具有头孢抗性且高表达Sir2蛋白的嗜酸乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属新菌种筛选和应用领域，更具体地说，本发明涉及一种具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17及其在相关食品或药品中的应用。

背景技术：

乳酸杆菌是指一类以糖为原料，消耗葡萄糖产生乳酸的革兰氏阳性菌，不形成芽孢，触酶阴性，细胞色素缺失，营养需求苛刻，培养过程中除了要添加适量的水、碳源、氮源和无机盐外，还需要加入维生素、氨基酸和肽等，耐酸，最适ph为5.5～6.0，最适温度为30～40，兼性厌氧，dna中的g+c含量低于55％，在自然界分布广泛，是动物和人肠道、阴道等处重要的益生菌群之一。乳酸杆菌是乳酸菌中最大的一个属，目前，已经从哺乳动物的粪便、阴道分泌物、奶酪和酸菜等中分离到40余种乳酸杆菌，包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和罗伊乳杆菌等。乳酸杆菌作为益生菌，能在人体内表现出一定的益生功能，如阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌生长，抗感染和维持肠道的微生态平衡等。乳酸杆菌不仅用于增强患者的免疫、营养、生长刺激等，同时也被广泛应用于畜牧、食品加工等行业。可见，乳酸杆菌对人体的健康和生活都扮演着十分重要的角色。

乳酸杆菌作为一种普通安全等级(generallyregardedassafe，gras)的微生物，基本上没有致病性，并具有其广泛而至关重要的生理功能，特别是发挥着与宿主互利共生、维持宿主菌群平衡的益生作用。因此，乳酸杆菌作为益生菌所带来的益生效益是不可小觑的，并且这些作用正不断被发掘和深化。

sir2(silenceinformationregulator)基因是一类从细菌到高等真核生物都高度保守的nad+依赖的组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶。sir2家族基因所编码的sir2相关蛋白统一命名为sirtuin。sir2蛋白对细胞的存活、凋亡、衰老等生理活动的调节具有重要作用。目前尚未有高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌的相关报道。

技术实现要素：

本发明进一步对sir2蛋白和嗜酸乳杆菌进行研究，通过筛选具有头孢抗性的嗜酸乳杆菌，再通过免疫印迹筛选出高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌，使其在疾病治疗或相关食品、保健品中发挥作用。

为了实现上述发明目的，本发明筛选出一种具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60192，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年5月24日。

本发明具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17可用于制备抗衰老、增强免疫功能、抗菌或调节肠道菌群的食品或药品。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗衰老食品，其包括有效剂量的作为活性成分的所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗衰老药品，其包括有效剂量的作为活性成分的所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分，以及药学上可接受的载体。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种增强免疫功能的食品，其包括有效剂量的作为活性成分的所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种增强免疫功能的药品，其包括有效剂量的作为活性成分的所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分，以及药学上可接受的载体。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗菌药物，其包括有效剂量的作为活性成分的所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分，以及药学上可接受的载体。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种调节肠道菌群的食品，其包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分。该食品特别适用于因使用抗生素导致的腹泻等肠道菌群紊乱的调节，使肠道菌群恢复平衡。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种调节肠道菌群的药品，其包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌体蛋白成分，以及药学上可接受的载体。该药品特别适用于因使用抗生素导致的腹泻等肠道菌群紊乱的调节，使肠道菌群恢复平衡。

相对于现有技术，本发明经实验发现，具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17具有一定的抑菌活性，还具有很强的头孢抗性，可显著提高器官中的mad含量，降低sod、gsh-px、no和nos的活性，因此本发明具有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌lactobacillusacidophilusla17可通过提高机体的抗氧化能力，清除衰老机体产生的过多自由基，抑制机体、组织、细胞的过氧化过程，最终起到延缓衰老和增强免疫的作用，可用于制备相关的食品或药品，具有良好的应用价值。

附图说明

图1为本发明嗜酸乳杆菌sir2基因鉴定结果。

图2为本发明嗜酸乳杆菌蛋白电泳图。

图3为本发明嗜酸乳杆菌sir2蛋白westernblot结果。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

1.益生菌初筛

收集3个正常人粪便样品各1.0g，用lb培养基扩增培养，蒸馏水稀释至10^-8共9个稀释度，取1ml，涂布到含有8～12g/l碳酸钙的mrs分离固体培养基和改良mrs分离固体培养基上，置于厌氧培养箱中，37℃厌氧培养48h。培养结束后，取出平板挑选出具有可见溶钙圈或蓝色、浅蓝色的菌落，并转接至mrs增菌肉汤培养基中在37℃厌氧培养48h，并放入4℃冰箱保存备用。

2.菌株的形态学观察。

将分离纯化的菌株纯培养物接种到增菌液体培养基中，37℃培养24h复活后，经革兰氏染色操作后，在光学显微镜下观察其细胞形态特征，并用带有数字成像系统的显微镜选取合适视野进行照相记录。

