本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及猪免疫性状相关基因esr1的分子标记及其应用。本发明所述的分子标记可用于猪免疫相关性状的检测，所述的免疫性状包括免疫性状红细胞压积、平均红细胞体积、平均血红蛋白浓度、血小板、血小板压积、cd4-cd8-cd3-和cd4-cd8+cd3-。
背景技术：
畜牧业在现代农业发展中占据着非常重要的地位，其在农业生产中所占有的比值通常用来衡量一个国家和地区发展程度的重要指标。猪肉作为我国最主要的肉类来源，在中国肉食消费中占据主导地位，可以说，我们的生活与猪肉息息相关。因此，生猪养殖产业在我国畜牧业中占据着举足轻重的地位。
随着我国养猪业的不断发展，猪病的种类越来越多，复杂程度不断加剧，控制也越来越困难。猪病对养猪生产的危害日趋严重，已成为制约我国养猪业健康、稳定发展的重要因素。猪病防治是养猪业发展的大事。近几年，虽然不少养猪场(户)为防治猪病投入了大量的人、财、物力，但很多都因猪病使养猪的利润受到影响，甚至亏损倒闭。“药越用越多，病越治越多”的现象屡见不鲜，猪病成了养猪生产的“瓶颈”(张秀芳，2013)。目前，我国主要从预防与治疗这两个方面来解决猪病。预防是指给动物接种注射能预防相应疫病的疫苗，从而增强动物的抗病能力，它是我们在动物疫病的预防控制过程中最重要的手段之一(williamhollis等，2003)。但是在实际工作中往往会岀现免疫后动物还会发生相应的疫病而死亡，或者已免疫接种的动物不产生免疫抗体或抗体水平很低的现象。即使工作人员按照猪场的正规免疫程序对健康状况良好的猪进行免疫接种，最后也往往会出现免疫失败的现象(王强等，2009)。在保证疫苗质量良好，免疫操作规范，猪场管理合理的情况下，个体机体状况与应激反应就成了影响免疫接种效果的重大因素。个体机体状况主要与遗传因素有关，动物机体对接种抗原有无免疫应答，在一定程度上是受遗传控制的，动物品种繁多，免疫应答各有差异，即使同一品种不同的个体，对同一疫苗的免疫反应强弱也不一致。有的动物甚至有先天性免疫缺陷，从而导致免疫失败。由于猪免疫应答差异，造成仔猪母源抗体水平参差不齐，即使是同一猪群中的不同个体之间母源抗体程度也不一致。各种应激反应都会干扰免疫应答，如惊吓、注射、保定，光线过强、舍温过高、湿度过大，过敏反应等应激，都会影响免疫的效果。当 给猪群注射疫苗时，猪体会对疫苗产生特异性的免疫反应，在一定程度上，这种反应是有益的，但如果反应过度，会出现过敏反应，如果严重，会对猪群产生致命影响。在生产过程中，即使做好预防免疫工作，猪群里的一些个体依然会受到感染产生疾病，针对这种情况，我国主要是采取药物治疗。但是，近年来发现，药物对猪病的防治效果越来越差，且病越来越多，一方面是药物方面的一些原因，另一方面则是猪病方面的一些原因(张秀芳等，2013)。近些年，在使用抗菌药物时遇到的首要问题是细菌的耐药性，它已成为药物疗效降低的一个重要原因(聂奎等，2009)。由于长期滥用抗生素，各地不断产生具有“多重耐药性”的菌株，它们分布相当广泛，这使得人们在选择药物时十分茫然，使用效果也不明显(陈伟华等，2010)。且近些年的猪传染病，大多是以猪免疫系统受损而导致多种细菌并发、继发或混合感染，同时还有许多新病原体的出现或老病原体发生变异，改变了病原体与猪体之间原有的相互关系，还造成一些猪传染病以非典型或综合征的形式出现，这给猪病的防治造成极大的难度。在现实中，很多缺乏药物或兽医知识的养猪者，经常频繁和大量同时用多种药物防治猪病，不但治不了病，还会造成严重后果。许多养猪场(户)，预防为主的观念尚未得到落实，未能将“防重于治”提升到“养重于防”的高度。健康猪本身具有较强的抗病能力或免疫力，尤其是一些免疫抑制性疾病，健康的猪群可明显减少发病，只有通过这种根本性的防病措施，才能大幅度减少使用药物的概率和数量，“健康养殖”才是防治猪病唯一正确的观念。而“健康养殖”的首要前提是选取免疫性能良好的健康猪进行养殖。本申请中，我们发现esr1基因中的一个snp位点，该位点与免疫性状血小板、红细胞压积、cd4-cd8-cd3-呈显著相关，与血小板压积，平均红细胞体积，平均血红蛋白浓度呈极显著相关，因此其可以用作群体育种的分子标记，进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，选种效率和准确性，在动物育种中具有广阔的应用价值。
