本发明涉及一种微生物制剂，特别是一种用于河道水质修复的微生物制剂及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着城市对环境资源开发利用力度的增加，大量含有氮、磷营养物质的污染物不断排入城市内的河流，使得河流富营养化现象日益严重，部分河段甚至发黑发臭，严重影响了周边居民的生活健康。
河流水质恶化，主要原因为城区污水处理厂的处理水排放。尽管通过提标改造，污水厂排水可达到国家一级A标准，但处理水进入河流后，仅依靠河流的自净能力，很难由一级A标准达到地表水Ⅳ类水标准。这里所提到的自净能力，指的是污染物随污水排入水体后，水体自身经过物理的、化学的与生物化学的作用，使污染的浓度降低或总量减少，受污染的水体部分地或完全地恢复原状的能力。一级A标准中所规定的化学需氧量浓度为50mg/L，氨氮浓度为5mg/L，总磷浓度为0.5mg/L，而地表水Ⅳ类水标准规定化学需氧量浓度为30mg/L，氨氮浓度为1.5mg/L，总磷浓度为0.3mg/L，两类标准中各指标之间的差距十分明显。并由于城市人口的过度膨胀，污水处理厂的处理水量愈来愈大，处理水中所含的污染物量远远超出了水体自净能力的范围之内。加上城区排水设施老化，雨污分流管网全覆盖可行性低，偷排、乱排现象时有发生，使得部分污水直接排入河流。此外，城区内水域面积的缩小，河道护岸的硬质化，防洪闸门修建对河流流动性的影响，均造成水体的自净能力大幅降低。本发明提供一种以河道底泥为初始菌种源，制备一种复合微生物菌剂，用于直接喷洒到河道水体中，实现水质快速改善，消除河道黑臭现象。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出一种治理黑臭河道的微生物菌液制备方法。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的。本发明是一种治理黑臭河道的微生物菌液制备方法，其特点是，包括以下步骤 ：
（1）采集河道底泥，通过高通量测序实验进行底泥微生物群落多样性分析，高通量测序流程包括对底泥DNA提取、PCR扩增和产物纯化、Miseq上机测序；
（2）初期筛选，取河道底泥5~10g，接种于无菌脱氮菌富集培养液中，置于30℃培养箱中静置培养，培养3~4d，接入新鲜的富集培养液中，扩大培养三次，获得优势菌群初步筛选，检测培养基中氨氮、硝酸盐氮含量，取氮类积累少的混合菌液作为初筛的具有脱氮作用的菌群；
（3）优化富集筛选，向新鲜的优化富集培养基接入初期筛选的优势脱氮菌液，置于30~35℃生化培养箱中培养，如此反复富集培养，直到获得优势混合脱氮菌液，
（4） 在混合菌液中加入微量元素溶液，所述微量元素溶液包括ZnSO4·7H2O浓度3.93g/L、CaCl2浓度为5.5g/L、MnSO4·H2O浓度为4.32g/L、FeSO4·7H2O浓度5.0g/L、(NH4)6Mo7O2·4H2O浓度1.1g/L、CuSO4·5H2O浓度1.57g/L；CoCl2·6H2O浓度1.61g/L；
（5） 将加入微量元素的混合菌液接种于碳酸钙和柠檬酸钠为碳源的液体培养基中，碳源浓度为3g/L,设置温度为30~35℃，进行培养，得到混合菌液；
（6）混合菌液制成均匀的繁殖稀释液，并接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，使其均匀分布于平板中，进行培养。
本发明一种治理黑臭河道的微生物菌液制备方法中，进一步优选的技术方案特征是：
１、所述脱氮菌富集培养基为(NH4)2SO4(132)1g，KNO3(101)2g，柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O，294.07）6g(C/N>5)，K2HPO4 1g，七水硫酸镁 0.2g，蒸馏水 1000ml，121℃，灭菌 20min；
2、所述微量元素溶液的pH值为8。
