水稻斑马叶突变基因zebra15及其编码的蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻斑马叶突变基因ZEBRA15及其编码的蛋白和应用，水稻斑马叶突变基因ZEBRA15的核苷酸序列如SEQ?ID?No.12所示，氨基酸序列如SEQ?ID?No.13所示，与野生型相比水稻斑马叶突变基因ZEBRA15在第3个外显子上第64碱基由G转换为A，并导致第22位的编码氨基酸由甘氨酸变异为天冬氨酸，该基因突变后的水稻zebra15突变体在苗期至分蘖期间，当出现气温在短时期内骤降骤升时，植株的叶片表现是斑马叶性状，通过杂交发现该性状为隐性性状，因此能够利用此性状选育新品种和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义。
【专利说明】水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15及其编码的蛋白和应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15,还涉及该基因 编码的蛋白质和应用。 【背景技术】
[0002] 水稻（Orvza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有近半数的人 口以稻米为主食。杂交水稻的种植，显著提高了水稻的产量，从以前的每亩200-300斤，到 现在的每亩800斤，与第二次绿色革命一起差不多解决了全球的粮食危机，为保障国家乃 至世界粮食安全作出了巨大贡献。然而种子纯度是制约杂交稻发挥更大作用的重要制约因 子。近年来因杂交水稻种子不纯而给农民造成的损失越来越严重。这一问题已引起政府、 专家的高度重视。两系法杂交水稻的种子生产，近几年均出现过重大损失。1999年湖南曾 因遭遇低温造成2万亩制种大部分失败，损失超过千万元。2002年长江流域8月份的低温， 又严重损害了两系杂交稻种子生产。但是鉴定杂种种子纯度一直没有理想的技术方法已成 为我国种子产业发展的制约因素。利用苗期标记性状进行作物杂种一代新品种选育和种子 纯度鉴定，能在苗期通过观察标记性状的存在或消失与否来识别真假杂种，从而达到能及 早识别剔除杂种或非杂种株、实现亲本和杂交种种子纯度双重排杂、加强种子质量监督、大 大降低种子鉴定费用、保证田间品种纯度、增产节支等目的。该项技术直观准确，简便快速， 具有一般的异地种植鉴定和DNA分子标记鉴定技术无法比拟的优越性。近年来在作物育种 及种子纯度鉴定上的研究应用也越来越受到重视。前人已做了大量的工作，也取得了可喜 的成绩，成功选育了一些带标记的不育系，如紫叶标记不育系紫S、白化转绿型叶色标记不 育系玉兔S和NHR111SA。但由于多数苗期标记性状单系本身性状不优良、常导致其它重要 农艺性状显著降低，利用时都需要进行一个杂交转育过程以克服不良性状的遗传累赘，实 现优异性状的聚合，这个过程往往非常困难，都要通过大量长期的转育才能实现。因而，发 现一些稳定遗传、叶色变异对其它性状尤其产量、品质性状没有显著影响的叶色突变非常 重要。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15,该基因为苗 期标记性状，并且对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻转基因研究提供有力的工具，促 进杂交稻育种研究；本发明的目的之二在于提供水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15编码的蛋白 质；本发明的目的之三在于提供水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15的应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明利用甲基磺酸乙酯（EMS)诱变自育优良恢复系缙恢10 号获得一个遗传稳定的水稻"斑马叶"突变体，在遗传分析和基因定位的基础上，先通过 基因预测、同源搜索及基因序列差异比较，初步确定了水稻斑马叶突变性状为ZEBRA15隐 形基因控制，ZEBRA15为类受体蛋白激酶（0s05gl2680)。随后，本发明以水稻斑马叶突变 体zebral5为材料，克隆了水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15,具有如SEQ ID No. 12所示的核 苷酸序列，开放阅读框为2028bp，由8个外显子组成，编码675个氨基酸，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 13所示。与野生型缙恢10号相比，突变基因 ZEBRA15在第3个外显子上第64 碱基有G-A的转换，并导致第22位的编码氨基酸序列发生甘氨酸（Glycine)到天冬氨酸 (L-Aspartic-acid)的变异，突变位点位于催化域PKc。植物类受体蛋白激酶（RLK)是植物 体内信号分子的重要受体，已被证明参与植物生长发育及对环境刺激应答反应等多种信号 的转导过程，在植物生命活动中发挥着多种重要的生物学功能。当植物受到胁迫时，RLK能 识别和接受生物或非生物刺激的信号物，通过可逆磷酸化转导信号，诱导防御反应。
[0005] 然后，然后构建功能互补载体并转化zebral5突变体（G95)。经鉴定转基因阳性植 株叶片变绿，完全恢复为野生型叶型。进一步确定水稻斑马叶性状由ZEBRA15基因突变引 起，因此水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15能够用于在水稻斑马叶性状的分子育种。
[0006] 本发明的有益效果在于：本发明提供了水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15,该基因为 苗期标记性状，对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻遗传育种研究提供了有力的工具， 为选育纯种不育系奠定基础。 【专利附图】
【附图说明】
[0007] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0008] 图1为水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15基因的遗传和物理图谱（A为ZEBRA15的初 定位区间在第5染色体长臂SSR标记RM3322和RM6082间；B为将ZEBRA15基因精细定位 在标记nSSR516与nSSR502间25kb的范围内；C为所在区域BAC克隆；D为突变体ZEBRA15 的候选基因0sl0g40960. 1的结构及突变位置）。
