一种具有除臭功能的耐低温堆肥发酵菌剂及其应用的制作方法

本发明属于复合微生物菌剂领域，具体涉及一种具有除臭功能的耐低温堆肥发酵菌剂及其应用。
背景技术：
：我国农业有机废弃物的产生量巨大，据估计每年产生畜禽粪便30亿吨，农作物秸秆7亿多吨，这些有机废弃物富含大量作物生产所需的营养元素。通过好氧堆肥的方法可以将这些有机废弃物资源化为优质有机肥，传统堆肥方法由于初期有效微生物数量少，需要一定时间才能繁殖起来，存在发酵时间长，臭气排放大，营养元素流失多，资源浪费严重等问题，尤其是在北方的秋冬季，由于外界环境温度低，堆肥发酵起温难的问题尤为突出。另外，堆肥过程常伴随着恶臭气体的产生，使人食欲不振、头昏脑胀、恶心、呕吐，成为影响堆肥产业发展的重要制约因素。恶臭气体主要成分包括硫化物、氨类、低级脂肪胺、芳烃、羟基化合物、醇类、低级脂肪酸及吲哚等，其中氨气和硫化氢是主要的恶臭气体组成成分，这些气体的挥发既污染了环境又损失了氮元素，降低了堆肥产品的肥效。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种复合微生物菌剂。本发明提供的复合微生物菌剂的活性成分为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、米曲霉Aspergillusoryzae、黑曲霉Aspergillusniger、嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus和嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile。上述菌剂中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa、所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、所述米曲霉Aspergillusoryzae、所述黑曲霉Aspergillusniger、所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus和所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile的cfu的配比为(30-60)：(30-60)：500：(200-500)：(20-50)：(20-50)：(100-200)：(20-30)。上述菌剂中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa、所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、所述米曲霉Aspergillusoryzae、所述黑曲霉Aspergillusniger、所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus和所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile的cfu的配比具体为5：5：30：50：2：2：20：2或5：6：50：50：5：3：10：2。上述菌剂中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae为酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502CGMCCNo.12701；所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa为麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501CGMCCNo.12702；所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025CGMCCNo.12705；所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens为解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617CGMCCNo.12703；所述米曲霉Aspergillusoryzae为米曲霉AspergillusoryzaeW060406CGMCCNo.12627；所述黑曲霉Aspergillusniger为黑曲霉AspergillusnigerW30117CGMCCNo.12625；所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus为嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208CGMCCNo.12704；所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile为嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441CGMCCNo.12626。本发明的第二个目的是提供一种复合微生物菌剂的制备方法。本发明提供的复合微生物菌剂的制备方法为将酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂、麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂、米曲霉Aspergillusoryzae菌剂、黑曲霉Aspergillusniger菌剂、嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂和嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂混匀得到的。上述方法中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂、所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂、所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂、所述米曲霉Aspergillusoryzae菌剂、所述黑曲霉Aspergillusniger菌剂、所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂和所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂的质量比为(1-3)：(1-3)：2：(1-3)：(1-3)：(1-3)：(1-2)：(1-2)。上述方法中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂、所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂、所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂、所述米曲霉Aspergillusoryzae菌剂、所述黑曲霉Aspergillusniger菌剂、所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂和所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂的质量比具体为12：10：14：12：10：14：15：13或12：13：8：14：15：13：8：8。