在免疫和自免疫调节中，雌激素扮演了重要角色(cunningham和gilkeson,2011)。雌激素通过雌激素受体(estrogenreceptor,er)发挥功能，雌激素受体被激活后进入细胞核，结合于染色体上的雌激素响应元件(estrogenresponseelements,eres)上，以转录因子的形式启动下游基因表达，进而发挥雌激素的调节作用。研究发现，雌激素受体广泛表达于多种免疫细胞中，说明雌激素可调节多个免疫过程。事实上，雌激素可通过多基因、多信号通路发挥复杂的免疫调节功能(karpuzoglu-sahin等，2011)，甚至包括细胞间通讯的作用方式。雌激素可调节中枢免疫器官--骨髓中tnf-alpha、tgf-beta、il-1等免疫因子的活性，也可以广泛作用于b淋巴细胞、dcs细胞、t淋巴细胞等。在肝癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌等众多恶性疾病esr1起到了重要作用(张凤春等，2011)。由上可知，esr1基因与免疫之间存在密切关系。因此可以研究esr1基因与免疫性状之间的互作关系，这对提升猪的免疫性能和分子标记辅助育种有重要作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种与猪免疫性状相关基因esr1的分子标记及其应用。利用该分子标记可迅速预测不同基因型群体猪之间免疫性状的差别，同时在猪育种工作中，该分子标记可作为免疫性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。
为实现上述目的，本发明提供的一种免疫性状相关基因esr1的分子标记，其核苷酸序列如seqidno：1或如图5所示，在该分子标记的核苷酸序列的第33碱基位有一个snp位点，即发生a/g等位基因突变，该突变导致sma1‐rflp多态性。
具体地，该分子标记的核苷酸序列如下所示：
ccatcgcattccttgcaaatgtattacatcacr(a/g)ggggaggcggagaacttccccaccacaatctgagagctcccccggcagctcccccaaggttccaagaatccctgtcgcacttcacccccacctcgcatcactctagctgacttctgcccctgcacacactctggcatgcatccagcgctggctttctaatatgggtggc
上述序列中的第33碱基位的r是a或g，该突变导致sma1-rflp的多态性。
申请人提供了一种扩增与猪免疫性状相关基因分子标记的引物对，该引物对的序列如下：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’。
本发明还提供了一种获得上述分子标记的方法，其步骤包括：以具有esr1基因的猪基因组dna为模板，通过以下引物对进行扩增后获得所述的分子标记，所述的引物对的序列如下所示：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
pcr扩增得到如seqidno：1所述的分子标记。
一种筛选猪免疫性状分子标记的方法，包括如下步骤：
(1)猪esr1基因的引物设计与部分dna序列扩增
用猪esr1基因序列信息(genbank收录号：ensssct00000035147)作为引物设计的模板序列，利用引物设计软件oligo7.0设计引物，引物序列如下：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
(2)pcr扩增反应：
利用tianampgenomicdnakit试剂盒(购自美国invitrogen公司)从猪品种二花脸与杜洛克杂交f2代实验群体(该群体来源于申请人的实验室与广东温氏集团合作构建的广东免 疫群体)收集耳组织中提取基因组dna，具体操作方法参照tianampgenomicdnakit试剂盒说明书进行。
pcr反应：pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。
pcr反应条件为：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分esr1片段，长度为202bp，其核苷酸序列如seqidno：2所示。
(3)pcr产物的纯化、测序
pcr产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化pcr产物。将纯化后的dna溶液送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行正反向测序。
用本发明设计的引物扩增猪基因组dna得到了202bp特异性扩增片段，结果如图2所示。正反向测序结果发现该片段所在的esr1基因(genbank收录号：ensssct00000035147)的第30465碱基位发现一个a-g转换(即等位基因突变，如图3所示)，该突变造成一个sma1酶切位点(ccc^ggg)。
本发明还提供了一种上述分子标记在猪免疫性状相关分子标记辅助育种中的应用，具体应用方法如下：
采集样品的白细胞数、嗜中性细胞数、淋巴细胞数、嗜碱细胞数、平均血红蛋白浓度、嗜碱细胞数百分比等22个血液指标和cd4-cd8-cd3-等8个t细胞含量指标。根据采集样品的群体结构，运用混合线性模型来统计分析esr1基因snp位点的基因型效应及其与上述30项性状之间的关系：
y＝μ+x1β1+x2β2+x3β3+zu+ε
