本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及真菌来源的多结构域酸性纤维素酶及其基因和应用。
背景技术：
纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。
纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。
纤维素酶的最主要来源是微生物，不同微生物合成的纤维素酶在组成上差异明显，对纤维素的降解能力也不尽相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用，而真菌具有产酶的诸多优点。
目前国内外，虽然许多纤维素酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，ph作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到新的能够满足实际应用需求的纤维素酶，从而能够进一步推广纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中应用。
本发明从talaromycesleycettanusjcm12802菌株中得到了一个新的多结构域纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有以下几个优点：酸性、耐高温、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比一千报道的纤维素酶更有应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种多结构域酸性纤维素酶。
本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的酸性纤维素酶，其氨基酸序列如seqidno.1：
其中，该酶全长654个氨基酸，n端18个氨基酸为信号肽序列“mqvllvatlasfvggawa”。
因此，成熟的纤维素酶cel5的理论分子量为68.5kda，其氨基酸序列如seqidno.2：
该纤维素酶的最适ph为3.0，在ph2.2-4.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力；最适温度为50℃，在30℃时依然具有约63％的酶活力，在50℃下处理60min，剩余酶活在60％以上，在60℃下处理10min，依然能够保持20％的酶活力。
本发明还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如seqidno.3所示：
本发明通过pcr的方法分离克隆了这个纤维素酶基因cel5x，dna全序列分析结果表明，纤维素酶cel5x结构基因全长2411bp，含有7个内含子，+77～152bp，+222～282bp,+637～688bp,+821～873bp，+1225～1285bp，+1308～1368bp，+2168～2249bp为其内含子序列，cdna长1965bp，其cdna序列如seqidno.4所示：
其中，信号肽的碱基序列为：
“atgcaagtgttgctcgtcgccaccctcgcatccttcgttggaggtgcctgggcg”
因此，成熟基因的编码序列为
seqidno.5所示：
成熟蛋白理论分子量为68.5kda，该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基因cel5xcdna序列及推导出的氨基酸序列在genbank中进行blast比对发现，确定cel5x是一种新的纤维素酶基因，与已经报道的来源于penicilliumdecumbens的cel5c相似度达到71％。cel5x为多结构域纤维素酶，其n端包含一个家族cbm区，c端包含一个cbmx2。
本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为ppic9-cel5x。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶基因插入到质粒ppic9上的snabi和noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aoxl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒ppic9-cel5x。
本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组菌株gs115/cel5x。
本发明还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及
3)回收并纯化所表达的纤维素酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(hansenulapolymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(pichicpastoris)gs115，得到重组菌株gs115/cel5x。
本发明还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素酶。本发明提供了一个新的纤维素酶基，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
附图说明
图1为重组纤维素酶的sds-page电泳图。
图2显示本发明的纤维素酶的酶学性质。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(pichiapastorisgs115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(i)产酶培养基：30g/l麦麸，30g/l玉米芯粉，30g/l豆粕，5g/l大麦葡聚糖，5g/l(nh4)so4，1g/lkh2po4，0.5g/lmgso4·7h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，0.2g/lcacl2于1l去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min
(2)大肠杆菌培养基lb(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126naci，ph7.o)。
(3)bmgy培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。
(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与bmgy相同，ph4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1纤维素酶编码基因cel5x的克隆
提取talaromycesleycettanusjcm12802基因组dna，以talaromycesleycettanus总dna为模板，以cel5x-f和cel5x-r为引物进行pcr扩增(见表1)，pcr反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec,30个循环，得到一约1400bp片段，将该片段回收后送睿博生物技术有限公司测序。
