本发明属于细胞工程与病毒培养
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种能大幅提高PCV2(猪圆环病毒2型)培养毒价的链球菌培养物制剂及其制备方法与使用该制剂提高PCV2培养毒价的方法。
背景技术：
：目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种——亚单位苗和全病毒疫苗，亚单位苗虽安全性较好，但生产成本高昂，免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈：圆环病毒体外培养的细胞感染能力不高，感染速度慢，病毒在不同细胞个体中的复制速度差异极大，病毒培养效价很难上升到理想状态。为解决该难题，所有生产者都在其培养工艺中增加一个用D-氨基葡萄糖处理，使细胞停留于分裂Ⅱ期，保证病毒扩增的程序。但该程序不仅增加了原材料投入，而且增加了生产环节、人力投入和废弃物排放量等，使生产成本至少增加1倍以上，即便如此，国内许多厂家生产的圆环病毒疫苗，其病毒效价在104以下，免疫效果较差。欧美国家采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系培养圆环病毒以及进行病毒浓缩，其病毒含量均在106以上，免疫效果较好，但其生产成本高昂，因此其销售价格往往是国产疫苗的3-5倍。因此如何提高圆环病毒的培养毒价而又降低生产成本是国内厂家目前提高圆环病毒疫苗竞争能力的主攻方向。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种能大幅提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂及其制备方法与使用该制剂提高PCV2培养毒价的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种能大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂，由链球菌与贴壁细胞在维持培养基中共培养后收获的含链球菌的上清液经高温灭活制得。其中，所述的链球菌优选为无乳链球菌；所述的细胞优选为PK-15细胞；所述的维持培养基优选为含血清含量≤2％的培养基；所述的贴壁细胞脱落到维持培养基的含量优选为500～1000个/mL；所述的含链球菌的上清液中链球菌的含量优选为1亿～9亿个/mL。所述的链球菌培养物制剂能够使PCV2在不用D-氨基葡萄糖处理的情况下，培养的毒价达到10-7以上。所述的能大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂的制备方法，包括如下步骤：将培养贴壁细胞的培养基更换为维持培养基后接种链球菌继续培养，当链球菌密度达到1亿～9亿个/mL时收获上清液，上清液通过高温灭活。此灭活后的上清液即为能制剂刺激PCV2培养体系产毒、大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂。优选的，所述的能大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂的制备方法包括如下步骤：(1)贴壁细胞制备：按照贴壁细胞培养方法将PK-15细胞解冻后，培养于克氏瓶中，传代培养至所需数量，备用。(2)链球菌接种：上述贴壁细胞最后一次传代培养至48小时后更换培养基为含血清2％以下的维持培养基，同时用接种环接种链球菌，继续于37℃、5％CO2培养箱中培养。(3)含链球菌的培养液收获：当链球菌密度达到1亿～9亿个/mL时，停止培养，收获上清液。(4)灭活处理：将步骤(3)中收获的上清液经高温高压处理使上清液中的链球菌被彻底灭活。所述的高温高压处理的条件优选为：120℃、0.15Pa处理30分钟。利用上述链球菌培养物制剂提高PCV2培养毒价的方法，包括如下步骤：将链球菌培养物制剂按照0.1～1％(体积百分比)的浓度加到维持培养基中，配成刺激PCV2产毒的专用培养基，以该专用培养基作为PCV2培养用维持培养基培养PCV2。