其中μ为平均值；x1、x2、x3、z为相应效应的设计矩阵；β1、β2、β3为固定效应，分别表示基因型、性别、窝效应；u为随机效应，即多效遗传背景，服从于u～n(0，aσa2)；ε为残差；相互独立且服从于ε～n(0，iσε2)。采用免费软件r(3.2.4)进行数据处理与统计分析。
统计分析发现该基因的a/g突变基因型与血小板(p＝0.01031)、红细胞压积(p＝0.04986)、cd4-cd8-cd3-(p＝0.04287)呈显著相关，与血小板压积(p＝0.004874)，平均红细胞体积(p＝0.0002244)，平均血红蛋白浓度(p＝5.3961×10-6)呈极显著相关。本发明还提供了一种上述分子标记的引物对在猪免疫性状相关分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了一种鉴定含有esr1基因的猪的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)设计引物对：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’。
(2)pcr扩增条件
pcr反应总体积10μl，其中待测猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。
(3)pcr反应条件：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)rflp检测
pcr产物酶切反应体积为10μl，其中pcr产物2μl，去离子水6.6μl，10×buffer1μl，限制性内切酶sma1为0.4μl，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
结果发现，在seqidno：2所示序列的33碱基位存在一个酶切位点，经sma1酶切产生三种基因型，即：aa基因型只有202bp条带，含有杂合子ag基因型有202bp、170bp、32bp三条带，gg基因型有170bp和32bp三条带。
本发明原理在于：
esr1基因序列中包含一个snp位点，位于genbank收录号：ensssct00000035147esr1基因序列的第30465bp处，该突变位点为等位基因突变，即a/g的碱基突变，该突变导致sma1-rflp多态性。这个碱基突变位于所述的esr1基因的第3外显子中，为同义突变。故本发明在esr1基因序列的snp位点附近设计引物，得到如seqidno：1所述序列的分子标记(简洁序列)，该分子标记可用于鉴定猪的免疫性状的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明利用pcr-rflp技术，在esr1基因第30465bp处发现一个a-g突变，且发现此多态位点与血小板、红细胞压积、cd4-cd8-cd3-具体性状呈显著相关，与血小板压积、平均红细胞体积、平均血红蛋白浓度具体性状呈极显著相关。对猪免疫性状的辅助选择具有积极的意义。
附图说明
图1：本发明技术流程图。
图2：猪esr1基因基因组扩增电泳结果示意图。附图标记说明：泳道m：dl2000分子量标记。图3为：本发明中猪esr1基因测序发现的a>g突变snp。
图4：猪esr1基因外显子的sma1-rflp的三种基因型(aaaggg)电泳结果示意图。附图标记说明：泳道m：2000bpdna分子量标记。
图5：是本发明制备的与猪免疫性状相关的分子标记的直观的核苷酸序列，在该序列的第33碱基位存在一个a/g等位基因突变。英文字母“r”为突变位点snp。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
猪免疫性状相关的分子标记的制备：
(1)猪esr1基因的引物设计与部分dna序列扩增
用猪esr1基因序列信息(genbank收录号：ensssct00000035147)作为引物设计的模板序列，利用生物学引物设计软件oligo7.0设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所述：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’，
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
(2)pcr扩增反应：
利用tianampgenomicdnakit试剂盒(购自美国invitrogen公司)从二花脸与杜洛克资源群体(该群体来源于申请人所在的实验室与广东温氏集团合作构建的广东免疫群体f2代，共计296头，仔猪生长到35日龄时，收集血液并测定血小板、血小板压积等22个血液指标和8个t细胞含量共计30个性状指标)耳组织中提取基因组dna，参照tianampgenomicdnakit试剂盒说明书提取基因组dna。