3.分子生物学-16srdna鉴定：

16srdna全长通用引物：引物1如seqidno：1所示；引物2如seqidno：2所示。

pcr反应体系(25μl)：引物1/1.0μl；引物2/1.0μl；10×pcrbuffer/2.5μl；dntpmix/2.0μl；taq酶/0.3μl；dna模板/1.0μl；超纯水/25μl。

pcr反应条件为：先94℃-4min；再94℃-30s，55℃-40s，72℃-90s下循环30次，最后72℃-10min。

以无菌去离子水替代模板作为阴性对照。扩增结束后取3.0μl扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，切割待测胶带送上海生工进行序列测定。将测定菌株的序列结果与ncbi中已知的16srdna序列进行blast对比分析得到最相近的菌株，以确定实验所分离细菌的种属。

4.抑菌活性测定

待测菌为上述获得的菌，对照菌株为鼠李糖乳杆菌，分别取各菌100μl于100ml的乳酸菌mrs增菌肉汤培养基中进行活化复苏。指示菌为escherichiacoliatcc11105、clostridiumdifficileny-5、staphylococcusaureusnt-12。

5.药敏试验

选择10种抗菌药物药敏纸片：头孢吡肟(fep，20μg)，头孢噻肟(ctx，20μg)，利福平(rf，10μg)，氨苄西林(am，10μg)，四环素(te，20μg)，氯霉素(chl，20μg)，环丙沙星(cip，10μg)，阿米卡星(ak，20μg)，庆大霉素(gm，10μg)，甲氧苄氨嘧啶(tmp，10μg)，均购自广州市宜康生物科技有限公司(oxoid)。

根据美国临床实验室标准化协会颁布的kb法进行药敏试验。首先用无菌镊子分别夹取含有不同抗生素的药敏纸片，分别贴在已接种待测菌的各平板(200μl待测菌菌悬液含菌数为3.0×10⁸cfu/ml，分别加入到温度为50℃左右的乳酸菌mrs增菌肉汤琼脂培养基)中，迅速混合均匀，倒平板。每个平板贴大约5张药敏纸片，各纸片间距离大致相等，并做好标记。在37℃厌氧过夜培养，观察平板抑菌情况，游标卡尺测定抑菌圈的大小并记录

6.sir2基因的鉴定

以待测菌的基因组dna为模板，嗜酸乳杆菌sir2引物：上游引物如seqidno：3所示，下游引物如seqidno：4所示

pcr反应体系：模板-1μl；上游引物-0.5μl；下游引物-0.5μl；dntp(10mm)-0.5μl；lataq(5u/μl)-0.5μl；10×pcrbuffer-2.5μl；灭菌水-19.5μl。

7.tricine-sds-page

a.蛋白多肽粗提

(a)收取dmem缓冲培养基培养过夜之后的菌液100ml，10000rpm离心10min，分别收集菌体沉淀及上清液；

(b)菌体沉淀转移至破壁管中，机械破壁，系数为4.0，时间为1min，重复6次，加入适量去离子水，10000rpm离心10min，除去沉淀，收集上清；

(c)用无菌蒸馏水清洗过滤膜组件3次，洗干净保护液，流尽清洗液，将10kda中空纤维滤膜装上，安装好膜组件，再用pbs缓冲液冲洗组件3次；

(d)将离心后收集的上清液通过过滤膜组件，压力为0.15mpa，温度为37℃，时间为2h，得到的残渣，用适量的无菌水溶解，重复过滤二次；

(e)取过滤液，加入固体硫酸铵至饱和度为40％，静置30min，离心除去沉淀，离心后得到的上清液继续加入固体硫酸铵至饱和度为60％，于0℃下静放3h，12000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀物，

(f)使用0.1m的醋酸铵甲醇溶液清洗沉淀两次，再用80％已预冷的的丙酮溶液润洗三次，加入100％冷冻丙酮洗一次，低温干燥30min，加入适量蒸馏水溶解干燥物，备用。

b.电泳

(a)先注入分离胶，待分离胶凝固45min后，再注入夹层胶，约45min待夹层胶凝固，最后加入浓缩胶，凝固45min；

(b)在电泳槽底部加入正极缓冲液，把制好的胶板同其制胶装置一起放入电泳槽内，在胶层间加入负极缓冲液，将整个电泳装置置于冰上，用60v的电压先电泳30min；

(c)取少量分离得到的蛋白样品，用样品缓冲液稀释至5ml，开始加样电泳，当染料从夹层胶进入分离胶后，电压加到120v，继续电泳，直至染料到达分离胶顶端，停止电泳；