上述方法中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae为酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502CGMCCNo.12701；所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa为麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501CGMCCNo.12702；所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025CGMCCNo.12705；所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens为解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617CGMCCNo.12703；所述米曲霉Aspergillusoryzae为米曲霉AspergillusoryzaeW060406CGMCCNo.12627；所述黑曲霉Aspergillusniger为黑曲霉AspergillusnigerW30117CGMCCNo.12625；所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus为嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208CGMCCNo.12704；所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile为嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441CGMCCNo.12626。上述方法中，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂的制备方法如下：将酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株接种于YPD培养基中，在29℃，200rmp的条件下培养20小时，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:5的比例(具体为1:7)吸附混匀，得到酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂。其中，酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株的浓度为50亿cfu/g。所述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂的制备方法为：将麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501菌株接种于YPD培养基中，在30℃，200rmp条件下培养22小时，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:5的比例(具体为1:7)吸附混匀，得到麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂。其中，麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501菌株的浓度为60亿cfu/g。所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025菌株接种牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:2的比例(具体为1:5)吸附混匀，得到枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂。其中，枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025菌株的浓度为500亿cfu/g。所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在31℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:2的比例(具体为1:5)吸附混匀，得到解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂。其中，解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株的浓度为500亿cfu/g。所述米曲霉Aspergillusoryzae菌剂的制备方法为：将米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株接种于PDA培养基中，在28℃，100rmp条件下培养18h，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:2的比例(具体为1:5)吸附混匀，得到米曲霉Aspergillusoryzae菌剂。其中，米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株的浓度为50亿cfu/g。所述黑曲霉Aspergillusniger菌剂的制备方法为：将黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株接种于PDA培养基中，在32℃，100rmp条件下培养20h，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:2的比例(具体为1:5)吸附混匀，得到黑曲霉Aspergillusniger菌剂。其中，黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株的浓度为30亿cfu/g。所述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂的制备方法为：将嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在40℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:2的比例(具体为1:5)吸附混匀，得到嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂。其中，嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208菌株的浓度为100亿cfu/g。