一种高产双乙酰的植物乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物学领域，涉及一种植物乳杆菌，具体来说是一种高产双乙酰的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)及其应用。

背景技术：

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称，目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至少有23个属。在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等。乳酸菌是益生菌最主要的来源，许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌，已具有改善人体肠道菌群，调节机体免疫力，抑肿瘤，降低血清胆固醇，调节血压等重要的生理活性。

风味是发酵乳品质形成的重要因素之一，也是影响消费者对发酵乳认可度的关键指标。双乙酰(Diacetyl)是奶油、酸奶、乳酪及很多需要奶油味的非乳产品中的一种风味物质[参考文献(杨丽杰，王俊沪.乳酸乳球菌中双乙酰代谢支路的调控[J].中国乳品工业，2004，32(5)：24-29.)]，稀释至1mg/L时具有奶油香味[参考文献(于田利，焦维娜，禇庆环.乳酸乳球菌乳酸亚种产丁二酮的优化研究[J].食品科技，2011，36(2)：238-242.)/(王红叶，李丽华，陆淳.乙醛、丁二酮对发酵乳风味的影响[J].中国乳品工业，2010，38(10)：32-34.)]。在发酵乳制品的滋味与香味中，双乙酰被认为是起作用的重要化合物之一，即使存在微量的双乙酰，也会很大程度上改善酸奶的风味。目前欧美已出现生产主要风味物质为双乙酰的酮香型酸奶，我国也有研究主要香味物质为双乙酰的酮香型酸奶，用来改善传统酸奶的醛香型风味。因此提高乳酸菌产双乙酰的能力，可以从源头改善酸乳的风味，提高发酵乳香气品质，为乳品工业的生产提供一定的指导意义。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种高产双乙酰的植物乳杆菌及其应用，所述的这种高产双乙酰的植物乳杆菌及其应用要解决现有技术中的乳酸菌产双乙酰的能力不足的技术问题。

本发明提供了一种高产双乙酰的植物乳杆菌，其保藏编号为CCTCC M 2016513

本发明还提供了一种工作发酵剂，将上述植物乳杆菌菌种接种于灭菌乳中，培养至凝乳，连续培养活化两代作为母发酵剂；将母发酵剂按体积百分比3-5％接种于添加乳清蛋白的灭菌乳中培养至凝乳，即得工作发酵剂。

进一步的，在培养至凝乳的过程中，在35-37℃条件下培养10-12h。

本发明还提供了一种工作发酵剂，将上述的植物乳杆菌菌种接种于液体培养基中，连续活化两代，然后将活化培养物按体积百分比3-5％接种于液体培养基中培养，固液分离得到细胞沉淀，将沉淀用无菌乳悬浮，即得工作发酵剂，其中，在所述的发酵剂中，活菌数为10⁹cfu/mL以上。

进一步的，在液体培养基中活化的过程中，在35-37℃条件下培养10-12h。

本发明还提供了上述的一种高产双乙酰的植物乳杆菌在发酵食品中的用途。

进一步的，所述的发酵食品为乳酸菌奶饮料或者发酵乳。

本发明还提供了上述的一种乳酸菌饮料的制备方法，将原料乳灭菌后冷却，然后加入上述的工作发酵剂混合均匀，使上述的植物乳杆菌浓度达到10⁶cfu/mL以上，即得到含上述的植物乳杆菌的乳酸菌奶饮料。

本发明还提供了上述的一种发酵乳的制备方法，将原料乳灭菌后冷却，再加入上述的工作发酵剂和常规商品发酵剂，所述的工作发酵剂占发酵乳的体积为3-5％，所述的常规商品发酵剂占发酵乳的体积为3-5％，混匀后在35-37℃的条件下发酵，至滴定酸度70-80°T，即得到上述植物乳杆菌的发酵乳。

进一步，所述的常规商品发酵剂为保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌或者嗜酸乳杆菌中的任意一种或者两种以上的组合。

其中，所述的灭菌方法是常规的原料乳灭菌方法，较佳的如超高温瞬时灭菌，更佳的如在95℃下加热杀菌20min。待灭菌乳冷却后再加入所述的植物乳杆菌工作发酵剂，冷却温度常规，较佳的冷却到37-40℃。发酵温度常规，较佳的为37℃。

