本发明属于细胞分化和培养领域，特别涉及一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法。
背景技术：
自然杀伤细胞(naturalkiller，nk)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓或胸腺微环境，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。nk细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于t、b淋巴细胞的第三类淋巴细胞。nk细胞表达cd56但是缺失cd3，通常用标志物组合cd3-cd56+来定义nk细胞。nk细胞主要存在于外周血和脾脏中，大概占到外周血淋巴细胞的5％～15％。
nk细胞在无需抗原预先致敏的情况下就能直接杀伤肿瘤细胞和被感染的细胞。nk细胞可以通过多种方式杀伤靶细胞：1、与靶细胞接触后，nk细胞通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞；2、通过自身表达的配体，来激活靶细胞表面的死亡受体；3、通过抗体依赖的细胞毒性作用对靶细胞造成杀伤；4、活化的nk细胞通过释放tnf引发靶细胞的细胞凋亡。
nk细胞是人体的第一道抵御防线，是机体抵抗恶性肿瘤细胞和抗病毒感染的重要免疫调节细胞，也是连接天然免疫和特异性免疫的重要桥梁。外周血中的nk细胞数量非常有限，所以限制了nk细胞的临床应用。当今获得临床级nk细胞的方法是体外培养，即分离患者外周血的单个核细胞进行诱导和扩增，使其增加数百甚至数千倍并且细胞毒性得到很大的提高，再把nk细胞回输到患者的体内，但是常规的nk细胞的制备方法并不理想。
nk细胞在体外难以得到大量增殖，常见的nk细胞的扩增方法包括免疫磁珠分选法(millerjs,etal.,blood105(8):3051-7,2005)、滋养层细胞培养法(fujisakih,etal.,cancerres69(9):4010-7,2009)和使用动物血清(iliopouloueg,etal.,cancerimmunolimmunother59(12):1781-9,2010)。动物血清能提供细胞培养所需要的营养物质，还能提供激素和各种生长因子。然而，动物血清成分复杂，在临床治疗中有一些潜在的风险。使用滋养层细胞(例如肿瘤细胞株k562)是一种有效的nk细胞培养方法。不使用滋养层细胞其培养效果和培养纯度均不够理想，使用滋养层细胞会得到纯度较高的nk细胞，但是k562细胞本身是一种肿瘤细胞，所以其安全性仍然是一个问题。免疫磁珠的方法过程繁琐，成本较高，并且纯的nk细胞增殖速度较慢，还会引入外源性物质(磁珠、洗脱液中的成分和抗体等)。
技术实现要素：
为了解决现有技术中nk细胞纯度不够、扩增倍数不高、扩增方法成本高且比较麻烦以及安全性不够的问题，本发明提供了一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法，该方法不含动物血清和肿瘤细胞成分，从而很大程度上提高了nk细胞的安全性和可靠性，具有良好的应用前景。
本发明的一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法，包括：
采集100～200ml外周血的单个核细胞，先将单个核细胞放入被cd16单抗包被过的培养瓶中培养，培养基中加入il-2、il-15、ok432和灭活的自体血清；随后将细胞转入到没有被cd16单抗包被过的培养瓶中培养，培养基中加入il-2、il-15和灭活的自体血清；再把细胞转移到培养袋中培养，倒数第三天培养基中加入il-4继续培养，即得大量nk细胞。
所述cd16单抗浓度为0.01～3.0mg/ml，包被温度为4℃，包被时间为2～16小时。优选浓度为0.15mg/ml，优选包被时间为16小时。
所述含il-2、il-15、ok432和灭活的自体血清的培养基的具体组成为：100～1000u/ml的il-2、10～200ng/ml的il-15、0.01～1ke/ml的ok432和5～10％灭活的自体血清。优选：700u/ml的il-2、100ng/ml的il-15、0.01ke/ml的ok432和10％灭活的自体血清。
所述含il-2、il-15和灭活的自体血清的培养基的具体组成为：100～1000u/ml的il-2、10～200ng/ml的il-15和5～10％灭活的自体血清。
所述培养基为gt-t551无血清培养基。
所述单个核细胞放入被cd16单抗包被过的培养瓶中培养三至五天，优选五天。