(d)取出电泳槽中的胶板，即刻置于固定液中浸泡固定1.5h，再将胶板取出，于45℃的染色液中浸泡1.5h，然后用无菌蒸馏水将胶板洗涤两次，最后用变换脱色液，清洗多次，当看到明显的条带和清晰的背景则停止冲洗；

(e)洗脱后，用凝胶成像仪成像，观察目的蛋白的表达，并拍照保存。

8.westernblotting

(1)制胶：配置12％的分离胶并注入玻璃板间隙至离上边缘1.5cm处，上层加适量75％乙醇；待凝固，倒掉上层液体，注入5％浓缩胶，插入梳子，自然晾干。

(2)上样：将蛋白质样品100℃水浴3min，在电泳槽中倒入新配置的电泳液，分别在两边泳道加入8μl和5μl蛋白maker，用1×蛋白上样缓冲液补足体积到10μl，其余泳道各加10μl样品，50v恒压跑电泳。

(3)转膜：电泳结束后，剪取11cm×8cm滤纸和合适大小的0.22μm的pvdf膜，用甲醇活化5min，按照“海绵-6层滤纸-凝胶-pvdf膜-6层滤纸-海绵”组装转印夹层，夹板组装后转移至转膜槽，200ma恒流转移60min。

(4)孵育抗体：转膜结束后，tbs液洗膜5min，5％的脱脂奶粉封闭1h，tbst液洗膜3次，每次5min，加一抗兔抗人sirt3多克隆抗体稀释液4℃过夜孵育；tbst液洗膜3次，每次5min，加二抗兔抗稀释液室温孵育1h。

(5)发光检测：tbst液洗膜，加发光液孵育3min，用滤纸吸干发光液，将胶片和pvdf膜放入压片盒中压片1min，取出胶片定影30s，用水清洗，烘干，扫描。

实验结果：

1.菌体的生长情况的检查结果见表1。

表1菌体生长情况检查结果

2.16srdna鉴定结果

进入ncbi核酸数据库http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，输入待测菌株的16srdna序列，点击blast进入比对。

比对结果显示，有两种菌株的16srdna序列与其它多株嗜酸乳杆菌的16srdna序列有98％的相似性，初步判断为嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)，将其命名为lactobacillusacidophilusla15，lactobacillusacidophilusla17。

3.抑菌活性测定

抑菌活性的试验结果，见表2，两株嗜酸乳杆菌都有一定的抑菌能力。

表2l.acidophilus抑菌活性的试验结果

4.药敏试验，结果见表3所示。筛选到的两株嗜酸乳杆菌都具有很强的头孢抗性。

表3l.acidophilus的药敏试验结果

注：s-敏感；r-耐药；i-中度耐药。

5.sir2基因pcr鉴定结果

如图1所示，在720bp处分别扩增出二条嗜酸乳杆菌sir2基因条带。

6.tricine-sds-page结果

如图2所示，两株嗜酸乳杆菌sir2蛋白分别在2.7kd处有一条明亮的条带。

7.westernblotting

如图3westernblot结果显示，嗜酸乳杆菌中l.acidophilusla17的sir2蛋白表达量最高。因此，成功筛选到带有头孢抗性且高表达sir2蛋白的嗜酸乳杆菌l.acidophilusla17。

实施例2

本实施例通过嗜酸乳杆菌l.acidophilusla17(下称la17)喂饲用d-半乳糖所致亚急性衰老小鼠为衰老动物模型，对小鼠各器官的指数和生化指标进行测定和比较，探讨la17的作用。

1.动物分组

昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重(20±2)g，暨南大学实验动物中心提供。适应性饲养1w后，随机分为四组，每组10只。第一组为空白对照组、第二组为模型对照组，第三组为嗜酸乳杆菌组。

2.药品及试剂

la17为实施例1所得；d-半乳糖购至北京鼎国生物有限公司，sod、mda、gsh-px、no、nos试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

3.模型建立及给药方案

模型对照组和给药组小鼠每日接受颈背部皮下注射d-半乳糖0.15mg/g体重(生理盐水配制)，对照组注射等量的生理盐水；同时给药组小鼠每日分别灌胃la17液(浓度到10¹⁰，每日灌胃给药1ml)，空白对照组和模型对照组小鼠灌胃等量的生理盐水，共40d。

4.检测指标

各组动物经连续处理40d后称重，断颈处死，取出脑，胸腺、脾、肝、肾，用0.9％生理盐水洗净残留血液后精确称重，计算器官指数。用于切片的脑组织置于10％甲醛中固定，其余脏器组织用锡箔纸包好，置-80℃超低温冰箱保存待用。