双乙酰的测定方法是常规的顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)的方法进行检测，优选的包括将植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳置于顶空固相微萃取小瓶中待测。

其中，顶空固相微萃取的测定条件为：5g-10g上述发酵乳置于20ml顶空瓶中，55℃-60℃恒温水浴下萃取30-40min，萃取头置于GC-MS上解析5min。

其中，GC-MS测定条件为：60m×0.25mm×0.25μm HP-INNOWX毛细色谱柱(美国J&W公司)；50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头(美国Supelco公司)；初温60℃，保持3min，5℃/min升温至230℃，保持10min。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其生物学名称为：Lactobacillus plantarum Z01，属于乳杆菌属，植物乳杆菌种。于2016年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。邮编：430072，其保藏编号为CCTCC M 2016513。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的高产双乙酰的植物乳杆菌CCTCC M2016513，通过对其发酵乳中的双乙酰含量进行检测和感官评定，结果表明本发明的植物乳杆菌双乙酰产量较高，感官评分较高，改善了发酵乳的香气品质，促进发酵乳品质的提高，在发酵乳领域具有广阔的前景。

附图说明

结合以下附图，说明本发明的特征和有益效果。

图1示本发明所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513的菌落形态。

图2示本发明所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513的细胞形态(×1000)。

图3示本发明所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513的生长曲线。

图4示本发明所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513的最适生长温度。

图5示本发明所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳GC-MS总离子流图。

图6示本发明所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵酸乳和空白酸乳的感官得分雷达图。

具体实施方式

本发明从乳酸菌生境中采集样品，筛选高产双乙酰的乳酸菌菌株，研究其产双乙酰的能力，开发新的益生菌。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明从乳酸菌生境中筛选出一株乳酸菌1-33，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA对该乳酸菌1-33鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株已于2016年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC M 2016513。

本发明植物乳杆菌CCTCC M 2016513的形态学特征：

菌落特征：菌株在MRS平板上划线分离，37℃培养48h，菌株生长良好，其菌落形态如图1所示。菌落大小0.2-2mm，菌落圆形，边缘整齐，正面微凸起，颜色乳白中带点微黄色，不透明，表面湿润光滑。

菌体特征：菌体呈杆状(图2)，菌体大小一般为0.6μm×1.5μm，不产芽孢，革兰氏染色阳性。

本发明植物乳杆菌CCTCC M 2016513的培养特征：植物乳杆菌CCTCC M 2016513的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在30-40℃生长温度最佳；菌株CCTCC M 2016513的延迟期相对较短，2h进入对数生长期，11h达到稳定期。

本发明的植物乳杆菌CCTCC M 2016513来源于传统发酵食品，属公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌种，可用于乳酸菌食品中。

因此，本发明还涉及所述的植物乳杆菌CCTCC M 2016513在发酵食品中的用途。所述含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵食品包括乳酸菌奶饮料和发酵乳。

本发明还提供所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513工作发酵剂。

本发明工作发酵剂较佳的是采用下述制备方法制备的：将植物乳杆菌CCTCC M 2016513菌种接种于12％(w/v)的脱脂乳中，在37℃条件下培养10-12h至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按3-5％(v/v)接种于上述的灭菌乳中，培养10-12h至凝乳，此时凝乳中活菌数约在10⁹cfu/mL，得到所述的工作发酵剂；或者将植物乳杆菌CCTCC M 2016513菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10-12h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按3-5％(v/v)接种于MRS培养基中，培养10-12h，在4℃条件下6000r/min离心10min，去除上清液，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂。

本发明中优选的所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：原料乳在95℃下加热杀菌20min，然后冷却到40℃，再加入所述的植物乳杆菌CCTCC M 2016513工作发酵剂，使其浓度达到10⁶cfu/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的乳酸菌奶饮料。

本发明中优选的所述的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5％(v/v)加入所述植物乳杆菌CCTCC M 2016513，再加入3-5％(v/v)发酵乳商品发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度70-80°T，然后冷却至40℃，再进行冷藏保存得到含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1植物乳杆菌CCTCC M 2016513的采集、分离