优选的，所述的利用上述链球菌培养物制剂提高PCV2培养毒价的方法，包括如下步骤：(1)宿主细胞制备：将PK-15细胞解冻，培养于克氏瓶中，传代至所需数量。(2)病毒接种：将PCV2接种于上述PK-15细胞，继续培养24小时。(3)刺激PCV2产毒的专用培养基配制：将上述链球菌培养物制剂按照0.1～1％的浓度加入到维持培养基中，配成刺激PCV2产毒的专用培养基。(4)刺激PCV2产毒的专用培养基使用：将上述步骤(2)中接种了PCV2并继续培养了24小时的PK-15细胞的培养液更换为上述步骤(3)中所述的刺激PCV2产毒的专用培养基，继续培养72～96小时。本发明创造了一种能够显著提高PCV2培养毒价的新制剂，与目前普遍采用的用D-氨基葡萄糖处理接种过PCV2的PK-15细胞以提高PCV2培养毒价的方法相比较，用本发明所制备的制剂提高PCV2培养毒价，不仅大幅度提高了增殖病毒的效果，而且操作更为简单，成本更低。与现有技术相比较，本发明具有如下优点：(1)病毒毒价的大幅度提高，将使产品质量大幅度提升，这对提高我国产品与国外同类产品的竞争能力将起到极大的保证作用。现行技术用D-氨基葡萄糖处理感染PCV2后的PK-15细胞，使培养体系产毒能力快速提高，一般生产情况下，只能达到10-5.5～10-6.5。本发明则可以使培养体系的PCV2毒价达到10-7以上。(2)生产工艺的大幅度简化。现行技术用D-氨基葡萄糖处理感染PCV2后的PK-15细胞，使培养体系产毒能力快速提高。由于D-氨基葡萄糖对培养体系后续产毒有一定的影响，故其流程中必须加入弃去D-氨基葡萄糖、再用PBS溶液洗涤细胞几次的程序，在生产实际中，每增加一个程序，将意味着原材料、人力等成本按比例增加，每增加一个程序还意味着增加一次开启培养体系出入口，这将极大地增加污染的可能性，这也是导致目前PCV2疫苗生产成本高昂，市场价格较高的主要原因，尽管目前生产中也有直接将D-氨基葡萄糖加入维持液中培养产毒细胞，省去洗涤过程，但其对PCV2增殖效果较经典程序大幅度降低，生产的产品质量也大幅度降低。本发明所制备的能大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂，则可直接配入培养病毒的维持液，无须经历更换培养基、洗涤等程序，因此将大幅降低生产成本。具体实施方式下面结合具体的实施实例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。实施例1能大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂的制备1、材料和方法(1)种子培养物及主要试剂：PK-15细胞、无乳链球菌：购自CCTCC。PBS粉剂：市场购买、国产产品。新生牛血清、DMEM培养基：购自Hyclone公司。胰蛋白酶：购自sigma公司。(2)主要操作步骤及方法：①贴壁细胞制备：按照常规贴壁细胞培养方法将PK-15细胞解冻后，培养于克氏瓶中，传代培养至所需数量，备用。②链球菌接种：上述贴壁细胞最后一次传代并培养至48小时后更换培养基为含血清2％以下的维持培养基(含2％以下新生牛血清的DMEM培养基)，同时用接种环接种链球菌，继续于37℃、5％CO2培养箱中培养(若未特殊说明，文中所述的培养均在37℃、5％CO2培养箱中进行)。③含链球菌的培养液收获：上述接种过链球菌的细胞培养12小时后，每隔6小时计数一次培养液中链球菌的密度，期间随着与链球菌共培养时间的延长，贴壁细胞会不断脱落，收获不同培养时间段、不同密度链球菌的培养上清液，直至贴壁细胞完全脱落(脱落的贴壁细胞含量约为900～1000个/mL)。收获的不同时间的培养液用于后续实验。④灭活处理：将步骤③中收获的上清液经120℃、0.15Pa的高温高压处理30分钟，此时上清液中的链球菌被彻底灭活。此灭活后的上清液即为能制剂刺激PCV2培养体系产毒、大幅度提高PCV2培养毒价的链球菌培养物制剂。