与现有技术相比，本发明通过提取河底泥中硝化菌、反硝化细菌在培养基中培养，完成不同生长周期的协同作用，有利于维持菌群的生长稳定和增强抗击外界环境波动的能力。随后，菌液从浑浊开始减小，菌体生长率小于死亡率，活细胞数显著下降，菌体衰亡并自溶。优化培养基中同时存在有机和无机碳源可以同时满足好氧反硝化、异养硝化和部分自养硝化的需求，迅速达到脱氮效果，河道底泥为初始菌种源，用于直接喷洒到河道水体中，实现水质快速改善，消除河道黑臭现象。
具体实施方式
进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成其权力的限制。
实施例1，一种治理黑臭河道的微生物菌液制备方法，其特点是，包括以下步骤 ：
（1） 采集河道底泥，通过高通量测序实验进行底泥微生物群落多样性分析，高通量测序流程包括对底泥DNA提取、PCR扩增和产物纯化、Miseq上机测序；
（2） 初期筛选，取河道底泥5~10g，接种于无菌脱氮菌富集培养液中，置于30℃培养箱中静置培养，培养3~4d，接入新鲜的富集培养液中，扩大培养三次，获得优势菌群初步筛选，检测培养基中氨氮、硝酸盐氮含量，取氮类积累少的混合菌液作为初筛的具有脱氮作用的菌群；
（3） 优化富集筛选，向新鲜的优化富集培养基接入初期筛选的优势脱氮菌液，置于30~35℃生化培养箱中培养，如此反复富集培养，直到获得优势混合脱氮菌液，
（4） 在混合菌液中加入微量元素溶液，所述微量元素溶液包括ZnSO4·7H2O浓度3.93g/L、CaCl2浓度为5.5g/L、MnSO4·H2O浓度为4.32g/L、FeSO4·7H2O浓度5.0g/L、(NH4)6Mo7O2·4H2O浓度1.1g/L、CuSO4·5H2O浓度1.57g/L；CoCl2·6H2O浓度1.61g/L；
（5） 将加入微量元素的混合菌液接种于碳酸钙和柠檬酸钠为碳源的液体培养基中，碳源浓度为3g/L,设置温度为30~35℃，进行培养，得到混合菌液；
（6） 混合菌液制成均匀的繁殖稀释液，并接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，使其均匀分布于平板中，进行培养。
实施例2，实施例1所述的一种治理黑臭河道的微生物菌液制备方法，所述脱氮菌富集培养基为(NH4)2SO4(132)1g，KNO3(101)2g，柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O，294.07）6g(C/N>5)，K2HPO4 1g，七水硫酸镁 0.2g，蒸馏水 1000ml，121℃，灭菌 20min。
实施例3，实施例1所述的一种用于河道水质修复的微生物制剂，所述微量元素溶液的pH值为8。
实施例4选用平板计数法，利用营养琼脂培养基进行分离。将待测菌液经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表一个单细胞。统计菌数，根据稀释倍数和取样换算出混合菌液中的含菌数。
改变基础培养基中碳源、温度、pH、硝氮等条件，培养5d~7d，检测培养基中氨氮、总氮含量考察菌群效果。
在初期混合脱氮菌筛选中，分别选取1%、3%、4%、5%的接种污泥量。初期富集培养两个周期，考察接种不同量的污泥对混合菌液脱氮效果的影响。
在有机碳ρ(C)为1.5g/L、无机碳ρ(C)为0.5g/L的条件下，考察不同碳源种类对细菌生长和总氮去除率的影响。将混合菌液分别接种于以碳酸钙、碳酸氢钠、乙酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠+柠檬酸钠、碳酸钙+乙酸钠、碳酸氢钠+乙酸钠、碳酸钙+柠檬酸钠(8)作为碳源的培养基中，培养3~5天，取样测定氮类指标。混合碳源的条件下总氮的去除率明显高于投加单一碳源，单一投加有机碳源总氮去除率高于单一投加无机碳源。