(1)、样品预处理

分别取3g西藏灵菇若干份，分别放入装有15ml无菌水的50ml锥形瓶中，震荡后，静置20min，备用。

(2)、乳酸菌菌株分离

使用无菌水以体积计，按照1：10对上述样品进行连续稀释，在每个稀释度取0.1mL稀释样品，分别涂布MRS琼脂平板和M17琼脂平板，在37℃厌氧条件下恒温培养24-48h，用无菌牙签挑取大小不同、凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落背面为黄色的单菌落。然后在相应的琼脂平板上划线分纯，得到纯的单菌落，进行革兰氏染色，接触酶实验。纯化菌株保藏在相应的分离培养基中，添加30％的甘油作为保护剂，-20℃冻存。

其中使用的培养基配方如下：

MRS培养基(乳杆菌选择性培养基，北京陆桥技术股份有限公司购得)。

M17培养基(乳球菌选择性培养基，北京陆桥技术股份有限公司购得)。

不同批次样品在MRS琼脂培养基和M17琼脂培养基上共分离出90株菌。这些菌株在分离平板上表现出凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落背面为黄色。

(3)不同菌株产双乙酰能力测定

将从平板上得到的分离株接种到MRS液体培养基中培养12h，再按5％(v/v)的接种量接种到含MRS液体培养基中二次活化，在37℃发酵10h。将发酵液在4℃时6000rpm/min下离心10min，取菌体。用无菌水冲洗3次，加入无菌水混匀，备用。

原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到40℃，再加入菌悬液，再加入5％(v/v)发酵乳商品发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度70-80°T，然后冷却至室温，再进行4℃冷藏保存。

将上述冷藏的发酵乳称取5g，置于顶空固相微萃取小瓶(20ml)中。将顶空瓶置于55℃的恒温水浴锅中，插入事先老化好的萃取头(50/30μm DVB/CAR/PDMS)，顶空吸附40min，萃取结束，将萃取头转移到GC-MS进样口处，解析5min，完成进样。

其中，所述的植物乳杆菌的发酵乳是常规的发酵乳，较佳的37℃条件下发酵10h而得发酵乳。

其中，顶空固相微萃取的测定条件为：5g上述发酵乳置于20ml顶空瓶中，55℃恒温水浴下萃取40min，萃取头置于GC-MS上解析5min。

GC-MS以初温60℃，保持3min，5℃/min升温至230℃，保持10min的速率升温，完成发酵乳香气化合物的检测，从而测定得出发酵乳中双乙酰的含量。实验结果列于表1中。从表中可以看出，菌株1-33的双乙酰产量相对较高，选取这株菌，命名为CCTCC M 2016513。

表1.产双乙酰乳酸菌的初步分离

实施例2植物乳杆菌CCTCC M 2016513的鉴定

(1)生理生化试验

菌株CCTCC M 2016513为革兰氏阳性、过氧化酶阴性、不运动的杆菌，在15℃和45℃能够生长。

(2)菌株CCTCC M 2016513的16s rDNA序列分析

菌株CCTCC M 2016513基因组DNA提取方法：挑取纯化的CCTCC M 2016513单菌落接种到10mL MRS液体培养基中，37℃培养8h后将菌液离心(5000g，10min)收集菌体。采用基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取。PCR扩增采用两种合成的通用引物

16s 27F:GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG

16s 1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT

PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收，纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。所得菌株CCTCC M 2016513的16s DNA核苷酸序列为1448bp(序列表中的SEQ ID NO：1)，送GenBank(GenBank accetion number：GQ359860)做Blast分析。菌株CCTCC M 2016513同源性最高菌株的是L.plantarum qz-227(Sequence ID：AB904768.1)，同源性为99％。

根据Goodfellow和O′Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16S rRNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16S rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株CCTCC M 2016513与L.plantarum qz-227属于同一个种。菌株CCTCC M 2016513鉴定为植物乳杆菌。

依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA对乳酸菌CCTCC M 2016513鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株已于2016年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC M 2016513。

