化的微生物分泌的多糖具有免疫增强活性，表现出对宿主免 疫的介导和调节作用，通过刺激免疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢 复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其他生理因子的反应性。以此为基础，这些多糖表现 出与免疫力相关的多种活性功能，如抗肿瘤、降血糖、抗衰老、促进肝脏和骨髓细胞的蛋白 质和核酸的合成、抗炎及抗辐射作用等。
[0006] 近年来，我们通过多次筛选、纯化，从肉灵芝（陕西）上分离得到了一株胞外多糖 高产细菌菌株阴沟肠杆菌Z0206。所谓肉灵芝，在民间被称之为"太岁"，据《本草纲目》记 载，肉灵芝为本草上品，它是在我国发现的一种天然珍稀物种，即被我国科学界早已认定的 一种原生质生命体，确切定名应为"特大型粘菌复合体"。初步研究表明，菌株阴沟肠杆菌 Z0206对硒有较高的耐受能力，在无机硒培养基上生长可以将无机硒转化为有机硒，与其分 泌的多糖结合，以分泌的形式到达胞外，具有产量极高的特点，并且这种细菌活性富硒多糖 还具有一定的抗氧化和免疫调节活性。这种细菌富硒多糖在生物保健品及添加剂生产和开 发上有较高的实际应用价值。通过细菌的富硒培养，生产细菌富硒多糖作为天然保健生物 制剂，符合保健品开发及绿色饲料添加剂的发展要求，具有重要的社会现实意义和生态意 义。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法；包 括以下步骤：（1)肠杆菌Z0206耐硒菌株驯化：挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含 硒量分别为10、20、30、40以及50 μ g/mL的PDA加富培养基上，进行硒浓度梯度驯化；每个 梯度于28-32°C培养24-36h ;最后从含硒量50 μ g/mL的PDA加富培养基平板上挑取生长 良好的菌落于平板上划线分离，纯化后斜面保存；（2)肠杆菌Z0206富硒研究：通过测定细 菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；从斜面上挑取驯化好的菌种，PDA培养基平 板活化培养24-36h后，接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中；28-32°C振荡培养，每隔lh 无菌操作取出lmL培养液，用分光光度计测定580nm下的吸光值；绘制耐硒菌的生长曲线； 通过生长曲线确定加硒时间及培养时间；从斜面上挑取已经驯化好的耐硒菌种，接种于含 硒量分别为1〇、15、20、25、30以及35μ g/mL的PDA加富培养基上，28-32°C培养24-48h， 选取培养基上菌体颜色略红、生长良好的硒浓度作为最佳硒浓度；（3)发酵液获取：将耐硒 驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，28-32°C往复振 荡培养，培养时间18_19h，得到发酵罐发酵种子液；发酵罐内加入70%发酵培养基，121°C 蒸汽灭菌20min后，接种种子液，培养13h时加入无菌亚硒酸钠溶液，使培养基最终含硒 量为25 μ g/mL，发酵时间48-72h，得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；（4)多糖粉 末获取：将步骤（3)所得的发酵液于60-70°C浓缩为原体积的1/10, 80-90°C水浴1-1. 5h， 5000rpm离心10_15min，收集上清液，加入3-5倍体积的预冷95%乙醇，静置12h，5000rpm 离心10-15min，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤2-3次，离心，沉淀真空干燥，得 到富硒粗多糖粉末；(5)蛋白酶处理：将步骤（4)所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积 的热蒸馏水中，用似 20)3调pH至7. 0-9.0,加入质量为多糖质量1/40-1/20的胰蛋白酶， 55°C水解l_2h后，用草酸调pH值至5. 0-5. 7，加质量为多糖质量1/40-1/20的木瓜蛋白酶， 65-70°C水解2-3h后，于100°C水浴加热5-6min，以终止酶反应；（6)三氯乙酸法脱蛋白：取 步骤（5)所得的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7. 0,加入3%的三氯乙酸，室温下磁力搅 拌lh后，llOOOrpm离心10-15min，取上清；（7)Sevag法脱蛋白：向步骤（6)所得的上清液中 加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡，混合20-30min，充分静置分层，4000rpm离心5min, 重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用3-5倍体积预冷的95%乙醇醇析，所 得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，沉淀真空干燥，得到脱蛋白富硒多 糖；(8)脱色：将步骤（7)所得到的脱蛋白富硒多糖配成0.5%的多糖溶液，用氨水调pH至 8. 0,在50°C下滴加20%的H202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7. 0 ;自来 水透析2-3d，蒸馏水透析2-3d后，加入3-5倍体积的预冷95%乙醇沉淀，4°C静置12h后， 500rpm离心10?15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。