[0009] 图2为水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定（其 中1泳道为PLAS5000DNA Marker，2泳道为野生型缙恢10号的RT-PCR产物，3泳道为突变 体 zebral5 的 RT-PCR 产物）。
[〇〇1〇] 图3为水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15编码蛋白类受体蛋白激酶的氨基酸序列结构 域分析。
[0011] 图4为ZEBRA15基因编码蛋白的进化树分析结果。
[0012] 图5为互补重组载体构建图。
[0013] 图6为ZEBRA15突变体互补表型分析，其中wt为野生型，zebral5为斑马叶突变 体，c-zebral5为斑马叶突变体zebral5转野生型ZEBRA15基因阳性植株。 【具体实施方式】
[0014] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0015] 本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号（wt)和斑马叶突变体 (zebral5)，均由本实验室培育；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚合 酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMD19-T载体、Trizol试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质 粒提取试剂盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL5,000DNA Marker 购自 TaKaRa 公司；DNA Marker III购自天根生化科技（北京）有限公司；氨节青霉素（Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素（Kanamycin，Kan)为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有 限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌DH5 α、农杆菌 LBA4404由本实验室保存。
[0016] 实施例1、水稻斑马叶突变体zebral5的获得和形态学观察 [〇〇17] 利用甲基磺酸乙酯（EMS)诱变自育优良恢复缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻 "斑马叶"突变体，命名为zebral5。水稻"斑马叶"突变体zebral5,在苗期至分蘖期间，当 出现气温在短时期内骤降骤升时（即V型变化），植株的叶片即会出现有规律的垂直于叶脉 的淡黄色（严重时为白色）与绿色相间的斑马纹，叶鞘部分表现为正常绿色。待温度稳定回 升一段时间后，该表型即会缓慢恢复为正常绿色。当温度反复出现这种V型变化时，"斑马 纹"突变表型会反复出现。表明突变体 zebral5可能主要响应极端温、光变化，进而影响光 保护系统而形成斑马叶。该性状经过多代观察，表现稳定遗传，并且其他主要农艺性状（如 产量、品质性状）没有显著降低。
[0018] 实施例2、突变zebral5基因遗传分析与定位
[0019] 以zebra-15突变体为父本，籼稻品种西农lA(XinonglA)为母本杂交获得Fi代植 株叶片全部表现为正常绿色，然后通过自交获得4350株F 2代群体中，依据斑马叶性状分离 出了突变叶片和正常叶片两种表型，分离出1054株突变单株，其余为正常株，可以看出正 常株与突变株符合3 :1的分离比例，表明该突变性状由一对隐性单基因控制。
[0020] 初步定位：选取均匀分布于水稻12条染色体上的480对SSR引物，在亲本 zebra-15和西农1A间检测多态性，其中有98对SSR引物显示多态性。用这98对引物在正常 和突变基因池中进行基因连锁分析，筛选与基因 Zebra-15连锁的SSR标记，发现Zebra-15 与第5染色体短臂上标记RM3322和RM6082连锁。用连锁标记RM3322和RM6082分析150 株隐性突变单株，结果显示，基因 Zebra-15与标记RM3322和RM6082之间的遗传距离分别 为 19. 6cM 和 6. OcM (图 1A)。
[0021] 精细定位：根据已公布的籼稻品种93-11序列，在标记RM3322和RM6082间进一步 筛选和开发了 36对SSR引物，其中有4对在亲本间表现多态性（表1)。用这4对引物分析所 有1054株突变单株，结果表明：标记nSSR511、nSSR516、nSSR502和RM169与基因 Zebra-15 之间的遗传距离分别为8. 6cM、0. lcM、l. OcM和1. OcM(图1B)。最终Zebra-15被定位在标 记nSSR516和nSSR502之间约258kb (此为93-11序列上的长度，日本晴上为288kb)的范 围内，此区间包括三个BAC克隆：AC108498、AC137001和AC146716(图1C)。
[0022] 表1、4对具有多态性的SSR标记序列
[0023]
【权利要求】
1. 水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15,其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示。
2. 权利要求1所述水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15编码的蛋白质，其特征在于：氨基酸 序列如SEQ ID No. 13所示。
3. 权利要求1所述水稻斑马叶突变基因 ZEBRA15在水稻斑马叶性状的分子育种中的应 用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述水稻为缙恢10号。
【文档编号】C12N15/82GK104087603SQ201410319603
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】赵芳明, 何光华, 施军琼, 王秋实, 桑贤春, 凌英华, 李云峰, 王楠, 杨正林 申请人:西南大学