实施例3CCTCC M 2016513菌株的生长特性

(1)CCTCC M 2016513菌株生长曲线的绘制

将活化好的植物乳杆菌CCTCC M 2016513按5％(v/v)接种量接入MRS液体培养基中，37℃恒温培养16h，每隔1-2h在600nm测定培养液的OD值，以OD值对时间作图得到菌株CCTCC M 2016513在MRS中的生长曲线，其结果(图3)表明：植物乳杆菌CCTCC M 2016513在MRS培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，11h左右进入稳定期。

(2)CCTCC M 2016513菌株最适生长温度测定

将活化好的植物乳杆菌CCTCC M 2016513按5％(V/V)接种量分别接于10mL MRS液体培养基中，分别置于15℃、25℃、32℃、37℃、40℃和45℃条件下恒温培养8h，以未接种的MRS液体培养基作对照，于600nm测定不同温度下培养的培养液的OD值，依据OD值的大小确定最适生长温度。结果表明：(图4)植物乳杆菌CCTCC M 2016513的生长温度范围较广，从15℃到45℃都生长，在30℃-40℃生长良好，最适生长温度为37℃。

实施例4植物乳杆菌CCTCC M 2016513产双乙酰能力测定

(1)菌种活化：将植物乳杆菌CCTCC M 2016513菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10h进行活化，连续活化两代。

(2)工作发酵剂的制备：将活化培养物按5％(v/v)接种于MRS培养基中，培养10h，在4℃条件下6000r/min离心10min，去除上清液，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂。

(3)发酵乳制备：原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到40℃，然后加入体积百分比5％植物乳杆菌CCTCC M 2016513的工作发酵剂和体积百分比5％商品发酵剂，混匀后发酵至滴定酸度70-80°T，即得到含有所述植物乳杆菌的发酵乳CCTCC M 2016513的发酵乳。

(4)双乙酰含量测定：将上述冷藏的发酵乳称取5g，置于顶空固相微萃取小瓶(20ml)中。将顶空瓶置于55℃的恒温水浴锅中，插入事先老化好的萃取头(50/30μm DVB/CAR/PDMS)，顶空吸附40min，萃取结束，将萃取头转移到GC-MS进样口处，解析5min，完成进样。GC-MS以初温60℃，保持3min，5℃/min升温至230℃，保持10min的速率升温，完成发酵乳香气化合物的检测，从而测定得出发酵乳中双乙酰的含量，总离子流图见图5。

应用实施例1植物乳杆菌CCTCC M 2016513工作发酵剂

将植物乳杆菌CCTCC M 2016513菌种接种于添加1％乳清蛋白(WPC)的12％(w/v)在115℃灭菌15min的脱脂乳中，在37℃条件下培养10h至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按5％(v/v)接种于上述的灭菌乳中，培养10h至凝乳，此时凝乳中活菌数约在10⁹cfu/mL，得到本发明的工作发酵剂(1)。

将植物乳杆菌CCTCC M 2016513菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按5％(v/v)接种于MRS液体培养基中，培养10h，在4℃条件下6000r/min离心10min，去除上清液，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到本发明的工作发酵剂(2)。

应用实施例2含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的乳酸菌奶饮料

原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到40℃，以5％(v/v)的量加入应用实施例1所得的植物乳杆菌CCTCC M 2016513工作发酵剂【工作发酵剂(1)或者(2)】，使其浓度达到10⁶cfu/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的乳酸菌奶饮料。

应用实施例3含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳

将原料乳鲜奶在95℃加热灭菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，再冷却至40℃，以5％(v/v)的量加入应用实施例1所得的植物乳杆菌CCTCC M 2016513工作发酵剂【工作发酵剂(1)或者(2)】，以及商业发酵剂保加利亚乳杆菌，该混菌在37℃发酵至滴定酸度为70°T，冷藏至4℃并冷藏保存即得到含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳。

对比实施例1空白发酵乳的制备

将原料乳鲜奶在95℃加热灭菌20min后，再冷却至37℃，以5％(v/v)的量加入商业发酵剂保加利亚乳杆菌，在37℃发酵至滴定酸度为70°T，冷藏至4℃并冷藏保存即得到空白发酵乳。