[0009] 作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的改进：所述步骤（1)、 (2)、（3)中，PDA加富固体培养基的配方如下：马铃薯20%，蛋白胨0.2-0. 5%，酵母浸膏 0.3%，葡萄糖2%，琼脂粉1.6% ;PDA加富液体培养基的配方如下：马铃薯20%，蛋白胨 0. 2-0. 5 %，酵母浸膏0. 3 %，葡萄糖2 %;发酵培养基配方为：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %， 玉米浆干粉 〇· 6 %，Κ2ΗΡ04· 3Η200· 3 %，ΚΗ2Ρ040· 3 %，CaCl20. 1 %。
[0010] 作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的进一步改进：所述步骤（2) 中，摇瓶发酵条件为：接种量3-5环，往复振荡的冲程4-10cm，振荡频率200-250rpm。
[0011] 作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的进一步改进：所述步骤（3) 中，发酵罐发酵条件为：接种量4%，pH值7. 5,温度32°C，通气量0. 25-0. 75vvm，机械搅拌 转速 200-300rpm。
[0012] 作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的进一步改进：所述步骤（7) 中的Sevag试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为4 :1。
[0013] 一种肠杆菌Z0206富硒多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健 品或添加剂中的应用。
[0014] 本发明所用的肠杆菌Z0206是保藏号为CGMCC No. 2279的肠杆菌Z0206。
[0015] 本发明的优点如下：
[0016] 采用苯酚-硫酸法、凯式定氮法、突光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中多 糖、蛋白质和砸含量；测定结果显不：阴沟肠杆囷Z0206 g砸粗多糖中多糖、蛋白质和砸含 量分别为：71. 23%、26. 34%及68. 16mg/kg ;阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和 硒含量分别为：99.98%、0.01%、38. 25mg/kg。结果表明，上述提取富硒多糖的生产过程简 单，产品纯度较高，富硒量较高。
[0017] 本发明制备的肠杆菌Z0206富硒多糖对血清溶血素半数溶血值（HC5(I)和抗体形成 细胞数目（PFC)均有显著的调节作用，对H 202诱导氧化损伤RAW264. 7细胞内SOD、GSH-Px 活性和MDA含量也具有显著的调节作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0019] 图1是本发明的中Z0206细菌生长曲线示意图。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例中所用肠杆菌Z0206是保藏号为CGMCC No. 2279的肠杆菌Z0206。
[0021] 实施例1、肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法
[0022] PDA加富培养基配方如下：马铃薯20 %，蛋白胨0. 3 %，酵母浸膏0. 3 %，葡萄糖 2%，琼脂粉1.6%。PDA加富液体培养基配方如下：马铃薯20%，蛋白胨0.3%，酵母浸膏 0. 3 %，葡萄糖2 %;发酵培养基配方如下：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %，玉米浆干粉0. 6 %，
【权利要求】
1. 一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征包括以下步骤： (1) 肠杆菌Z0206耐硒菌株驯化： 挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含硒量分别为10、20、30、40以及50μ g/mL的 PDA加富培养基上，进行硒浓度梯度驯化；每个梯度于28-32°C培养24-36h ;最后从含硒量 50 μ g/mL的PDA加富培养基平板上挑取生长良好的菌落于平板上划线分离，纯化后斜面保 存； (2) 肠杆菌Z0206富硒研究： 通过测定细菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；从斜面上挑取驯化好的菌 种，PDA培养基平板活化培养24-36h后，接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中；28-32°C 振荡培养，每隔lh无菌操作取出lmL培养液，用分光光度计测定580nm下的吸光值；绘制耐 