本发明涉及一种绿色木霉菌及其规模化制备方法，属于木霉菌的制备
技术领域：
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背景技术：
：植物土传病害是一类极其常见的植物病害，包括根腐病、立枯病、猝倒病、枯萎病等，病原物通常侵染植物根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大经济损失。对于植物土传病害的防治，常规方法包括化学防治和生物防治。其中，化学防治对大多数病害虫防效甚微，且化学农药会造成大量农药残留，造成环境污染，危害人类健康；同时，长期使用化学农药是的病原菌对农药产生抗性，进而导致化学防效不断下降甚至失效。生物防治由于克服了化学防治的上述弊端，且对大多土传病害经济有效，因而越来越受到人们的青睐和重视。木霉(Trichoderma)属于半知菌类、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌。绿色木霉(Trichodermaviride)在木霉属中是一种较为理想的抗土传病的半知菌，不仅效果快，且抗菌的光谱性强，还具有一定的促进作物生长的作用。绿色木霉尤其对防治土壤中国的立枯病和赤霉病具有快速而显著的作用。此外，绿色木霉还可以对作物的营养利用、环境温度及光照等适应方面发挥促进作用。因此，绿色木霉成为目前较为具有研究价值和应用前景的生物防治剂。目前，绿色木霉菌剂的生产工艺主要为固态发酵，普遍存在生产周期长、产孢量低、成本高等问题，阻碍了绿色木霉的规模化生产进程。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种绿色木霉菌，其抗菌光谱性强，还具有一定的促进作物生长的作用；同时本发明提供了一种简单易行的规模化制备方法，效率高，成本低。本发明所述的绿色木霉菌，该菌株为木霉(Trichoderma)属中的绿色木霉菌株HS-F9，该绿色木霉菌株已于2016年1月18日，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为绿色木霉菌(Trichodermaviride)，保藏编号为CGMCCNo.12079。绿色木霉菌株是从山东省淄博市沂源县大张庄镇落叶覆盖的枯树根部土壤中采用羧甲基纤维素钠培养基和纤维素刚果红鉴别培养基涂布分离所得的高产孢菌株。用所述的绿色木霉菌制得生物防治品，生物防治品用于防治番茄根结线虫病或温室黄瓜及番茄灰霉病等病害。所述的绿色木霉菌的规模化制备方法，采用液固双相发酵工艺，经液体培养基种子发酵及固体培养基分盘发酵，固态发酵过程采用中央空调、温控系统和高压微雾加湿器进行控温控湿，发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。所述液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：葡萄糖0.01％-3％，酵母粉0.01％-3％，蛋白胨0.01％-2％，磷酸氢二钾0.01％-2％，硫酸镁0.01％-2％，硫酸亚铁0.01％-2％，氯化锌0.01％-1％。所述固体培养基由以下重量百分含量的原料制成：主料50％-90％，辅料10％-45％，无机盐0.05％-5％；固体培养基的含水量为30％-70％；主料中，面粉与麸皮的质量比为1:1；辅料中，玉米粉、豆粕、花生壳的质量比为2:1:1；无机盐类由以下质量体积百分含量的溶液制成：磷酸二氢钾0.01％-2％、柠檬酸0.01％-2％、硫酸亚铁0.01％-1％、硫酸镁0.01％-1％；制备固体培养基时，先将无机盐溶解在水中，再与主料和辅料搅拌混合。所述的液固双相发酵工艺，是先将绿色木霉菌株接种到液体培养基中进行种子培养，再采用自动化接种工艺将液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，自动化接种工艺中的接种量为1％-15％。所述分盘发酵是指当绿色木霉进入快速生长期、温度超过35℃时，将半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵。所述固态发酵过程中，温度控制在20-35℃，湿度控制在80％-99％。所述低温烘干时，温度控制在25-50℃。所述生产过程中所有与灭过菌的物料直接或间接接触的设备均是采用纯不锈钢材料或其他不生锈、耐腐蚀、抗老化、易清洗的材料制成。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)固体培养基所用的麸皮、玉米粉、豆粕、花生壳来源广泛、价格低廉，大大降低了生产成本；(2)所有与灭过菌的物料直接或间接接触的设备都是采用纯不锈钢制作，便于清洗消毒，且耐腐蚀、抗老化，解决了清洗和灭菌的死角问题，经过多次实践检验，实现设备检测零杂菌的突破；(3)采用蒸球蒸料、接种机自动化接种工艺，在不增加耗能的情况下，劳动效率提高了5倍，每天运行的班次由传统的1个增加至2个，产量翻了10翻，生产效率大幅度提高；(4)采用液体接种，均匀度大为改观，不再出现局部生长过快或者过慢现象，且增加了物料的湿度，又避免了物料发粘状况；此外，液体接种后可直接分盘发酵，省去堆积培养环节，节省劳动力，增加生产稳定性；(5)采用分盘发酵的方式，将快速生长期的半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵，增加了物料的表面积，排除二氧化碳等废气，使曲料重新充分与氧气接触，又便于喷水降温、加湿，更好的控制绿色木霉的产酶发孢条件，因为当绿色木霉到达菌丝生长对数期，耗氧量达到峰值，同时产生大量的热与二氧化碳等废气，通风量的增加带走了曲料的部分水分，温度的急剧升高(35℃以上)、废气的大量产生、水分的