2、结果(1)共培养条件下，链球菌繁殖速度观察，结果见表1：表1培养时间(小时)1224364860728496108链球菌数(亿个/mL)000.030.51.258.258.52.252.5细胞脱落情况(％)0000102060100100(2)高温高压灭活制剂后无菌检测，结果见表2：表2批次123灭活前链球菌活菌数(个/mL)0.1×1081×10810×108灭活后链球菌活菌数(个/mL)000实施例2链球菌与贴壁细胞共培养物制剂刺激PCV2培养体系产毒效果观察1、材料和方法(1)种子培养物及主要试剂PK-15细胞、PCV2种毒：均购自CCTCC。PBS粉剂、D-氨基葡萄糖、PCV2专用PCR检测试剂盒：市场购买、国产产品。新生牛血清、DMEM培养基：Hyclone公司产品。胰蛋白酶：sigma公司产品。(2)主要操作步骤及方法①宿主细胞制备：按照常规方法将PK-15细胞解冻，培养于克氏瓶中，传代至所需数量。②病毒接种：按照常规方法将PCV2接种于上述PK-15细胞，继续培养24小时。③刺激PCV2产毒的专用培养基配制：将用实施例1制备的链球菌培养物制剂按照0～1％的浓度(V/V)加入维持培养基中，配成刺激PCV2产毒的专用培养基。④刺激PCV2产毒的专用培养基使用：将上述步骤②中接种了PCV2并继续培养了24小时的PK-15细胞的培养液更换为上述步骤③中所述的刺激PCV2产毒的专用培养基，继续培养一定时间(12～108小时)。⑤收获病毒：将上述步骤④中的培养上清液收获，做好标记，并进行PCV2毒价测定，记录备案，以供疫苗配制或其它后续使用。⑥PCV2毒价检测：将健康PK-15细胞消化吹散后接种于96孔培养板，待细胞长满培养孔后，将待测病毒用维持培养基作10倍倍比稀释，每个稀释度按同步接种法接种6个培养孔，24小时后用3mol/L浓度的D-氨基葡萄糖溶液更换培养基，培养箱中作用2小时，取出，用PBS洗涤5次，更换为维持培养基继续培养72小时，取出培养板，放入-20℃冰箱中反复冻融三次，每孔分别吹匀后分别取样，PCV2专用PCR检测试剂盒检测每孔中PCV2阳性情况，计算待测样品PCV2毒价。2、结果(1)不同培养时间收获的不同菌体含量的链球菌培养物制剂对PCV2增殖的影响，结果见表3：表3培养时间(小时)1224364860728496108链球菌数(亿个/mL)000.030.51.258.258.52.252.5细胞脱落情况(％)0000102060100100待测样品PCV2毒价10-4.2510-4.7510-4.510-4.510-6.510-710-6.7510-6.510-6.5注：各组链球菌培养物制剂在维持培养基中的添加浓度均为0.5％；步骤④PCV2用专用培养基继续培养的时间为72小时。(2)链球菌培养物制剂使用浓度对PCV2毒价的影响，结果见表4：表4添加浓度(％)00.10.250.50.751待测样品PCV2毒价10-4.510-6.510-710-710-710-5.5注：各组链球菌培养物制剂均为培养了72小时的链球菌培养物(即链球菌数浓度为8.25亿个/mL)制备而成；步骤④PCV2用专用培养基继续培养的时间为72小时。(3)链球菌培养物制剂配制的专用培养基培养PCV2的时间对PCV2毒价的影响，结果见表5：表5培养时间(小时)1224364860728496108待测样品PCV2毒价0010-110-2.510-4.510-6.7510-710-710-5.5注：各组链球菌培养物制剂均为培养了72小时的链球菌培养物制备而成，在专用培养基中的添加浓度均为0.5％。(4)链球菌培养物制剂与D-氨基葡萄糖对提高PCV2培养毒价的对比观察，结果见表6：表6试验批次123D-氨基葡萄糖处理组10-5.510-610-5.5链球菌培养物制剂处理组10-6.7510-710-6.5注：两个处理组的区别在于上述步骤④，D-氨基葡萄糖处理组：按常规方法用D-氨基葡萄糖处理后继续培养病毒72小时；链球菌培养物制剂处理组：培养了72小时的链球菌培养物制备的制剂配成浓度0.5％的专用培养基继续培养病毒72小时。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3