所述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂的制备方法为：将嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株接种于PDA培养基中，在45℃，100rmp条件下培养20h，然后3000r/min离心浓缩15-20min后，与沸石粉按照质量比为1:9-1:2的比例(具体为1:5)吸附混匀，得到嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂。其中，嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株的浓度为20亿cfu/g。本发明的第三个目的是提供上述复合微生物菌剂的新用途。本发明提供了上述复合微生物菌剂在如下(1)-(8)中任一种中的应用：(1)制备堆肥发酵剂或腐熟剂；(2)堆肥，特别是低温条件下堆肥；(3)有机物料或有机废弃物的发酵；(4)加快发酵堆体的升温速度；(5)减少腐熟过程中臭味气体的排放；(6)提高植物的株高和/或根长和/或根鲜重和/或根干重和/或产量；(7)降低果树果实的畸形果率；(8)提高果树果实的单果重和/或含糖量和/或产量；所述臭味气体为硫化氢和/或二氧化硫和/或二氧化氮和/或氨气。本发明的第四个目的是提供一种用于堆肥的腐熟剂。本发明提供的腐熟剂由上述复合微生物菌剂与载体组成。上述腐熟剂中，所述载体为稻壳粉或沸石粉或稻壳粉与沸石粉的混合物。上述腐熟剂中，所述载体的细度大于等于60目。上述腐熟剂中，所述复合微生物菌剂与所述载体的质量比为(49-201):909。上述腐熟剂中，所述复合微生物菌剂与所述载体的质量比具体为49:451或91:909。本发明的第五个目的是提供上述腐熟剂的新用途。本发明提供了上述腐熟剂在如下1)-7)中任一种中的应用：1)堆肥，特别是低温条件下堆肥发酵；2)有机物料或有机废弃物的发酵；3)加快发酵堆体的升温速度；4)减少腐熟过程中臭味气体的排放；5)提高植物的株高和/或根长和/或根鲜重和/或根干重和/或产量；6)降低果树果实的畸形果率；7)提高果树果实的单果重和/或含糖量和/或产量；所述臭味气体为硫化氢和/或二氧化硫和/或二氧化氮和/或氨气。本发明的第六个目的是提供一种堆肥的方法。本发明提供的堆肥的方法包括如下步骤：用上述腐熟剂处理有机物料或有机废弃物。上述方法中，所述腐熟剂与所述有机物料或有机废弃物的质量比为(1-5)：1000。上述方法中，所述有机物料可以但不限于禽畜粪便、农作物秸秆、蔬菜尾菜秸秆、蘑菇渣、糠醛渣、污泥等。本发明的第七个目的是提供一种有机肥料的制备方法。本发明提供的有机肥料的制备方法包括如下步骤：用上述腐熟剂处理有机物料或有机废弃物，得到有机肥料。上述方法中，所述腐熟剂与所述有机物料或有机废弃物的质量比为(1-5)：1000。上述方法中，所述有机物料可以但不限于禽畜粪便、农作物秸秆、蔬菜尾菜秸秆、蘑菇渣、糠醛渣、污泥等。上述方法制备得到的有机肥料也属于本发明的保护范围。本发明的最后一个目的是提供上述有机肥料的新用途。本发明提供了上述有机肥料在如下a1)-a3)中任一种中的应用：a1)提高植物的株高和/或根长和/或根鲜重和/或根干重和/或产量；a2)降低果树果实的畸形果率；a3)提高果树果实的单果重和/或含糖量和/或产量。本发明提供了一种堆肥复合发酵剂，其所含的微生物菌群可以耐受低温，在15-20℃可以正常生长，有利于有机物料在低温环境中发酵气温，各菌种间相互促进，产生相互协同效果，从而加速腐熟。通过实验证明：在堆肥过程中，将本发明的堆肥复合发酵剂添加到有机物料中进行发酵，不仅提高了堆肥初期有效微生物的总数，加快了堆肥物料升温速度，缩短了厌氧发酵时间，加快了腐熟进程，而且减少含硫、氮化合物的排放，优化了发酵产物的理化性质，具有一定除臭功能。附图说明图1为实施例2中的发酵堆体的温度变化。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为温度(℃)。图2为实施例3中的发酵堆体的温度变化。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为温度(℃)。图3为菌株W11025的形态及生理生化鉴定结果。图4为菌株W11025的16srDNA的序列。图5为菌株W160617的细胞形态和生理生化鉴定结果。图6为菌株W11025的16srDNA的序列。图7为菌株W052501的理化特征。图8为菌株W052501的rRNA基因D1D2区序列。图9为菌株W30117的ITS序列的序列。保藏说明菌种名称：酿酒酵母拉丁名：Saccharomycescerevisiae菌株编号：W052502保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12701菌种名称：麦芽糖假丝酵母拉丁名：Candidamaltosa菌株编号：W052501保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12702菌种名称：枯草芽孢杆菌拉丁名：Bacillussubtilis菌株编号：W11025保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12705菌种名称：解淀粉芽孢杆菌拉丁名：Bacillusamyloliquefaciens菌株编号：W160617保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12703菌种名称：米曲霉拉丁名：Aspergillusoryzae菌株编号：W060406保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12627菌种名称：黑曲霉拉丁名：Aspergillusniger菌株编号：W30117保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12625菌种名称：嗜热脂肪芽孢杆菌拉丁名：Bacillusstearothermophilus菌株编号：W10208保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12704菌种名称：嗜热侧孢霉拉丁名：Sporotrichumthermophile菌株编号：W2441保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年6月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12626具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的YPD培养基的溶剂为水，溶质及其在培养基中的质量分数为1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖。下述实施例中的牛肉膏蛋白胨培养基的溶剂为水，溶质及其在培养基中的质量分数为0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖、0.5％氯化钠。