一种趋磁细菌AMB‑1的培养方法与流程

本发明微生物培养技术领域，具体涉及一种趋磁细菌AMB-1的培养方法。

背景技术：

趋磁细菌是一种可以利用地磁或外加磁场对生物体产生“导航”与定向作用的细菌。磁小体是其细胞内合成的、有生物膜包被的纳米级磁性晶体颗粒，在细胞内排列成链状。趋磁细菌Magnetospirillum magneticum AMB-1为日本学者Mataunaga等于东京天然淡水泉沉积物中分离所得的一株螺旋形趋磁细菌，是目前可以在实验室条件下培养的少数菌株之一，可产生Fe₃O₄磁小体颗粒。由趋磁细菌合成的磁小体为纳米级单磁畴晶体、无细胞毒性，具有表面积体积比较大，粒径分布均匀、形状相同或相近以及成分单一等特性，使其应用范围相当广泛，在现代生物医学、新型纳米材料和污水处理等众多领域具有极高的潜在应用价值。

目前，由于AMB-1培养条件苛刻，人工培养水平较低，培养的过程易受污染，分离纯化的趋磁性菌株数量较少等诸多因素，导致其不易大规模培养及获得大量磁小体而限制其应用研究。其次，菌体密度和磁小体产量之间的关系不够明确，长时间培养导致合成磁小体量降低。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种趋磁细菌AMB-1的培养方法。

本发明的技术方案如下：

一种趋磁细菌AMB-1的培养方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将趋磁细菌AMB-1的菌液从-70～-85℃的冻存柜中取出，立即置于合适温度的水浴中，待菌液由固态完全变为液态、无可见冰块状固体为止，立即接种于小于10mL的无菌的液体培养基1653 MSGM中，于恒温培养箱中静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为4～10d，至培养液浑浊且底部可见灰褐色沉淀，即得活化后的菌液；

(2)将8～12mL步骤(1)所得的活化后的菌液离心，去掉上清液，将沉淀转接入80～120mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为23～25h，得第一扩大培养菌液；

(3)将上述第一扩大培养菌液转接入220～270mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为18～20h，得第二扩大培养菌液；

(4)将上述第二扩大培养菌液转接入450～550mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为18～20h，得第三扩大培养菌液；

(5)取适量步骤(4)获得的第三扩大培养菌液，以4～6％的接种量接种于2.5～3.5L无菌的液体培养基1653 MSGM中进行发酵罐培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为45～48h，铁源添加量为0.15～0.25μmol/L，培养液pH维持在6.65～6.85，发酵罐的搅拌速度为90～110rpm；

(6)离心收集步骤(5)获得的物料中的菌体，经超声破碎洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中的水浴的温度为37℃。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中的培养温度为30℃。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：将10mL步骤(1)所得的活化后的菌液离心，去掉上清液，将沉淀转接入100mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为30℃，培养时间为24h，得第一扩大培养菌液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为：将上述第一扩大培养菌液转接入250mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为30℃，培养时间为18h，得第二扩大培养菌液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)为：将上述第二扩大培养菌液转接入500mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为30℃，培养时间为18h，得第三扩大培养菌液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)为：取适量步骤(4)获得的第三扩大培养菌液，以5％的接种量接种于3L无菌的液体培养基1653 MSGM中进行发酵罐培养，培养温度为30℃，培养时间为48h，铁源添加量为0.2μmol/L，培养液pH维持在6.70～6.80，发酵罐的搅拌速度为100rpm。

本发明的有益效果：本发明的方法实现了在仅改变铁源添加量及控制pH恒定的情况下，通过发酵罐培养可大幅提高AMB-1菌体密度及磁小体产量的目的。

附图说明

图1为本发明实施例2中用培养箱30℃条件下培养趋磁细菌的生长曲线；

图2为本发明实施例3获得的AMB-1菌体的透射电镜照片；

图3为本发明实施例3获得的磁小体的透射电镜照片；

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：AMB-1菌体的活化

(1)将原始菌株AMB-1(购自美国标准菌种保藏中心(ATCC))活化，使用的液体培养基(1653 MSGM)成分根据ATCC官网提供的配制。活化和培养的方法如下：将原始菌株从-80℃冻存柜中迅速取出，立即置于37℃水浴中，待菌种由固态完全变为液态、无可见冰块状固体为止。将菌体立即接种于装有无菌液体培养基的10ml螺口试管中，拧紧并用封口膜密封，置于30℃恒温培养箱中静置培养5d，至培养液浑浊且底部可见灰褐色沉淀，即得活化后的菌液。

