本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种半纤维素酶及其编码基因与应用。
背景技术：
在植物体的生命过程中，细胞的分离担任着非常重要的角色：从种子萌发，到塑造植物体的形态，从花药开裂传播花粉，到果实开裂种子散发，都跟细胞在微观和宏观程度上“分离”密切相关。许多种类的果实(例如：角果、蒴果、蓇葖果、荚果等)在其发育的后期阶段，都会发生特殊类型的细胞的分化以及一系列与其紧密相关的分子和生化事件，最终使得成熟的果实开裂，并释放出种子，从而有利于扩大后代植株的生长范围，为繁荣种族以及提高植物的适应性提供了条件和保证。
果实的开裂伴随着种子的传播，是植物完成生命的延续和种族的繁衍的重要途径。然而，在农业生产上，农作物因气候变化而导致果荚过早开裂往往直接影响作物的收成，造成大量浪费。例如油料作物欧洲油菜的年产量，由于果实开裂而造成的损失平均每年可达20％，在不利的天气条件下损失可达50％(childr.d.etal.,1998,ethylenebiosynthesisinoilseedrapepodsinrelationtopodshatter.journalofexperimentalbotany49:829–838)。同时，果实开裂也会限制油料作物种子的进一步发育，影响种子的含油量(jenkinse.etal.,1999,dehiscence-relatedexpressionofanarabidopsisthalianageneencodingapolygalacturonaseintransgenicplantsofbrassicanapus.plant,cellandenvironment22:159-167.)。另外，因果实开裂而散发的种子还会对其他农作物和环境造成污染(spencej.etal.,1996,‘podshatter’inarabidopsisthaliana,brassicanapusandb.juncea.journalofmicroscope181:195-203)。由此可见，研究果实开裂对农业生产有着直接而深远的影响。
拟南芥是植物学研究常用的模式植物，与传统油料作物油菜等同科，其果荚发育与开裂与传统油料作物具有相似的结构特点。与传统油料作物相比具有生长周期短(2个月可以完成一次生命周期)，基因已全部测序完毕(基因序列清楚)，各种相关研究资料非常丰富等优势，很多油料作物品种的改良的方法和思路都来源于拟南芥的相关研究。如调控拟南芥果荚开裂的一个转录因子fruitful(ful)，有研究表明，通过用35s启动子替换编码该转录因子基因的启动子，使该基因异位表达可导致拟南芥的果荚成熟后不开裂(ferrándizc.etal.,2000,redundantregulationofmeristemidentityandplantarchitecturebyfruitfull,apetala1,andcauliflower.development127:725-734)。而后期在欧洲油菜的研究中，科学家通过同源比对的方法获得了欧洲油菜的ful同源基因，并通过相同的方法使该基因异位表达，从而筛选出欧洲油菜果实不开裂品系(qstergaardl.etal.,2005,podshatter-resistantbrassicafruitproducedbyectopicexpressionofthefruitfullgene.plantbiotechnologyjournal4:45-51)。由此可见研究拟南芥的果荚开裂的机理，可为其他植物(特别是油料作物)研究提供有力指导和强大的理论依据。
纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶是降解细胞壁的主要的三种酶(pattersons.,2001,cuttingloose,abscissionanddehiscenceinarabidopsis.plantphysiology126:494-500；robertsj.a.etal.,2000,cellseparationprocessesinplants:models,mechanismsandmanipulation.annalsofbotany86:223-235)。而植物器官的脱落和分离的过程往往伴随着开裂区细胞的细胞壁降解。有研究表明在果荚成熟衰老过程中往往伴随着在开裂区细胞的纤维素酶活性的增强且有十分明显的特异性(meakinandroberts，1990,dehiscenceoffruitinoilseedrape(brassicanapusl.).i.anatomyofpoddehiscence.journalofexperimentalbotany41:1003-1011)；果胶酶伴随的果荚成熟衰老的活性变化虽然不大且无特异性，但是突变编码果胶酶的基因(adpg1和adpg2)却导致果荚无法开裂(ogawam.etal.,2009,rabidopsisdehiscencezonepolygalacturonase1(adpg1),adpg2,andquartet2arepolygalacturonasesrequiredforcellseparationduringreproductivedevelopmentinarabidopsis.plantcell21:216-233)。