无机碳源的条件下残留的硝态氮较多，降低了总氮去除率；有机碳源的总氮去除率较高，说明混合菌液中存在一定的异养反硝化菌。硝化菌群以CO32-或CO2为碳源，而反硝化菌以有机碳为碳源。混合碳源的条件下脱氮效果较好，说明以单一的无机碳源或有机碳源均不能满足混合微生物协同生长和降解氨氮、硝态氮的需要。以总氮去除率>50%为标准，在ρ(C)为1.5g/L的条件下，进一步考察添加组合碳源对脱氮效果的影响。将混合菌液分别接种于以碳酸氢钠+柠檬酸钠(1)、碳酸钙+乙酸钠、碳酸氢钠+乙酸钠、碳酸钙+柠檬酸钠、柠檬酸钠为碳源的液体培养基中，在30℃恒温培养箱中培养3~5天，取样测定氮类指标。综合考虑总氮及氨氮的去除效果，选择碳酸钙+柠檬酸钠作为组合碳源添加。
实施例5微量元素溶液：ZnSO4·7H2O浓度3.93g/L;CaCl2浓度为5.5g/L；MnSO4·H2O浓度为4.32g/L；FeSO4·7H2O浓度5.0g/L；(NH4)6Mo7O2·4H2O浓度1.1g/L；CuSO4·5H2O浓度1.57g/L；CoCl2·6H2O浓度1.61g/L。
将混合菌液分别接种于以碳酸钙+柠檬酸钠为碳源，pH为7.5的液体培养基中，加入不同量的微量元素，体积比设置为0、0.2、0.4、0.8ml/L，在35℃生化培养箱下培养5天后取样测定含氮量，微量元素对混合菌体的脱氮效率影响非常大，加入微量后菌体的降解效率明显提高。微量元素配方中含有多种金属离子，如Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+，对于菌体的生物脱氮有着明显的促进作用。随着微量元素投加量的增大，脱氮率有所下降，说明过多的金属离子对菌体的反硝化性能可能会产生一定的抑制作用，但在0.2~0.8ml/L之间，都在78%以上。最优条件选择加入0.4ml/L的微量元素。
将混合细菌分别接种于碳酸钙+柠檬酸钠为碳源的液体培养基中，碳源浓度为3g/L,微量元素为0.4ml/L,设置初始pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，放在35℃生化培养箱培养中培养4天后取样测定含氮量， pH对生物脱氮影响较为明显。pH从6增加到9时，脱氮率呈上升趋势；当pH在7~9时，反硝化效果无显著差异，混合菌液中菌体适宜在偏碱性环境下生存，pH过低或过高，可能会使酶的活性下降，从而抑制其生长。在酸性条件下，硝酸根与氢离子结合生成硝酸进入细胞膜阻碍了反硝化所需的能量合成,这使得好氧反硝化下硝酸盐还原酶的活性受到影响，无法进行反硝化；同时也影响了厌氧反硝化下亚硝酸还原酶的活性，产生一定量的亚硝酸盐积累。后续实验以pH为8为最优条件。
将混合细菌分别接种于碳酸钙+柠檬酸钠为碳源的液体培养基中，碳源浓度为3g/L,微量元素为0.4ml/L，pH为8的液体培养基中，设置温度分别为20、25、30、35、40℃，培养4天后取样测定含氮量，研究表明，硝化菌生长温度为25℃~30℃，低于15℃时，硝化反应速率开始明显降低，其活性低于5℃时几乎会丧失。在适宜的温度范围内，温度每提高10℃，酶促反应速率将提高1~2倍。温度对反硝化作用有显著的影响，25~35℃之间，温度越高反硝化速率越高。温度为30~35℃范围内，混合细菌的脱氮速率增至最大。当温度低于30℃时，菌群的生长缓慢，因温度支配着酶反应力学、微生物生长速度以及化合物的溶解度等，可能是由于温度过低，影响了酶的活性，影响菌群(硝化)的生长和硝化作用。当温度高于40℃时，高温使得亚硝酸盐还原酶失去活性，硝酸盐还原酶并无受到高原影响，硝酸氮的还原速率明显高于亚硝酸氮，使得硝酸盐全部还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐无法进一步还原所以造成累积过多，从而导致总氮的去除率下降。混合细菌在30~35℃时对氮类的去除率较高，且趋于稳定，故选择30℃作为最优的生化培养温度。