(2)将10mL步骤(1)所得的活化后的菌液离心，去掉上清液，将沉淀转接入100mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为30℃，培养时间为24h，得第一扩大培养菌液。

(3)将上述第一扩大培养菌液转接入250mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为30℃，培养时间为18h，得第二扩大培养菌液。

(4)将上述第二扩大培养菌液转接入500mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为30℃，培养时间为18h，得第三扩大培养菌液。

实施例2：培养箱静置培养和发酵罐搅拌培养对比试验

取实施例1制取的第三扩大培养菌液进行以下实验：

培养箱静置培养：按5％接种量，将第三扩大培养菌液接种于1L已灭菌的ATCC1653 MSGM培养基中(pH6.75)，铁源添加量为0.02μmol/L，30℃恒温静置培养120h，同时测定生长曲线及Cmag值，结果如图1所示，经过48h的静置培养，菌体密度OD值为0.879。离心收集菌体，超声破碎获得磁小体，纯化后称重，所得磁小体湿重为37.1mg，干重为0.3mg，产率为0.3mg/L。

发酵罐搅拌培养：按5％接种量，将第三扩大培养菌液接种于3L已灭菌的ATCC1653 MSGM培养基中(pH6.75)，铁源添加量为0.02μmol/L，培养温度均控制在30℃，培养时间48h。发酵罐培养过程通过补料控制pH值在6.75左右，搅拌转速为100rpm。离心收集菌体，超声破碎获得磁小体，纯化后称重。所得磁小体湿重为78.8mg，干重为2.2mg，产率为0.7mg/L。显然，发酵罐培养获得的菌体密度和磁小体产量均高于培养箱静置培养。

实施例3：不同铁源添加量在发酵罐培养AMB-1菌体中的影响

本实施例与实施例2中发酵罐搅拌培养实验基本相同，所不同的是铁源添加量分为三个水平：0.02、0.2和2μmol/L，进行三个批次的发酵培养。培养过程取样测定始末OD及OD值增量，结果如表1所示。铁源添加量为0.02和0.2μmol/L两个批次实验所得磁小体湿重分别为：190.1和235.0mg，干重分别为22.7和63.3mg，产率分别为7.6和21.1mg/L。铁源添加量为2μmol/L批次实验所得磁小体量极低，因此无法称量。

为证明AMB-1是否合成磁小体，观察磁小体在菌体内部的排列以及检测磁小体外部是否有完整的脂质膜，对培养后的菌体进行收集、破碎、洗涤以及纯化，冷冻干燥获得磁小体。在透射电子显微镜下观察了菌体以及合成磁小体的情况，结果如图2和图3所示。图2所示AMB-1菌体长约4μm，宽0.4μm-0.6μm，两端各有一根鞭毛，磁小体在其菌体内部依照长轴方向链状排列；如图3所示，所得到的磁小体外部清晰可见脂质膜包被，说明本实施案例所采用的破碎方法及清洗方式不会破坏磁小体膜的完整性；平均粒径在50nm左右，粒径分布均匀，形态规整。

表1 三批发酵罐培养AMB-1的始末OD值及OD值增量

本领域普通技术人员可知，本发明的技术方案在下述范围内变化时，仍然能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍然属于本发明的保护范围：

一种趋磁细菌AMB-1的培养方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将趋磁细菌AMB-1的菌液从-70～-85℃的冻存柜中取出，立即置于合适温度的水浴中，待菌液由固态完全变为液态、无可见冰块状固体为止，立即接种于小于10mL的无菌的液体培养基1653 MSGM中，于恒温培养箱中静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为4～10d，至培养液浑浊且底部可见灰褐色沉淀，即得活化后的菌液；

(2)将8～12mL步骤(1)所得的活化后的菌液离心，去掉上清液，将沉淀转接入80～120mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为23～25h，得第一扩大培养菌液；

(3)将上述第一扩大培养菌液转接入220～270mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为18～20h，得第二扩大培养菌液；

(4)将上述第二扩大培养菌液转接入450～550mL无菌的液体培养基1653 MSGM中，静置密封培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为18～20h，得第三扩大培养菌液；

(5)取适量步骤(4)获得的第三扩大培养菌液，以4～6％的接种量接种于2.5～3.5L无菌的液体培养基1653 MSGM中进行发酵罐培养，培养温度为29.5～30.5℃，培养时间为45～48h，铁源添加量为0.15～0.25μmol/L，培养液pH维持在6.65～6.85，发酵罐的搅拌速度为90～110rpm；

(6)离心收集步骤(5)获得的物料中的菌体，经超声破碎洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。