下述实施例中的PDA培养基的制备方法为200g马铃薯去皮，切成小块，于锅中加水1000mL煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，并加水补足1000mL。实施例1、菌株的分离及鉴定一、菌株W11025的分离与鉴定1、菌株W11025的分离将采自堆肥的样品(2014年10月内蒙古五原县)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W11025。2、菌株W11025的鉴定(1)菌株W11025的形态及生理生化鉴定菌株W11025的形态及生理生化鉴定结果如图3所示。(2)菌株W11025的分子鉴定提取菌株W11025的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株W1102516SrDNA保守区的片段。引物序列如下：27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增得到的菌株W11025的16srDNA的序列如图4所示。3、菌株W11025的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W11025的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12705。二、菌株W160617的分离及鉴定1、菌株W160617的分离将采自堆肥的样品(2014年10月内蒙古五原县)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W160617。2、菌株W160617的鉴定(1)菌株W160617的形态及生理生化鉴定菌株W160617的细胞形态和生理生化鉴定结果图5所示。(2)菌株W160617的分子鉴定提取菌株W160617的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株W16061716SrDNA保守区的片段。引物序列如下：27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增得到的菌株W11025的16srDNA的序列如图6所示。3、菌株W160617的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W160617的分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12703。三、菌株W052501的分离及鉴定1、菌株W052501的分离将采自堆肥的样品(2015年12月北京市平谷区)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在YPD培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W052501。2、菌株W052501的鉴定(1)菌株W052501的形态鉴定在YPD培养基中25℃培养三天，细胞卵形、椭圆形、腊肠形，大小为(3.2-6.0)×(4.9-11.6)μm。YPD培养基斜面25℃培养一个月，菌落奶酪状，乳白色，表面平滑，不反光，边缘树根状。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，产生假菌丝。(2)菌株W052501的生理生化鉴定菌株W052501的理化特征如图7所示。(3)菌株W052501的分子鉴定提取菌株W052501的总DNA作为模板，采用NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'引物进行PCR扩增，得到菌株W052501的rRNA基因D1D2区序列，并对其进行测序。测序结果如图8所示。3、菌株的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W052501的分类命名为麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12702。四、菌株W052502的分离及鉴定1、菌株W052502的分离将采自堆肥的样品(2014年12月北京市平谷区)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在YPD培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W052502。2、菌株W052502的鉴定(1)菌株W052502的形态鉴定YPD固体培养基28℃培养3天，菌落乳白，无假菌丝，水浸片显微镜下观察多端出芽，细胞近圆，液体YPD培养产生输送白色沉淀。(2)菌株W052502的生理生化鉴定菌株W052502生理生化鉴定结果如表1所示。表1、菌株W052502生理生化鉴定(3)菌株W052502的分子鉴定提取菌株W052502的总DNA作为模板，采用如下引物NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'进行PCR扩增，得到菌株W052502的26SrDNA基因D1D2区序列，测序结果如序列表中序列1所示。3、菌株W052502的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W052502的分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12701。五、菌株W30117的分离及鉴定1、菌株W30117的分离将采自堆肥的样品(2015年10月北京市平谷区)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在PDA培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W30117。2、菌株W30117的鉴定(1)菌株W30117的形态鉴定在PDA培养基上，菌落初为白色，渐变为黄色，后期呈黑色，背面周围无色中央略带黄褐色。经在载玻片上培养48h，菌丝体具有分隔，显微镜观察县市：分生孢子梗生于足细胞上，直径15-20pm，长约2mm，壁厚而光滑，顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状，直径3.0-4.0μm；分生孢子头球状，直径700-800μm。(2)菌株W30117的生理生化鉴定氮源利用实验结果表明：菌株W30117能以硝酸钠、尿素、硫酸铵、豆粕、酪素为氮源生长，同等条件下，利用酪素的能力最强，菌落生长最快。此菌株的最适生长PH为6.0，最适生长温度为37℃。(3)菌株W30117的分子鉴定提取菌株W30117的总DNA作为模板，采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，得到含有菌株W052501ITS序列。引物序列如下：ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′PCR扩增得到的菌株W30117的ITS序列的序列如图9所示。3、菌株W30117的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W30117的分类命名为黑曲霉Aspergillusniger，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12625。