然而参与果荚开裂的纤维素酶基因和半纤维素酶基因仍然未知，鉴定出拟南芥果荚开裂相关的纤维素酶和半纤维素酶将丰富对果荚开裂过程中细胞壁降解过程的理解，并有机会发现新的影响果实开裂的基因和表型，进而对油菜新品种的选育提供新的研究方向和思路，从而增加油菜的产量。与通过调控转录因子来获得不开裂的油菜品系相比，通过调控下游酶类所获得不开裂品系更有具有生产应用价值，因为转录因子是通过调控多个基因的表达来影响整个果荚开裂区的形成，因而调控转录因子所产生的品系一般都会导致果实完全不裂，在生产上反而会因为增加工作量而增加成本，与开裂带来的减产所造成的损失相比得不偿失。而调控下游细胞壁水解酶所产生的品系只会影响一个基因表达情况，并不会对整个果荚开裂区形成造成巨大的影响，因此一般只会导致果实开裂的推迟和开裂率降低，并不会导致果实完全不裂。这样既可以减少开裂造成的损失，又不会增加生产的成本，因此更具有现实应用意义和前景。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种半纤维素酶，该半纤维素酶对植物角果开裂具有调控作用。
本发明的另一目的在于提供所述半纤维素酶的编码基因。
本发明的又一目的在于提供所述半纤维素酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种半纤维素酶，名称为man7，来源于拟南芥(arabidopsisthaliana)，其氨基酸残基序列为(a)或(b)所示：
(a)如seqidno：1所示的氨基酸残基序列；
(b)对如seqidno：1所示的氨基酸残基序列经过1个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物角果开裂具有调控作用的氨基酸序列。
其中，序列表中的seqidno:1由431个氨基酸残基组成，其分子量为51kda。
上述(a)和(b)中的半纤维素酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到；(b)中man7的编码基因可通过将序列seqidno:1中的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
所述的半纤维素酶的编码基因，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)如seqidno：2所示的多核苷酸；
(b)编码如seqidno：1所示的氨基酸的多核苷酸；
(c)与seqidno：2所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性且对植物角果开裂具有调控作用的核苷酸序列；
(d)在高严谨条件下可与seqidno：2限定的dna序列杂交的核苷酸序列。
其中，序列表中的seqidno：2由2642个碱基组成。
上述高严谨条件可为在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组微生物、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。
所述重组载体为将上述任一所述编码基因插入出发载体pcambia1305.1的多克隆位点得到的重组表达载体。
所述的重组微生物为将所述重组载体转化细菌得到的重组微生物。
所述的半纤维素酶在调控植物角果开裂基因中的应用。
所述植物包括单子叶植物和双子叶植物，优选为拟南芥或油菜品种。
所述的植物也可以是不开裂的角果品系。
所述的半纤维素酶在调控植物角果开裂基因中的应用，是根据所述的半纤维素酶的基因序列，使用rna干扰(rnaintrference，rnai)、反义rna(anti-senserna)、过表达负显性(dominantnegative，dn)、crispr/cas9基因编辑技术使正常植物中半纤维素酶编码基因man7的同源基因的功能丧失或表达量下降，从而实现推迟植物角果开裂和降低植物角果开裂率。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、(1)本发明通过现有反向遗传学理论基础，分析目前数据库所含半纤维素酶基因的相关信息数据，阐明了半纤维素酶基因参与调控角果发育和开裂的机理，并加以qpcr测定拟南芥角果不同发育时期的表达量变化，获的具体参与角果发育和开裂过程的半纤维素酶编码基因man7；(2)本发明通过突变株角果开裂区细胞超微结构分析和相关统计分析验证了该基因的功能，提供的半纤维素酶基因具有重要的应用价值，是根据所述基因序列信息利用rna干扰(rnai)、反义(rnaanti-sencserna)、过表达负显性(dominantnegative,dn)或crispr/cas9基因编辑技术使正常植物中半纤维素酶编码基因man7的同源基因的功能丧失或表达量下降，从而实现推迟植物角果开裂和降低植物角果开裂率的方法。
2、本发明的基因被突变或被抑制表达后可显著推迟角果的开裂时间，同时降低植物角果的开裂率，从而减少由于环境因素导致相关作物角果提前开裂导致种子减产和造成土地污染的损失，进而保证作物种子的高产出，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
