本发明属于微生物领域，具体涉及一种由多种微生物菌悬液制成的复合菌剂。
背景技术：
石油已经成为人类最主要的能源之一，每年的石油总产量已经超过了22亿吨，其中约18亿吨是由陆地油田生产的，仅石油的开采、运输、储存以及事故性泄漏等原因造成每年约有800～1000万吨石油烃进入环境(不包括石油加工行业的损失)。我国每年有近60万吨石油进入环境，引起土壤、地下水、水系和海洋的严重污染。有关主要污染物的调查统计报告显示，我国年产石油污染土壤近10万吨，累计堆放量近50万吨。石油物质进入土壤后，特别是进入土壤深层后，会引起土壤理化特性的变化，使土壤的有效磷、氮含量减少，恶化土壤微生物的生存环境，破坏土壤结构，对作物生长发育产生严重影响，同时还会危及地下水水质安全。
近年来，世界各国开始重视污染土壤的治理技术，针对不同的污染状况，已经形成了一系列的土壤石油污染修复技术，分为物理修复方法、化学修复方法和生物修复三大类。其中物理、化学土壤修复技术存在着处理费用较高，易再次形成污染的危险，化学药剂存储和使用在着较大安全隐患(如双氧水、二氧化氯在合适条件下易发生爆炸，臭氧泄漏危害周边空气质量安全，)以及副产物所导致的二次污染等问题，均不是土壤修复，特别是深层石油污土壤修复的最佳方法。
生物修复技术作为一种新兴的有前景的处理技术，特别是在深层油污染土壤修复领域，相对于物理和化学修复技术具有很大优势：(1)生物修复技术优于其它新技术的显着特点是通常能一步到位，消除了污染物在多次转移过程中造成二次污染的可能性；(2)从污染物处理的过程分析，生物修复技术与其它的物理化学处理技术相比较处理过程消耗低、成本低且处理条件要求低环境影响小，且无二次污染最大限度地降低污染物的浓度；(3)生物修复技术在处理 受污染的土壤的同时还兼有净化地下水的作用。
生物修复技术具有诸多优点，但一种微生物可代谢的污染物范围是有限的，污染地区的土著微生物种群可能无法降解复杂的石油烃类化合物。通常采用生物强化技术，即通过向处理系统中投加原来不存在的，外源微生物体系，以提高石油污染土壤的处理效果，使原土壤体系无法处理的污染物得到有效地去除，因此，通过对比、筛选等手段获得降解速率最大的外源微生物群体或形成对某些难降解的有机物有更强去除效果的稳定的微生物体系，对深层油污土壤生物修复技术的顺利实施起到决定性作用。
根据目前文献报道，微生物菌剂的开发多用于水污染及生活垃圾等领域有害物质的降解，或是对单一高分子有害物质的降解应用，在石油污染土壤领域虽有应用，但尚处在实验阶段，且研究内容主要针对土著微生物对浅层油污染土壤的修复领域，上述研究均未提及深层油污土壤微生物修复或本研究菌剂所含微生物系统对石油烃类降解的相关研究。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决目前缺少适用于以石油烃类为主要污染源的深层油污染土壤修复的问题，而提供一种用于深层油污土壤微生物修复的复合菌剂。
该用于深层油污土壤微生物修复的复合菌剂按重量份数比包括15～25份黑曲霉菌(Aspergillus Niger Van Tieghem)ATCC 16404悬液、20～28份杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)CICC2474悬液、15～25份产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)ATCC10106悬液、22～27绿色木霉菌(Tichoderma Viride Pers.Ex Fr.)ACCC30169悬液、25～35出芽短梗霉菌(Aureobasidi um Pullulans(DeBary)Arnaud)DSM14940悬液、8～15份枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillus acidophaeus)ATCC 9372悬液；以上六种细菌悬液中的有效活菌数均达到109个/mL以上。
该复合菌剂按重量份数比还包括5份的生物表面活性剂吐温80(Tween-80)以及7份的生物表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(LAS)。
该菌剂为液态制剂，也可在冷冻干燥机中制成固态冻干白色粉剂。
以上六个菌种均可以通过其相应的保藏机构购买获得。
以上两种生物表面活性剂包括非离子表面活性剂吐温-80(Tween-80)以及阴离子生物表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(LAS)均可通过常规化学试剂生产厂 家购买获得。