表1本实验所需的引物
实施例2纤维素酶cdna的获得
提取talaromycesleycettanusjcm12802总rna，利用oligo(dt)20和反转录酶得到cdna的一条链，然后以cel5x-f和cel5x-r(见表1)，扩增该单链cdna，获得纤维素酶的cdna序列，扩增得到产物回收后送睿博生物技术有限公司测序。
通过对纤维素酶cel5x的基因组序列和cdna序列比对后发现该基因有含有7个内含子,cdna长1965bp，编码654个氨基酸和一个终止密码子，n端18个氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从talaromycesleycettanusjcm12802中分离克隆得到的编码纤维素酶的基因为新基因。
实施例3纤维素酶工程菌株的构建
(1)表达载体的构建及在酵母的表达
以测序正确的纤维素酶cel5x的cdna为模板，设计合成了带有snabi和noti限制性酶切位点的引物cel5x-f和cel5x-r(见表1)，对cel5x的成熟蛋白的编码区进行扩增，并利用snabi和noti酶切pcr产物，连接进入表达载体ppic9(invitrogen,sandiego)，纤维素酶cel5x成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体ppic9-cel5x，转化大肠杆菌感受态细胞trans1。阳性转化子进行dna测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶bglii进行线性化表达质粒载体dna，电击转化酵母gs115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在md平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
以同样的方式构建含cel5x信号肽序列的cdna的表达载体，并转化。
(2)高纤维素酶活性转化子的筛选
用灭过菌的牙签从长有转化子的md板上挑取单菌落，按照编号先点到md平板上，将md平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从md平板上挑取转化子接种于装有3mlbmgy培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高纤维素酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
实施例4重组纤维素酶的制备
(1)纤维素酶基因cel5x在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
筛选出酶活较高的转化子，接种于300mlbmgy液体培养基的1l三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100ml含有0.5％甲醇的bmmy液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行sds-page蛋白电泳分析。
(2)重组纤维素酶的纯化
收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10kda膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kda超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组cel5x，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取cel5x浓缩液2.0ml经预先用10mmtris-hcl(ph7.8)平衡过的hitrapqsepharosexl阴离子柱，然后用0-1mol/l的nacl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
实施例5重组纤维素酶部分性质分析
采用dns法对本发明的纤维素酶进行活性分析。具体方法如下：在ph5.0，60℃条件下，1ml的反应体系包括l00μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应l0min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解羧甲基纤维素生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(u)。
(1)纤维素酶cel5x的最适ph及ph稳定性
经纯化的实施例3表达的纤维素酶cel5x在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。所用缓冲液为ph1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液,ph2.2～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液。所用底物为cmc-na。纯化的cel5x在不同ph的缓冲体系，50℃下测定的ph适性结果(图2，a)表明：cel5x的最适ph为3.0,呈酸性。
将酶液在不同ph值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的ph稳定性。所用缓冲液为ph1.0～2.0甘氨酸-盐酸缓冲液，ph3.0～8.0柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液,ph9.0～l2.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。结果表明(图2，b)，分析结果表明ph3.0-ph10.0之间能够维持60％以上的酶活力，说明该酶具有优良的ph稳定性。
(2)纤维素酶cel5x反应最适温度及热稳定性
纯化的纤维素酶cel5x在ph3.0条件下，测定不同温度(30℃-90℃)下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为50℃，在30℃时依然具有60％以上的酶活力(图2，c)。耐温性测定为纤维素酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该纤维素酶在50℃下处理60min，剩余酶活在70％以上，即使该酶在60℃下处理10min，依然能够保持22％的酶活力(图2，d)。
(3)纤维素酶cel5x对多种底物的比活性
在最适ph与最适温度下，将该纤维素酶与不同种类的底物反应相同时间，分析实验结果表明，该酶能够降解大麦葡聚糖(269u/mg)，羧甲基纤维素钠(166u/mg)，地衣多糖(460u/mg)，葡甘露聚糖(26u/mg),木聚糖(5.5u/mg)。此外，过夜反应，cel5x还能检测到角豆胶活性。结果表明，对于纤维素半纤维素类的底物，该酶均可以降解，具有广泛的底物特异性，这使得cel5x更适合应用于工业生产。
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>真菌来源的多结构域酸性纤维素酶及其基因和应用
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