附图说明
图1是实施例2中的溶解曲线图，其中，图a表示溶解峰，图b表示溶解曲线。
图2是实施例2中半纤维素酶基因man7在不同发育时期的果荚的定量pcr表达结果统计图，其中，6d、8d、10d、12d表示开花后的天数；18a表示半黄果荚；18b表示全黄的果荚。
图3是实施例3中半纤维素酶基因man7的基因示意图以及里面两种半纤维素酶突变株的材料的插入位点的确立的电泳结果图；其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突变型。
图4是实施例4中半纤维素酶基因man7的突变株man7-1和man7-3纯合子材料的t-dna插入突变位点示意图。
图5是实施例5中半纤维素酶基因man7的突变株man7-1和man7-3纯合子材料的成熟果荚中man7基因的表达与野生型的对比结果图，其中，col-0表示野生型。
图6是实施例6中野生型和半纤维素酶man7突变株果荚从开花到变黄所需天数的统计比较图，其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突变型。
图7是实施例7中野生型和半纤维素酶突变株开裂率统计结果图，其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突变型，18期表示拟南芥黄果荚，19期表示果实发育至刚变褐的果荚。
图8是实施例8中半纤维素酶突变株man7-1和man7-3纯合子材料在果荚半黄、全黄黄、开裂等阶段的结构变化图，其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突变型；18a表示半黄果荚；18b表示全黄的果荚；19a表示干褐的果荚。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1纤维素酶man7基因的克隆：
拟南芥半纤维素酶的基因全长dna序列的获得，包括以下步骤：
1.在tair数据库(http://www.arabidopsis.org)中以cellulase(纤维素酶)作为关键字进行搜索，并将搜索所得基因的cdna序列分别在tair数据库中进行blast比对，取比对结果中e-value小于0.01的所有的基因作为候选基因(共39个)。
2.将所得的候选基因分别在tair数据库中的基因表达芯片(microarrayexpression)数据库进行搜索，将有在花发育15期心皮表达的基因保留，其余的剔除(剩下22个)。
3.将剩下的候选基因输入atted-ii数据库(http://atted.jp)中进行相关共表达基因查询。在查询所得的300个相关基因中寻找跟果荚发育与开裂相关的转录因子(如shp1，shp2，alc等)，能与果荚发育与开裂相关的转录因子有共表达结果的候选基因留下，其余的剔除(剩余6个)。
4.以不开裂的转录因子突变株(果荚不开裂转录因子突变体ind-7)和wt(野生型col-0)为材料，进行定量pcr检测剩余的候选基因是否在两种材料中出现差异，其中wt中表达量比不开裂突变株高的保留，其余的剔除(剩余两个)。其中，果荚不开裂转录因子突变体ind-7通过如下方法获得：
根据文献(liljegren,s.j.,roeder,a.h.,kempin,s.a.,gremski,k.,
ind鉴定上游引物：5’-cacccatacaatcttggatcg-3’；
ind鉴定下游引物：5’-tgttctggttgggttcaaaag-3’；
salk_058083插入引物：5’-tggttcacgtagtgggccatcg-3’；
pcr反应体系如下：
pcr反应程序为：
利用上述pcr反应体系和反应程序，以提取的拟南芥的dna(ctab法)为模板，使用ind鉴定上游引物和ind鉴定下游引物可在野生型(col-0)的拟南芥dna中扩增出一条1198bp的条带，而在ind-7纯合子突变体中均无法扩增出对应条带。而使用salk_058083插入引物和ind鉴定下游引物，可以在ind-7纯合子突变体中扩增出长度分别为756bp的条带，而无法再野生型的拟南芥的dna中得到对应条带。从而说明我们通过pcr鉴定，获得了两种不同的t-dna插入位点的ind失活纯合子突变体，命名为ind7(salk_058083)。
5.根据这个数据库中这个基因的相关资料，在该基因序列的5’和3’末端序列设计一对引物，引物序列如下：
man7克隆上游引物：
5’-ggactcttgaccatggacaacaaacaacgagaaaaatc-3’；
man7克隆下游引物：
5’-atttaccctcagatctaccatccaagacctacccacataa-3’；