5.各脏器指数的测定

准确称取小鼠全脑、胸腺、脾脏湿重后，计算各脏器指数(mg/g)〔胸腺重量(mg)/体重(g)〕。

6.脑组织中生化指标的测定

将冻存的脑组织放入组织匀浆机配用的玻璃管中，加入9倍体积预冷的生理盐水(蒸馏水)，充分研磨后，制成10％脑组织匀浆。采用考马斯亮蓝法测定脑组织匀浆中总蛋白含量；硫代巴比妥酸反应物法测定mda含量；酶法检测gsh-px的活性；硝酸还原法检测no具体检测方法参照试剂盒说明书。

7.统计学处理

所有数据均以x±s表示，多组间比较采用spss13.0统计学分析软件进行单因素方差分析。

表4实验组对衰老小鼠脏器指数的影响

表5实验组对脑组织中生化指标的影响

结果：

1.la17对衰老小鼠脏器指数的影响(见表4)。与空白对照组比较，模型组小鼠脑、胸腺、脾，肝、肾指数均减小(p＜0.05)，实验组小鼠各器官指数明显升高。

组织器官的重量，特别是脑、胸腺、脾、肝、肾等重要器官的重量变化是反映生物体衰老程度的重要指标。免疫器官衰变最明显的是胸腺和脾，胸腺和脾重量的降低、萎缩、功能衰退可使免疫功能降低，导致老年动物(人)恶性疾病发生率增高，加速老化进程。本结果显示d-半乳糖诱导的亚急性衰老小脑、胸腺、脾脏、肝、肾指数均显著下降，la17治疗明显提高了衰老小鼠脑、胸腺、脾脏、肝、肾重量，说明la17能够有效对抗小鼠脑的衰老，保持机体的免疫功能，提高抗病能力，从而对延缓衰老和增强免疫力具有积极的意义。

2.la17对衰老小鼠组织sod、mad、gsh-px、no、nos的影响(见表5)。与空白对照组比较，模型组小鼠脑组织mad含量显著提高，差异有统计学意(p＜0.01)，sod、gsh-px、no、nos活性明显降低(p＜0.01)，差异在统计学意义(p＜0.01)。

生物体存在抗氧化系统，其中sod是最关键的酶之一。此酶能清除超氧阴离子自由基、保护细胞免受损伤，其活性高低间接反映了机体的抗氧化能力。美国巴乐的摩老年医学研究中心研究证明，哺乳动物体内sod含量与其寿命之间呈明显正相关关系。本实验结果发现：la17能明显增强d-半乳糖诱导衰老小鼠的脑组织sod活性，提高脑组织对自由基的清除能力，阻断自由基应答。

自由基是机体正常代谢产生，但过多的自由基可侵犯细胞，特别是脑组织中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，形成代谢产物mda，继而形成脂褐素，通过与蛋白质、核酸等生物大分子交联，破坏正常细胞的功能。因此，mda含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞的损伤程度，是老化的重要指标。

no由nos利用左旋精氨酸内源性合成，是具有广泛的生物学作用的小分子物质，能溶于水和脂质，可通过旁分泌快速扩散至邻近细胞，与细胞内鸟氨酸环化酶上的血红素基因结合激活该酶，由鸟氨酸环化酶催化鸟氨酸生成环鸟营(cgmp)。cgmp作为第二信使，通过信号级联放大作用，引起一系列生物学效应。no在神经系统中的主要作用为介导神经元对兴奋性氨基酸的反应和增强机体的学习记忆能力等，其含量降低与衰老及许多老年性疾病如老年性痴呆、高血压、动脉粥样硬化等的发生有关。nos是no合成的限速酶，含有nos的神经元在中枢神经系统许多部位存在，包括大脑皮层、海马、下丘脑等，no在这些部位的神经元活动调控中起重要作用。生理性衰老与脑组织内nos活性降低密切相关。nos活性降低，使脑中no含量下降，从而可导致巨噬细胞吞噬能力下降；使有活性的鸟昔酸环化酶含量降低，调节多种代谢的能力减弱，可进一走加速衰老。本实验结果显示：模型衰老小鼠的nos活性和no含量显著下降，la17能明显提高衰老模型小鼠的nos活性和no含量。上述结果提示la17能通过增强nos活性，使no生成量增多，其生物学效应能持久发挥，从而可延缓机体衰老。

gsh-px是广泛存在于机体内的一种重要的催化过氧化分解的酶，它特异性地催化gsh对过氧化氢的还原反应，抑制烟酸胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)形成oh-，削弱对脂质过氧化作用的损伤，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。本实验结果表明la17可显著提高d-半乳糖致衰老小鼠脑组gsh-px活性，提高体内抗氧化酶活性，减轻自由基对生物大分子的伤害，而起到延缓衰老的作用。

综上，本实验表明嗜酸乳杆菌能提高sod、gsh-px、no和nos的水平，降低mda的含量，提示嗜酸乳杆菌可能是通过提高机体抗氧化能力，清除衰老机体产生过多的自由基，抑制机体、组织、细胞的过氧化过程，而起到延缓衰老作用。

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