本发明所述的微生物复合菌剂及生物表面活性剂可以用于修复深层石油污染土壤，对土壤中的石油烃类污染物具有优良的降解作用。
本发明所述的微生物复合菌剂和生物表面活性剂复剂用于修复石油污染土壤时，土壤中的石油含量应不高于15wt％。
深层油污染土壤微生物复合菌剂修复步骤如下：
(1)将该复合菌剂按重量份数比包括15～25份黑曲霉菌ATCC 16404悬液、22～27份杂色曲霉菌CICC2474悬液、18～22份产黄青霉菌ATCC10106悬液、23～26绿色木霉菌ACCC30169悬液、29～31份出芽短梗霉菌DSM14940悬液、10～12份枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC 9372悬液；分别按照相应保藏机构推荐方法复活、扩大培养至有效活菌数均达到109个/mL以上后，备用。
(2)在保持土壤湿润的条件下，按照含油率为＜15wt％的污染土壤，厚度为50cm，面积为100m2的处理面积，需要投加使用菌剂2～4kg标准。首先将菌种一次性全部投加、混合后即完成接种。
(3)每隔两周，按照上述配比添加微生物复合菌剂包含营养液，同时增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，并随时加水以保持土壤的含水率在30％以上，直至土壤的含油率下降到1wt％以下后，更改为每一个月添加一次微生物复合菌剂及营养液直至达到要求的指标为至；
(4)每周检测石油烃类降解率、原油各组分及细菌数量，观察油污染土壤颜色，颜色接近正常土壤颜色，含油量达标；
投加生物表面活性剂的深层油污染土壤微生物修复步骤如下：
(1)将该复合菌剂按重量份数比包括15～25份黑曲霉菌ATCC 16404悬液、22～27份杂色曲霉菌CICC2474悬液、18～22份产黄青霉菌ATCC10106悬液、23～26绿色木霉菌ACCC30169悬液、29～31份出芽短梗霉菌DSM14940悬液、10～12份枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC 9372悬液；分别按照相应保藏机构推荐方法复活、扩大培养至有效活菌数均达到109个/mL以上后，备用。
(2)按重量份数比将5份的生物表面活性剂吐温80(Tween-80)以及7份的生物表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(LAS)备用；
(3)在保持土壤湿润的条件下，按照含油率为＜15wt％的污染土壤，厚度为50cm，面积为100m2的处理面积，需要投加使用菌剂及生物表面活性剂共计 2～4kg标准。首先将菌种按(1)中比例一次性全部投加、混合后即完成接种，再按照上(2)中比例投加生物表面活性剂并混合。
(3)每隔两周，按照上述配比添加微生物复合菌剂、表面活性剂及营养液，同时增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，并随时加水以保持土壤的含水率在30％以上，直至土壤的含油率下降到1wt％以下后，更改为每一个月添加一次微生物复合菌剂直至达到要求的指标为至；
(4)每周检测石油烃类降解率、原油各组分及细菌数量，观察油污染土壤颜色，颜色接近正常土壤颜色，含油量达标；
以上六个菌种的活化方法均采用保藏机构相关推荐活化方法进行，并采用活菌培养计数法检测，保证菌悬液增值至有效活菌数均达到109个/mL以上。
本发明提供了所述微生物复合菌剂用于修复15wt％浓度以下的深层油污染土壤。按照含油率为＜15wt％的污染土壤，厚度为50cm，面积为100m2的处理面积，需要投加使用菌剂及生物表面活性剂添加量为2～4kg。
此外，本发明还提供了利用本发明的微生物复合菌剂现场修复深层油污染土壤的方法。该方法主要包括以下步骤：
(1)将六种细菌分别进行复活及扩大培养备用；
(2)将生物表面活性剂按比例称量备用；
(3)按照含油率为＜15wt％的污染土壤，厚度为50cm，面积为100m2的处理面积，需要投加使用菌剂及生物表面活性剂添加量为2～4kg，与土搅拌混匀；
(4)每隔两周，按照上述配比添加微生物复合菌剂、生物表面活性剂包含营养液，同时增补水分并进行土壤的翻耕曝氧；
(5)每一个月再按照上述配比添加生物表面活性剂、浇洒复合菌剂，定期翻耕浇水；
(6)每周快速检测石油烃类降解率、原油各组分及细菌数量，观察油污染土壤颜色，颜色接近正常土壤颜色，含油量达标；