六、菌株W060406的分离与鉴定1、菌株W060406的分离将采自堆肥的样品(2015年10月北京市平谷区)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在PDA培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W30117。2、菌株W060406的鉴定(1)菌株W060406的形态鉴定菌株W060406查氏培养4d后，菌落圆形、黄色、大小约5.2cm、质地疏松、表面干燥有凹凸，呈粉粒状；第12天菌落铺满整个平板，颜色变为黄绿色，边缘呈褐绿色。菌丝有隔膜，分生孢子梗长度1.8-2.1mm，直径12.1-14.83μm，粗糙有麻点，顶囊膨大成球形泡囊，顶囊直径48.9-51.2μm，小梗双层，分生孢子串生，分生孢子球形，大小4.3-5.2μm。(2)菌株W060406的分子鉴定提取菌株W060406的总DNA作为模板，采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，得到含有菌株W060406ITS序列。引物序列如下：ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′PCR扩增得到的菌株W060406的ITS序列的序列如序列表中序列2所示。3、菌株W060406的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W060406的分类命名为米曲霉Aspergillusoryzae，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12627。七、菌株W2441的鉴定1、菌株W2441的分离将采自堆肥的样品(2015年7月北京市大兴区)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在PDA培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W2441。2、菌株W2441的鉴定(1)菌株W2441的形态鉴定菌株W2441PDA平板培养基培养初期菌丝白色，培养60天后开始产孢子，菌落呈暗黄色。显微镜观察菌丝有隔，丛枝状；分生孢子为椭圆形或梨形，直接从菌丝侧端和顶端生。(2)菌株W2441的分子鉴定提取菌株W2441的总DNA作为模板，采用通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，得到含有菌株W2441ITS片段。引物序列如下：ITS4:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS5:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’PCR扩增得到的菌株W2441的ITS序列如序列表中序列3所示。3、菌株W2441的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W2441的分类命名为嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12626。八、菌株W10208的分离及鉴定1、菌株W10208的分离将采自堆肥的样品(2015年5月北京市平谷区)10.0g，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液，用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀释度的菌悬液。在无菌条件下，以上各稀释度菌悬液各取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，20℃培养24-72h，观察有无菌落产生，挑选一株生长快，形态不一样的菌株，并将该菌株命名为菌株W10208。2、菌株W10208的鉴定(1)菌株W10208的形态及生理生化鉴定菌株W10208在牛肉膏培养机上菌落直径0.5-1.5cm，白色，黏稠，透明，边缘突起，不规则，表面有皱褶。生理生化鉴定结果如表2所示。表2、菌株W10208的生理生化鉴定结果(2)菌株W10208的分子鉴定提取菌株W10208的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株W1020816SrDNA保守区的片段。引物序列如下：27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增得到的菌株W10208的16srDNA的序列如序列表中序列4所示。3、菌株W10208的保藏根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株W10208的分类命名为嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus，该菌株于2016年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12704。实施例2、耐低温堆肥发酵剂的制备及其应用一、耐低温堆肥发酵剂的制备1、制备复合微生物菌剂按照如下重量取各微生物菌剂进行混合，即得复合微生物菌剂：酿酒酵母菌剂1.4kg，麦芽糖假丝酵母菌菌剂1.2kg，枯草芽孢杆菌菌剂1.0kg，解淀粉芽孢杆菌菌剂1.4kg，米曲霉菌剂1.5kg，黑曲霉菌剂1.3kg，嗜热脂肪芽孢杆菌菌剂1.0kg，嗜热侧孢霉菌剂1.0kg。上述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂的制备方法如下：将酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株(保藏号为CGMCCNo.12701)接种于YPD培养基中，在29℃，200rmp的条件下培养20小时，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:7的比例吸附混匀，得到酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂。其中，酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株的浓度为50亿cfu/g。上述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂的制备方法为：将麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501菌株(保藏号为CGMCCNo.12702)接种于YPD培养基中，在30℃，200rmp条件下培养22小时，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:7的比例吸附混匀，得到麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂。其中，麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501菌株的浓度为60亿cfu/g。上述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025菌株(保藏号为CGMCCNo.12705)接种牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂。其中，枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025菌株的浓度为500亿cfu/g。上述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株(保藏号为CGMCCNo.12703)接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在31℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂。其中，解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株的浓度为500亿cfu/g。上述米曲霉Aspergillusoryzae菌剂的制备方法为：将米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株(保藏号为CGMCCNo.12627)接种于PDA培养基中，在28℃，100rmp条件下培养18h，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到米曲霉Aspergillusoryzae菌剂。其中，米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株的浓度为50亿cfu/g。上述黑曲霉Aspergillusniger菌剂的制备方法为：将黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株(保藏号为CGMCCNo.12625)接种于PDA培养基中，在32℃，100rmp条件下培养20h，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到黑曲霉Aspergillusniger菌剂。其中，黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株的浓度为30亿cfu/g。上述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂的制备方法为：将嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208菌株(保藏号为CGMCCNo.12704)接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在40℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂。其中，嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208菌株的浓度为100亿cfu/g。上述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂的制备方法为：将嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株(保藏号为CGMCCNo.12626)接种于PDA培养基中，在45℃，100rmp条件下培养20h，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂。其中，嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株的浓度为20亿cfu/g。上述实施例中涉及菌种及各菌种在低温条件下生长特性如表3所示。表3、上述实施例中涉及菌种及各菌种在低温条件下生长特性2、制备耐低温堆肥发酵剂称取步骤1获得的复合微生物菌剂9.8kg，并将其与90.2kg沸石粉载体(国投盛世承德科技有限公司)混合，得到本发明的腐熟剂，即为耐低温堆肥发酵剂。二、耐低温堆肥发酵剂在发酵有机肥中的应用试验地点为北京市平谷区泰丰平有机肥厂，以鸡粪、香菇渣混合物为原料发酵有机肥进行发酵，得到发酵后有机肥。试验时间为1月4日。试验按照是否向原料发酵有机肥中添加腐熟剂进行发酵分为如下两组：1、耐低温堆肥发酵剂处理(腐熟剂处理组)：每1000kg原料发酵有机肥添加上述步骤一制备的耐低温堆肥发酵剂5kg；2、不添加腐熟剂空白处理：原料发酵有机肥中不添加腐熟剂。采用北京泰华恒越科技发展有限责任公司生产的GMS100在线式监测仪持续监测发酵过程中堆体温度变化和堆体H2S、SO2、NO2、NH3排放量。发酵堆体温度变化情况见图1，废气排放量结果见表4。表4、废气排放量硫化氢(ppm)二氧化硫(ppm)二氧化氮(ppm)氨气(ppm)腐熟剂处理50803.54495.1137.91675804空白处理42083.234625.15300.12159965减少率(％)17.1687.0297.4022.42从以上结果可以看出，使用本发明的腐熟剂处理后，相对于空白对照，发酵堆体升温速度变快，且硫化氢、二氧化硫、二氧化氮、氨气4种废气的排放量均减少，其中硫化氢减排率达17.16％，二氧化硫减排率达87.02％，二氧化氮减排率达97.4％，氨气减排率达22.42％。实施例3、耐低温堆肥发酵剂的制备及其应用一、耐低温堆肥发酵剂的制备1、制备复合微生物菌剂按照如下重量取各微生物菌剂进行混合，即得复合微生物菌剂：酿酒酵母菌剂1.2kg，麦芽糖假丝酵母菌菌剂1.3kg，枯草芽孢杆菌菌剂0.8kg，解淀粉芽孢杆菌菌剂1.4kg，米曲霉菌剂1.5kg，黑曲霉菌剂1.3kg，嗜热脂肪芽孢杆菌菌剂0.8kg，嗜热侧孢霉菌剂0.8kg。各菌菌剂在混合前各自的有效活菌数分别为：酿酒酵母50亿cfu/g，麦芽糖假丝酵母50亿cfu/g，枯草芽孢杆菌300亿cfu/g、解淀粉芽孢杆菌500亿cfu/g、米曲霉20亿cfu/g、黑曲霉20亿cfu/g、嗜热脂肪芽孢杆菌200亿cfu/g，嗜热侧孢霉20亿cfu/g。上述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂的制备方法如下：将酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株(保藏号为CGMCCNo.12701)接种于YPD培养基中，在29℃，200rmp的条件下培养20小时，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:7的比例吸附混匀，得到酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌剂。其中，酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株的浓度为50亿cfu/g。