硒菌的生长曲线；通过生长曲线确定加硒时间及培养时间； 从斜面上挑取已经驯化好的耐硒菌种，接种于含硒量分别为10、15、20、25、30以及 35 μ g/mL的PDA加富培养基上，28-32 °C培养24-48h，选取培养基上菌体颜色略红、生长良 好的硒浓度作为最佳硒浓度； (3) 发酵液获取： 将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵， 28-321：往复振荡培养，培养时间18-1911，得到发酵罐发酵种子液；发酵罐内加入70%发酵 培养基，121°C蒸汽灭菌20min后，接种种子液，培养13h时加入无菌亚硒酸钠溶液，使培养 基最终含硒量为25 μ g/mL，发酵时间48-72h，得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液； (4) 多糖粉末获取： 将步骤（3)所得的发酵液于60-70 °C浓缩为原体积的1/10, 80-90 °C水浴1-1. 5h， 5000rpm离心10_15min，收集上清液，加入3-5倍体积的预冷95%乙醇，静置12h，5000rpm 离心10-15min，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤2-3次，离心，沉淀真空干燥，得 到富硒粗多糖粉末； (5) 蛋白酶处理： 将步骤（4)所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，用Na2COjMpH至 7. 0-9. 0,加入质量为多糖质量1/40-1/20的胰蛋白酶，55°C水解l_2h后，用草酸调pH值至 5. 0-5. 7,加质量为多糖质量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70°C水解2-3h后，于100°C水浴 加热5-6min，以终止酶反应； (6) 三氯乙酸法脱蛋白： 取步骤（5)所得的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7. 0,加入3%的三氯乙酸，室温下 磁力搅拌lh后，llOOOrpm离心10-15min，取上清； (7) Sevag法脱蛋白： 向步骤（6)所得的上清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡，混合20-30min，充 分静置分层，4000rpm离心5min，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用3-5 倍体积预冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，沉淀 真空干燥，得到脱蛋白富硒多糖； (8) 脱色： 将步骤（7)所得到的脱蛋白富硒多糖配成0.5%的多糖溶液，用氨水调pH至8.0,在 50°C下滴加20%的H202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7. Ο ;自来水透析 2-3d，蒸馏水透析2-3d后，加入3-5倍体积的预冷95 %乙醇沉淀，4°C静置12h后，500rpm 离心10?15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。
2. 根据权利要求1所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤 (1) 、（2)、（3)中，PDA加富固体培养基的配方如下：马铃薯20%，蛋白胨0. 2-0. 5%，酵母浸 膏0. 3%，葡萄糖2%，琼脂粉1. 6% ;PDA加富液体培养基的配方如下：马铃薯20%，蛋白胨 0. 2-0. 5 %，酵母浸膏0. 3 %，葡萄糖2 %;发酵培养基配方为：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %， 玉米浆干粉
3. 根据权利要求2所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤 (2) 中，摇瓶发酵条件为：接种量3-5环，往复振荡的冲程4-10cm，振荡频率200-250rpm。
4. 根据权利要求2或3所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步 骤⑶中，发酵罐发酵条件为：接种量4%，pH值7.5,温度32°C，通气量0.25-0. 75vvm，机 械搅拌转速200-300rpm。
5. 根据权利要求4所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤 (7)中的Sevag试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为4 :1。
6. -种肠杆菌Z0206富硒多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健品 或添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK104087630SQ201410319712
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月6日 优先权日:2014年7月6日
【发明者】汪以真, 徐春兰, 靳明亮, 姚国佳 申请人:浙江大学