提取拟南芥的dna(ctab法)，在man7克隆上游引物和man7克隆下游引物的引导下，以拟南芥的总dna为模板，pcr扩增拟南芥纤维素酶基因全长dna序列，50μlpcr反应体系为：总dna模板2μl，premixtaq(extaqversion2.0，takara公司)25μl，man7克隆上游引物(2mm)5μl，man7克隆下游引物(2mm)5μl，水13μl。pcr的反应条件为：先94℃变性2分钟；然后94℃变性30秒，58℃复性1分钟，72摄氏度延伸3分钟，共35个循环。反应结束后，对pcr产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度为2700bp的扩增片段，使用clotech的infusion-clone技术将其克隆到pcambia1305.1载体中，得到含有回收片段的重组质粒，使用m13引物对(m13上游引物：5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’；m13下游引物：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’)其进行测序，测序结果表明拟南芥纤维素酶man7基因全长具有序列表中seqidno：2的核苷酸序列，由2642个碱基组成，通过序列比对，与拟南芥纤维素酶家族成员之间的同源率在80％以上，同时与半纤维素酶man家族相似度高于90％，命名为半纤维素酶man7(简称：man7)；其编码区域为200-529，872-1066，1155-1277,1389-1591,1682-2126这五个区域，编码具有序列表中seqidno.1的氨基酸序列的蛋白质，其编码蛋白命名为半纤维素酶man7(简称：man7)，其分子量为51kda。
实施例2：半纤维素酶man7在果荚发育中的表达情况变化
在野生型拟南芥材料(col-0)开花时在花柄上用不同颜色的绳子做记号，记录对应的开花时的时间，然后根据开花后的天数(6d、8d、10d、12d)以及果荚的颜色变化(18a：半黄果荚；18b：全黄的果荚)进行取材，将所得的材料作为样品使用qiagen公司的
man7定量pcr上游引物：5’-atcgccaataaccgcattcc-3’；
man7定量pcr下游引物：5’-gggattgctcgcttgagtct-3’；
内参actin8上游引物：5’-taaggtcgtggcaccacccg-3’；
内参actin8下游引物：5’-atccgagtttgaagagctacaa-3’。
所用的反应体系为：
反应程序为：
溶解程序，获得溶解曲线(见图1)。
使用bio-rad的cfx96touchtm荧光定量pcr检测系统运行定量pcr反应，结果如图2所示，其中，时期17表示果荚的一个发育阶段，指的是从花器官(花药，萼片等)脱离果荚到果荚变黄(18期)这一阶段的果荚。从图中可以看出半纤维素酶基因man7在果荚发育和延伸的时期(6d、8d、10d)的表达量逐渐下降，在果荚将要开始变黄的时候(12d)表达量有所上升，然后在果荚完全变黄的时候到达最高点。该结果表明，该基因跟果荚的早期的生长发育有所关联，在果实开裂区形成和最后开裂的时候起作用，并影响着果荚开裂区的形态构建和开裂的过程。
实施例3：半纤维素酶man7突变株的筛选
用下述方法筛选拟南芥man7失活纯合突变体：从abrc(arabidopsisbiologicalresourcecenter)获得man7(at5g66460)位点两种不同的t-dna插入的突变体株系的种子(种子编号：gabi_747h02和sail_424_h03)(alonsoj.m.,stepanovaa.n.,leisset.j.,kimc.j.,chenh.,shinnp.,stevensond.k.,zimmermanj.,barajasp.,cheukr.,etal.2003.genome-wideinsertionalmutagenesisofarabidopsisthaliana.science301:653-657.)，并根据网站提供的资料设计所需引物，引物序列如下：
man7-1鉴定上游引物：5’-cacttattgcgcctatgcttc-3’；
man7-1鉴定下游引物：5’-gtaggagccaggggaatactg-3’；
man7-3鉴定上游引物：5’-gaaatggctgctcatgtgaaatca-3’；
man7-3鉴定下游引物：5’-ctcttccatttctccacattgatc-3’；
gabi_747h02插入片段引物：5’-atattgaccatcatactcattgc-3’；
sail_424_h03插入片段引物：
5’-gccttttcagaaatggataaatagc-3’。
以拟南芥的dna为模板(实施例1提取的拟南芥dna)，用上、下游引物进行扩增，pcr反应体系如下：
pcr反应程序为：
通过pcr鉴定，获得了两种不同的t-dna插入位点的man7失活纯合子突变体，分别命名为man7-1(gabi_747h02)和man7-3(sail_424_h03)。具体过程为：
利用上述pcr反应体系和反应程序，使用man7-1鉴定上游引物和man7-1鉴定下游，以及man7-3鉴定上游引物和man7-3鉴定下游引物可分别在野生型(col-0)的拟南芥dna中扩增出一条1060bp和673bp的条带，而在man7-1和man7-3纯合子突变体中均无法扩增出对应条带(图3a和3b)。而使用gabi_747h02插入片段引物和man7鉴定下游引物，sail_424_h03插入片段引物和man7鉴定上游引物可以分别在man7-1和man7-3纯合子突变体中扩增出长度分别为324bp和686bp的条带，而无法在野生型的拟南芥的dna中得到对应条带(图3c和3d)。