上述麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂的制备方法为：将麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501菌株(保藏号为CGMCCNo.12702)接种于YPD培养基中，在30℃，200rmp条件下培养22小时，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:7的比例吸附混匀，得到麦芽糖假丝酵母Candidamaltosa菌剂。其中，麦芽糖假丝酵母CandidamaltosaW052501菌株的浓度为60亿cfu/g。上述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025菌株(保藏号为CGMCCNo.12705)接种牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌剂。其中，枯草芽孢杆菌BacillussubtilisW11025菌株的浓度为500亿cfu/g。上述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株(保藏号为CGMCCNo.12703)接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在31℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂。其中，解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株的浓度为500亿cfu/g。上述米曲霉Aspergillusoryzae菌剂的制备方法为：将米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株(保藏号为CGMCCNo.12627)接种于PDA培养基中，在28℃，100rmp条件下培养18h，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到米曲霉Aspergillusoryzae菌剂。其中，米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株的浓度为50亿cfu/g。上述黑曲霉Aspergillusniger菌剂的制备方法为：将黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株(保藏号为CGMCCNo.12625)接种于PDA培养基中，在32℃，100rmp条件下培养20h，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到黑曲霉Aspergillusniger菌剂。其中，黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株的浓度为30亿cfu/g。上述嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂的制备方法为：将嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208菌株(保藏号为CGMCCNo.12704)接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在40℃，230rmp条件下培养至芽孢形成率达85％，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus菌剂。其中，嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusW10208菌株的浓度为100亿cfu/g。上述嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂的制备方法为：将嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株(保藏号为CGMCCNo.12626)接种于PDA培养基中，在45℃，100rmp条件下培养20h，然后3000r/min离心浓缩20min后，与沸石粉按照质量比为1:5的比例吸附混匀，得到嗜热侧孢霉Sporotrichumthermophile菌剂。其中，嗜热侧孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株的浓度为20亿cfu/g。2、制备耐低温堆肥发酵剂称取步骤1获得的复合微生物菌剂9.1kg，并将其与90.9kg沸石粉(国投盛世承德科技有限公司)载体混合，得到本发明的腐熟剂，即为耐低温堆肥发酵剂。二、耐低温堆肥发酵剂在发酵有机肥中的应用试验地点为北京市平谷区泰丰平有机肥厂，以鸡粪、金针菇渣混合物为原料发酵有机肥进行发酵，得到发酵后有机肥。试验时间为3月7日。试验按照是否向原料发酵有机肥中添加腐熟剂进行发酵分为如下两组：1、耐低温堆肥发酵剂处理(腐熟剂处理组)：每1000kg原料发酵有机肥添加上述步骤一制备的耐低温堆肥发酵剂5kg；2、不添加腐熟剂空白处理：原料发酵有机肥中不添加腐熟剂。采用北京泰华恒越科技发展有限责任公司生产的GMS100在线式监测仪持续监测发酵过程中堆体温度变化和堆体H2S、SO2、NO2、NH3排放量。发酵堆体温度变化情况见图2，废气排放量结果见表5。表5、废气排放量硫化氢(ppm)二氧化硫(ppm)二氧化氮(ppm)氨气(ppm)腐熟剂处理11453.12476.910.84926261空白处理34448.421734.52465.33220152减少率(％)66.7588.6099.5671.23从以上结果可以看出，使用本发明的腐熟剂处理后，相对于空白对照，发酵堆体升温速度变快，且硫化氢、二氧化硫、二氧化氮、氨气4种废气的排放量均减少，其中硫化氢减排率达66.75％，二氧化硫减排率达88.60％，二氧化氮减排率达99.56％，氨气减排率达71.23％。从以上实验结果可以看出，使用本发明的腐熟剂，相对于空白对照，能够加快腐熟过程升温速度，提前12小时升温至50℃(在平均气温20℃的气候条件下)，且腐熟过程高温期温度较高，腐熟降温期出现快。另外，使用本发明的发酵剂处理后，相对于空白对照，堆肥过程向环境排放的氨气减少达22.42-71.23％，硫化氢减少17.16-66.75％，能够大幅降低环境中氨气和硫化氢等气体的浓度，进一步减少堆肥过程臭味排放。实施例4、耐低温堆肥发酵剂的效果验证实验(施用生菜)为验证本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥是否在田间有效果，将实施例2获得的发酵后有机肥施用于生菜上进行田间试验，并检测田间效果。具体步骤如下：一、试验方法1、试验时间和地点试验安排在北京房山芦村进行，试验时间是2015年3月到2015年7月。2、供试土壤基本性状供试土壤基本理化性状测定结果见表6。表6、试验点土壤养分基本情况3、供试作物供试作物为生菜。4、试验处理及大田设置本试验设置如下三个处理，重复三次，各处理小区随机排列，小区面积20m2以上。处理一：实施例2中步骤二制备的发酵后有机肥处理，底施发酵后有机肥200kg/667m2，追施尿素10kg/667m2。