pcr反应：pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分esr1片段，长度为202bp，其序列为seqidno.2所示。
(3)pcr产物的纯化、测序
pcr产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化pcr产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是按照100mg胶块加入400μlgsbuffer的比例加入gsbuffer，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μlwashbuffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μlwashbuffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(dna溶液)置于-20℃保存备用。将纯化后的dna溶液送至武汉擎科创新生物科技有限 公司进行正反向测序。
用引物扩增猪基因组dna得到了202bp特异性扩增片段，得到如图2所示的结果，正反向测序结果发现该片段所在的esr1基因(genbank收录号：ensssct00000035147)全序列的的第30465位发现一个a-g转换(即等位基因突变，如图3所示)，造成一个sma1酶切位点(ccc^ggg)。
实施例2
一种基于与免疫性状相关的分子标记的检测方法，该方法的具体步骤如下所述：
1、pcr-rflp诊断方法建立
(1)引物序列设计
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
该引物扩增所得的片段长度为202bp，其序列为seqidno：2所示。在该片段的33碱基位发生一个等位基因突变(a/g)。
(2)pcr扩增条件
pcr反应总体积10μl，其中待测猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)rflp检测
pcr产物酶切反应体积为10μl，其中pcr产物2μl，去离子水6.6μl，10×buffer1μl，限制性内切酶sma1为0.4μl，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
结果发现，在seqidno：2所述序列的33碱基位存在一个酶切位点，经sma1酶切产生三种基因型：aa基因型只有202bp条带，杂合子ag基因型有202bp、170bp、32bp三条带，gg基因型有170bp和32bp三条带。
实施例3
一种与免疫性状相关的分子标记在不同猪群体多态性检测中的应用，具体步骤如下所述：
利用pcr-smai-rflp检测了二花脸与杜洛克杂交f2代实验群体(该群体来源于申请人所在的实验室与广东温氏集团合作构建的广东免疫群体)。该突变位点在实验群体中的基因型和基因频率如表1所示，检测结果显示，esr1基因在实验群体中存在三种基因型，其中aa基因型频率为0.29，ag基因型频率为0.59，gg基因型频率为0.12，酶切分型的检测结果与 测序结果相符，本发明的检测方法可靠。该结果表明esr1基因在资源群体中等位基因a占优势。
实施例4
一种免疫性状相关的分子标记与免疫性状的关联分析
本实施例的猪群来自申请人所在的实验室与广东温氏集团合作构建的二花脸与杜洛克资源猪群。
采集样品的白细胞数、嗜中性细胞数、淋巴细胞数、嗜碱细胞数、平均血红蛋白浓度、嗜碱细胞数百分比等22个血液指标和cd4-cd8-cd3-等8个t细胞含量指标。根据采集样品的群体结构，运用混合线性模型来统计分析esr1基因snp位点的基因型效应及其与上述30项性状之间的关系：计算公式如下：
y＝μ+x1β1+x2β2+x3β3+zu+ε
其中μ为平均值；x1、x2、x3、z为相应效应的设计矩阵；β1、β2、β3为固定效应，分别表示基因型、性别、窝效应；u为随机效应，即多效遗传背景，服从于u～n(0，aσa2)；ε为残差；相互独立且服从于ε～n(0，iσε2)。采用免费软件r(3.2.4)进行数据处理与统计分析。
对猪esr1基因sma1-rflp多态性位点与免疫性状进行关联分析，由表1可知：aa基因型频率为0.29，ag基因型频率为0.59，gg基因型频率为0.12。
进一步，本实施例采用r(3.2.4)语言软件中的混合线性模型对猪esr1基因的a>g突变位点的多态在实验猪群中对免疫性状进行了关联分析。分析结果见表1。统计分析发现该esr1基因的a/g突变基因型与血小板、红细胞压积、cd4-cd8-cd3-呈显著相关，与血小板压积，平均红细胞体积，平均血红蛋白浓度呈极显著相关。
表1esr1基因多态性位点基因型与部分免疫性状的关联分析检测结果
表1的说明：mchc为平均血红蛋白浓度；mcv为平均红细胞体积；pct为血小板压积；plt为血小板；hct为红细胞压积。