效果实施例1含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳和空白发酵乳双乙酰含量对比将上述应用实施例3和对比实施例1中的发酵乳分别按照实施例4中的方法进行双乙酰含量测定，结果表明含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳的双乙酰含量为32.14mg/L，而对比实施例1中的空白发酵乳中的双乙酰含量为14.58mg/L，双乙酰含量提高两倍左右，证明植物乳杆菌CCTCC M 2016513具有较高的产双乙酰的能力。

效果实施例2含有植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳和空白发酵乳感官评价对比。

由8位评价员(3男，5女)进行感官评价，评价前需要对他们专业训练，使他们完全理解感官特性，熟知发酵乳的评价标准。根据[参考文献(陈洁.中温发酵酸乳品质的研究[D].江南大学,2008.)/(康欢.酸奶中风味物质与酶活及感官特性关系的初探[D].东北农业大学,2013.)]，初步选择了9个可能对产品的可接受性有重要贡献的感官性质。感官评价术语相应的定义见表2。

表2感官评价术语和评分标准

首先，从冰箱中取出标识随机码的样品(应用实施例2和对比实施例1中的样品)，随机呈送给评价员。他们打开盖子后，首先用匙子轻轻搅动酸乳，通过嗅闻确定气味类型和强度，对其他性质依次评价。采用9点标度法。所有的评价过程都在有白色灯光和可控环境的感官评价实验室中进行。评价过程中，准备一杯纯净水漱口。每个样品重复三次。结果见图6。

从图6我们可以看出植物乳杆菌CCTCC M 2016513的发酵乳在典型酸奶味、奶油味和整体接受性上高于空白发酵乳，这与效果实施例1中植物乳杆菌CCTCC M 2016513具有较高的产双乙酰的能力一致，双乙酰具有淡奶油的香气，它的存在可以显著的改善发酵乳整体的风味特征，给消费者带来更为愉悦的感官体验，从感官评价图上也可以得出这一结论。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种高产双乙酰的植物乳杆菌及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1448

<212> DNA

<213> lactobacillus plantarum

<400> 1

gtcaccttag cggctggttc taaaggttac cccaccgact ttgggtgtta caaactctca 60

tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg 120

cgattactag cgattccgac ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa 180

tggctttaag agattagctt actctcgcga gttcgcaact cgttgtacca tccattgtag 240

cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300

ggtttgtcac cggcagtctc accagagtgc ccaacttaat gctggcaact gataataagg 360

gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc 420

accacctgta tccatgtccc cgaagggaac gtctaatctc ttagatttgc atagtatgtc 480

aagacctggt aaggttcttc gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc 540

gggcccccgt caattccttt gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcggaatgct 600

taatgcgtta gctgcagcac tgaagggcgg aaaccctcca acacttagca ttcatcgttt 660

acggtatgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctacc catactttcg agcctcagcg 720

tcagttacag accagacagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattt 780

caccgctaca catggagttc cactgtcctc ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg 840

cacttcttcg gttgagccga aggctttcac atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct 900

ttacgcccaa taaatccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg 960

tagttagccg tggctttctg gttaaatacc gtcaatacct gaacagttac tctcagatat 1020

gttcttcttt aacaacagag ttttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggcgttgc 1080

tccatcagac tttcgtccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg 1140

gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatta ccctctcagg tcggctacgt atcattgcca 1200

tggtgagccg ttaccccacc atctagctaa tacgccgcgg gaccatccaa aagtgatagc 1260

cgaagccatc tttcaaactc ggaccatgcg gtccaagttg ttatgcggta ttagcatctg 1320

tttccaggtg ttatcccccg cttctgggca ggtttcccac gtgttactca ccagttcgcc 1380

actcactcaa atgtaaatca tgatgcaagc accaatcaat accagagttc gtcgactgca 1440

ttatagca 1448

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物16s 27f

<400> 2

gagagtttga tcctggctca g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物16s 1492r

<400> 3

cggctacctt gttacgactt 20