丢失严重恶化了绿色木霉的生长繁殖条件，导致传统发酵产品的各种酶活力低；(6)生产过程中，采用中央空调、温控系统、高压微雾加湿器进行严格控温控湿，中央空调的三级空气过滤装置，使进风完全无菌，其中散热器、表冷器的使用，可实现冷暖风的自由输送，实现了温度的自动精准控制；高压微雾加湿器具有耗电少、成本低、雾化效果佳的优点，其产生的水粒子直径仅为1-5μm，在空气中水粒子分布均匀，不产生凝水，运行稳定性好、加湿效率高(最高达到99％)等特点，能精准控湿且易于自动化管理；因此，中央空调、温控系统及高压微雾加湿器的应用解决了传统工艺梅雨季节湿度大、温度高、物料发粘、烧曲坏曲，寒冬季节干燥(北方)、温控效果差、易干曲等难题，实现了固体发酵过程条件的精准控制；(7)建立了一条全新的低温烘干工艺，提高了烘干效率及孢子活性，烘干车间室内地面安装蒸汽盘管来提高室温；车间密封，阻隔外界潮气进入；进风经过三级空气过滤后，再经过除湿器除湿后方能进入烘干车间，完全阻隔外界杂质杂菌以及潮气进入；室内每100m3设750w风扇一台，增加了室内空气流动性；排风扇两台，及时将湿气、旧风排出；采用新的烘干工艺后，烘干时间由以前的48-72小时，缩短到现在的24-36小时，在提高了烘干效率的同时，也保证了产品质量，成品水分由以前的10％-12％降为6％-8％，同时也避免了出现阴雨天气久烘不干的坏曲现象；(8)采用本发明所述的规模化制备方法生产绿色木霉菌，产孢量高达7.7×1011个/g(干重)，且制备的产品活性高、保存周期长，室温贮藏11个月后孢子萌发率仍能达到90％左右。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不限制本发明的实施。实施例1绿色木霉菌株的分离与筛选：1.培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基、纤维素刚果红鉴别培养基和土豆葡萄糖(PDB)培养基。2.土壤采样：采集被落叶覆盖的枯树根部土壤样品。3.分离：将1g土壤样品加入装有100mL无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中充分摇振，静置后取上清用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，每个稀释浓度吸取100μL均匀涂布到羧甲基纤维素钠培养基平板上，28℃静置培养4-5d，将四周有明显透明水解圈的单菌落转移到新的培养基中继续培养，直至大量产孢。4.初筛：用无菌生理盐水将平皿中的孢子洗脱下来并进行10倍梯度稀释，每个稀释浓度吸取100μL均匀涂布到羧甲基纤维素钠培养基平板上，28℃静置培养4-5d，将四周有明显透明水解圈的单菌落转移到新的培养基中继续培养，直至大量产孢。5.重复步骤4(初筛)6次。6.复筛：挑选透明水解圈最大的10个菌株接种到PDB培养基中进行500mL摇瓶发酵，每个菌株做5个重复摇瓶，以纤维素酶酶活为指标，最终选择酶活最高的1株菌株进行后续研究。实施例2绿色木霉的分子生物学菌种鉴定：1.DNA提取：用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA。2.18S序列扩增：用真菌18S序列通用引物对筛选菌株进行18S序列扩增。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5.0μL，dNTPs(2.5mM)4.0μL，引物ITS1和ITS4各2.0μL，ExTaq酶(5U/μL)2.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O34μL；PCR运行程序：94℃预变性5min，95℃变性60s、55℃退火60s、72℃延伸90s，34个循环，最后72℃终延伸10min。3.PCR产物纯化：将PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切下电泳胶上大小为1500bp左右的主要PCR产物，并使用捷瑞生物工程(上海)有限公司PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物纯化。4.测序：将纯化后的PCR产物送样至上海生工进行测序，所得分离菌株的ITS序列为：5’-CACGTCATGTCTAGTATAAGCATTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAATACTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCTCTGGTGAATCATAATAACTAGTCGAATCGACAGGCCTTGTGCCGGCGATGGCTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTGGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATCGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGCGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTCAAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGATGTTACATTTTTGACGCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCCGGCTTCTTAGAGGGACTA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