实施例4：man7失活纯合子突变体的t-dna插入位点的鉴定
将实施例3扩增出来的长度分别为324bp和686bp的条带回收，得到man7-1和man7-3的dna，然后将使用gabi_747h02插入片段引物和man7-1鉴定上游引物以man7-1的dna为模板的pcr扩增产物和使用sail_424_h03插入片段引物和man7-3鉴定下游引物以man7-3的dna为模板的pcr扩增产物分别测序。根据所得的测序结果在拟南芥数据库中blast以确定man7-1和man7-3的t-dna的插入位点。结果表明，man7-1的插入位点位于man7基因的5’-utr处，属于man7启动子区域；而man7-3的插入位点位于man7基因的最后一个内含子上(见图4)。
实施例5：验证man7失活纯合子突变体中man7基因的表达下调
分别以man7-1和man7-3的开花后12天的果荚为材料提取rna，并反转录成cdna。以cdna为模板，哥伦比亚型(col-0)即野生型为对照，使用定量引物与实施例1一致，结果如图5所示，从图中可以看出，所得的两种man7失活纯合子突变体中man7基因的表达量只有野生型的14％(man7-1)和0.2％(man7-3)。
实施例6：半纤维素酶突变体果荚成熟推迟
将实施例2中纤维素酶man7的纯合子突变体man7-1和man7-3以及对应野生型哥伦比亚型拟南芥材料的花通过绑不同颜色绳子进行标记来记录每朵花开花的日期，然后在果实变黄时通过观察绳子颜色可计算出从花到变黄果荚所需的发育时间，每种材料统计至少50个果荚。结果如图6所示，从图中可以看出，野生型拟南芥(col-0)从开花到果荚变黄平均需要14.25天，而纤维素酶纯合子突变体man7-1和man7-3则分别需要16.19天和16.86天，均比野生型推迟2天左右。说明纤维素酶缺失能造成拟南芥果实发育延迟。
实施例7：半纤维素酶突变体果荚开裂率下降
将实施例2中半纤维素酶man7的纯合子突变体man7-1和man7-3以及对应野生型哥伦比亚型(col-0)拟南芥材料的果实发育至刚变褐(19期)时，取该果实和这个果荚对应的上一个全黄的果荚(18期)放置于解剖镜下观察是否有裂口。每种材料(man7-1、man7-3、col-0)从6株以上的植物中选取：每棵植物统计15个18期和15个19期的果荚(一共统计90个以上果荚)，计算每种材料每种时期的开裂率(开裂率为有裂口的果荚占果荚总数的百分比)，然后每种材料用6株植物作为样品重复(每种材料每种时期会得到6个开裂率)，再统计获得平均开裂率，在将突变株的不同时期的开裂率和对应的野生型数据进行比较并使用p值校验他们的差异性。
结果如图7所示，从图中可以看出，野生型拟南芥黄果荚(18期)的开裂率为76±3.6％，而纤维素酶纯合子突变体man7-1和man7-3黄果荚(18期)的开裂率为38±3.5％和39±7.8％；在变褐果荚中，野生型的开裂率为100％，而突变株的开裂率为82±2.9％和82±5.1％。突变株相对野生型的p值均远低于0.05，表明突变株和野生型在开裂率之间存在显著的统计学差异。说明半纤维素酶缺失后会造成拟南芥果实开裂率下降。
实施例8：半纤维素酶突变体果荚对果荚发育过程中形态的影响
取野生型(col-0)，半纤维素酶man7失活纯合子突变株man7-1和man7-3的半黄果荚(18a)，全黄的果荚(18b)以及干褐的果荚(19a)在体式显微镜进行检测。结果如图8所示：在果荚半黄的时期(18a)，野生型以及半纤维素酶man7失活纯合子突变株man7-1和man7-3的果荚均未开裂。在果荚全黄的时期(18b)，野生型的果瓣和胎座框已经分离，果荚已经开始开裂，而半纤维素酶man7失活纯合子突变株man7-1和man7-3的果荚并未裂开。在干褐果荚(19a)中，野生型的果荚已经完全裂开，而半纤维素酶man7失活纯合子突变株man7-1和man7-3的果荚顶部和基部虽然出现了裂口，但是整个开裂区还有许多地方处于未开裂状态(图7)。说明半纤维素酶突变后对果荚的开裂造成明显的影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>华南农业大学
<120>一种半纤维素酶及其编码基因与应用
<130>1
<160>19
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>431
<212>man7
<213>拟南芥属拟南芥（arabidopsisthaliana）
<400>1
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argthrlysglyvalglnpheserleuasnglytyrprotyrtyrala
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<210>2
<211>2642
<212>dna
<213>拟南芥属拟南芥（arabidopsisthaliana）
<400>2
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