营养元素含量，直至受污土壤颜色接近正常，石油烃类含量达标。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果。
本发明以降解石油烃类污染物的微生物单体为出发点，对比、筛选了一组以细菌和真菌组成的混合菌群，并优化了它们的配比制成复合菌剂，同时研究 了微生物复合菌剂和生物表面活性剂的联合修复深层油污染土壤的应用方法，通过所述方法，可使土壤中石油烃类(TPH)降解达90％以上。
本发明的联合修复剂中的生物表面活性剂有利于改善油/水/微生物细胞界面的接触行为，在促进微生物降解土壤中石油的基础上，再加入微生物复合菌剂，可以广泛降解油污土壤中石油烃类物质。本发明同时提供了该微生物复合菌剂的最优配比、用量，以及现场修复石油污染土壤应用的方法。
利用本发明的联合修复剂及修复方法能有效降低土壤中的石油烃含量，实现油污土壤的复耕，恢复土壤的生态功能。根据土壤中石油含量不同，一般3-4个月左右即能使土壤中石油烃类污染物降解到标准范围。
具体实施方式
实施例1
本实施方式的用于深层油污染土壤生物修复工艺的复合菌剂按重量份数比包括20份黑曲霉菌ATCC 16404悬液、24份杂色曲霉菌CICC2474悬液、20份产黄青霉菌ATCC10106悬液、24份绿色木霉菌ACCC30169悬液、30份出芽短梗霉菌DSM14940悬液、11份枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC 9372悬液；以上六种细菌悬液中的有效活菌数均达到109个/mL以上。
该复合菌剂的制备方式如下
(一)细菌的活化及菌悬液制备：该细菌复合菌剂中的六种细菌活化、菌悬液的制备方法分别采用各自相关保藏机构推荐方法进行，并通过活菌培养计数，保证菌悬液中的有效活菌数到达109个/mL以上。
(二)将步骤(一)中得到的六种细菌悬液按照所述重量份数比混合后即得到本实方法的复合菌剂。以上六种菌种均可通过其相应的保藏机构购买获得。
将实施方式的复合菌剂在保持土壤湿润的条件下，按照含油率为＜15wt％的污染土壤，厚度为50cm，面积为100m2的处理面积，需要投加使用菌剂2～4kg标准，一次性全部投加、混合后即完成接种；每隔一周，按照上述配比添加微生物复合菌剂及营养液，同时增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，并随时加水以保持土壤的含水率在30％以上；直至土壤的含油率下降到1wt％以下后，更改为每一个月添加一次微生物复合菌剂及营养液直至达到要求的指标为止；
每周快速检测石油烃类降解率、原油各组分及细菌数量，观察油污染土壤 颜色，颜色接近正常土壤颜色，含油量达标；
实施例2
本实施方式的用于深层油污染土壤生物修复工艺的复合菌剂按重量份数比包括20份黑曲霉菌ATCC 16404悬液、24份杂色曲霉菌CICC2474悬液、20份产黄青霉菌ATCC10106悬液、24份绿色木霉菌ACCC30169悬液、30份出芽短梗霉菌DSM14940悬液、11份枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC 9372悬液；以上六种细菌悬液中的有效活菌数均达到109个/mL以上。
本实施方式的重量份数比还包括5份的生物表面活性剂吐温80(Tween-80)以及7份的生物表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(LAS)。生物表面活性剂的加入有利于改善油/水/微生物细胞界面的接触行为。
将实施方式的复合菌剂在保持土壤湿润的条件下，按照含油率为＜15wt％的污染土壤，厚度为50cm，面积为100m2的处理面积，需要投加使用菌剂2～4kg标准，一次性全部投加、混合后即完成接种，并按重量比投加两种生物表面活性剂；每隔一周，按照上述配比添加微生物复合菌剂、生物表面活性剂及营养液，同时增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，并随时加水以保持土壤的含水率在30％以上；直至土壤的含油率下降到1wt％以下后，更改为每一个月添加一次微生物复合菌剂及营养液直至达到要求的指标为止；
每周快速检测石油烃类降解率、原油各组分及细菌数量，观察油污染土壤颜色，颜色接近正常土壤颜色，含油量达标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。