处理二：空白对照(CK)，基肥和追肥均不施。处理三：常规施肥，底施复合肥(购于北京农业生产资料有限公司，总养分含量≥25％)200kg/667m2，追施尿素10kg/667m2。5、田间管理(1)定植与采收试验作物为结球生菜，品种为皇帝。3月12日开始育苗，4月26日施用基肥，中耕后，开沟起垄，4月27日定植，定植密度为6100株/667m2。处理一和处理三分别为5月20日和6月2日追施尿素两次，每次用量5kg/667m2，采用沟施，覆土后浇水。(2)浇水和中耕在生菜缓苗期，生长期，结球初期土壤干旱时及时浇水，浇水后进行除草、中耕作业。(3)采收和测产7月5日成熟收获，记载每个小区实际产量。(4)田间调查6、生物学性状调查每个小区选择大小和长势相似的有代表性的15株生菜调查生物学性状。7、产量调查果实成熟后，按小区分别采收称重，并记载产量。二、结果与分析1、不同处理对生菜生物学性状的影响在连座期，各小区分别选取有代表性的5株，洗净后调查其株高、根长、根鲜重和干重。将生菜的根置于烘箱内105℃杀青15分钟，80℃恒温48小时后，称其重量即为根干重。结果如表7所示。从表7可看出，试验处理一与其它处理相比：株高增加0.4-3.4cm，根长增加0.3-1.8cm，根鲜重增加0.5-3.2g，根干重增加0.2-0.8g。表7、生菜施肥试验各处理生物学性状处理号株高cm根长cm根鲜重g根干重g处理一24.111.318.32.6处理二20.79.515.11.8处理三23.711.017.82.42、不同施肥处理对生菜产量的影响生菜采收期各小区分别计产，折合667m2产量，结果见表8。从表8可看出，试验处理一与其它处理相比，产量明显增加。表8、不同处理产量结果对上述产量结果方差分析，结果见表9。方差分析结果表明：试验点处理间差异极显著，重复间差异不显著。进一步对表7的产量结果进行多重比较，结果见表10。由表10可以看出，实验处理一与处理三相比增产不显著，但平均产量较处理三增产38.466kg/667m2；处理一较处理二差异达极显著。表9、产量结果的方差分析变异来源自由度平方和均方F值F0.05F0.01区组间23080.441540.220.26X6.9418.0处理间2635032.0317516.053.0﹡﹡6.9418.0误差423963.565990.89总计8662076.0注:﹡﹡差异极显著,﹡差异显著,x差异不显著表10、不同处理产量多重比较结果注：字母相同表示差异不显著，字母不同表示差异显著。上述结果表明：利用本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥能够促进生菜生长，有机肥处理后的生菜在株高、根长、根鲜重、根干重均高于常规施肥和空白对照处理，产量较空白处理差异达极显著水平，较常规施肥亩增产38.466kg。证明利用本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥具有一定的肥效。实施例5、耐低温堆肥发酵剂的效果验证实验(施用桃树)为验证本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥是否在田间有效果，将实施例3获得的发酵后有机肥施用于桃树上进行田间试验，并检测田间效果。具体步骤如下：一、试验方法1、试验时间和地点试验安排在平谷区大华山镇后北宫村和镇罗营进行，试验时间是2014年9月到2015年10月。2、供试土壤基本性状供试土壤基本理化性状测定结果见表11。表11、试验点土壤养分基本情况3、供试作物供试作物为桃树，品种名称为艳红。4、试验处理及大田设置本试验设置如下三个处理，重复三次，各处理小区随机排列。小区面积111m2，行株距4*2.5m，种植密度40株/667m2，树龄为3年。处理一：实施例3中步骤二制备的发酵后有机肥处理，底施发酵后有机肥330kg/667m2，追施复混肥50kg/667m2。处理二：空白对照(CK)，基肥和追肥均不施。处理三：常规施肥，底施复合肥(购于北京农业生产资料有限公司，总养分含量≥25％)100kg/667m2,追施尿素50kg/667m2。5、田间管理(1)施肥时间基肥于2014年9月底施用，追肥于2015年3月底施用，除施肥不同外，其它管理措施一致。(2)施肥方法在树冠外围开宽25cm，深15cm的环形沟，将底肥或追肥均匀施入沟内，再覆土盖于上面。(3)浇水与中耕生长季节适时浇水，浇水后及时进行中耕作业。(4)其它管理采用人工授粉和蜜蜂授粉结合的方法提高坐果率；开花时疏花，套袋前定果，一般每个花序留1个果，每隔0.15米留2个果，留优质果，6月中旬套袋。采收前25天脱袋。脱袋后进行摘叶、转果等提高品质。6、田间调查(1)生物学性状调查每个小区选择树体大小和长势相似的5株进行生物学性状和果实品质调查。(2)产量调查9月中旬果实成熟后，开始采收。按单株采收，每个处理采收5株，称重，并按小区分别记载产量。二、试验结果与分析1、不同施肥处理对桃树生物学性状的影响在桃树生长期对生物学性状及果实品质进行调查记载，结果见表12。从表12可以看出，两个试验点三个处理的盛花期、幼果期和成熟期一致。处理一和处理三的叶片颜色较其它处理深。处理一比其它处理单果重、含糖量有所提高，畸形果率有所下降，其中后北宫村试验点，处理一较处理二(空白对照)单果重增加13.1g，含糖量增加1.5％，畸形果率降低3.6％。镇罗营村处理一较处理二(空白对照)单果重增加18.1g，含糖量增加0.9％，畸形果率降低4.2％。从以上的比较可以看出，施用有机肥能明显改善桃树植株生物学性状，有利于桃树高产、稳产。表12、桃树施肥试验各处理生物学性状及品质调查2、不同施肥处理对桃树产量的影响桃树采收期各小区分别计产，折合成667m2产量，结果见表13。从表13中可以看出，各个试验地点的各处理组一产量平均值均高于处理组二和处理组三的产量平均值。对上述产量结果进行方差分析，结果见表14。方差分析结果表明：两试验点处理间差异显著，重复间差异不显著。进一步对表12的产量结果进行多重比较，结果见表15。由表15可以看出，后北宫村试验点，处理一与处理二、处理三相比，产量均有不同程度增加，分别增加1357.3kg/667m2、324.1kg/667m2，增产率分别为16.0％、3.4％，而且处理一与处理二产量达到极显著差异；镇罗营试验点，处理一与处理二、处理三相比均由不同程度增产，产量分别1707.0kg/667m2、299.5kg/667m2，增产率分别为20.6％、3.1％，其中处理一与处理二产量差异达显著水平。表13、不同处理产量结果表14、产量结果的方差分析表15、不同处理产量多重比较结果上述两个试验点结果表明，利用本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥处理桃畸形果率较常规施肥和空白对照均有所降低，而单果重和果实含糖量有所提高。其中畸形果率降低0.7-3.6％，单果重提高9.9-25.6g，果实含糖量提高0.5-1.5％，产量提高3.0％以上。结果表明：利用本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥能够降低桃树畸形果率，提高单果重，改善果实品质，提高桃产量。证明利用本发明的堆肥发酵剂发酵鸡粪和香菇渣生产的有机肥具有一定的肥效。当前第1页1 2 3