所述转移到培养袋中培养后每2-3天细胞传代或者换液一次。
所述倒数第三天培养基中加入300～500u/ml的il-4，优选500u/ml。
能用于nk细胞的培养基有很多种，只要可以把外周血单个核细胞诱导成为nk细胞并使之增殖即可，常见nk细胞的培养基通常有x-vivo10、x-vivo20、gt-t551无血清培养基、optmizercstt-cellexpansion无血清培养基和cellgro无血清培养基等。本发明使用的nk培养基是gt-t551无血清培养基。
本发明所添加的细胞因子包含白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素15(il-15)。在缺失受体γc(commonchaingama)的老鼠中未能检测到nk细胞，因此认为受体γc对nk细胞的发育起到至关重要的作用(disantojp,etal.,procnatlacadsciusa92(2):377-81,1995)。细胞因子例如il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21的细胞受体都包含受体γc(waldmannta，cancerimmunolres3(3):219-27,2015)。敲除基因il-2会造成nk细胞的缺失(disantojp,etal.,j.exp.med171(5):1697-704,1990)，il-2能够提高nk细胞的增殖能力(shibuyaa,etal.,blood85(12):3538-46,1995)。il-15同样对nk细胞的发育和增殖起着至关重要的作用(huntingtonndetal.,j.exp.med206(1):25-34,2009)；其他的细胞因子例如il-4，和il-15合作能增强nk细胞的杀伤能力(kiniwat,etal.,procnatlacadsciusa113(36):10139-44,2016)。
ok432是一种能激活免疫能力的制剂，对免疫系统有多重激活作用，而且ok432还能提高nk细胞的毒性(bonavidab,etal.,cellimmunol102(1):126-35,1986)。cd16即fcγrⅲ，为分子量为50000～70000的糖蛋白，属ig超家族成员，nk细胞上交联的cd16直接导致细胞内ca+水平的增加和一系列的类似于t细胞受体激活的级联生化反应，cd16单克隆抗体可激活nk细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。本发明在培养基中联合使用il-2等多种细胞因子、ok432和cd16单抗，很大程度上提高了nk细胞的扩增倍数，又提高了nk细胞的杀伤能力。
有益效果
(1)本发明用灭活的自体血清代替动物血清，解决了使用动物血清在培养nk细胞中带来的不安全问题。
(2)对于传统的nk细胞培养方法，使用滋养层细胞会得到纯度很高的nk细胞，不使用滋养层细胞的话，nk细胞的纯度会比较低。本发明绕开了滋养层细胞，在培养基中加入了免疫激活剂ok432，使用cd16单抗直接快速有效的激活了nk细胞的增殖信号；所以本发明在没有滋养层细胞的条件下，仍然能够得到高纯度的nk细胞。
(3)本发明在细胞培养的最后三天加入了il-4，极大的提高了nk细胞的杀伤能力。
(4)在细胞的增殖处于对数期的时候，把细胞从培养瓶转到培养袋中培养：第一，保证了nk细胞被充分激活；第二，稀释了细胞代谢产物对细胞的不利影响；第三，在同等条件下，培养袋的培养效果要优于培养瓶。
附图说明
图1是常规培养方法与本发明所得nk细胞扩增倍数的比较图；
图2是常规培养方法与本发明所得nk细胞的活力比较图；
图3是常规培养方法与本发明所得nk细胞的纯度比较图；
图4是本发明所得nk细胞的其他标志物的表达水平；
图5是常规培养方法与本发明所得nk细胞对k562杀伤能力的曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、pbmc的分离过程
用25ml生理盐水溶解500μg人cd16单抗，然后完全加入到一个t175的培养瓶中。使液体铺满瓶底，把培养瓶平放在4℃冰箱中包被过夜(16个小时)。
从患者外周血中分离外周血，用注射器吸出血液缓缓滴入50ml离心管中。用600g的转速离心20分钟；分离后的血液上层为血浆层，下层为血细胞层。吸取上层血浆，封口，56℃灭活30分钟，灭活完毕；4℃放置15分钟，用1800g的速度离心15分钟，自体血浆离心结束后，分装到15ml离心管中，根据当前需要把血浆保存在-20℃或4℃中。用与血细胞沉淀等体积的生理盐水重悬下层血细胞沉淀，混合均匀。
预先把人淋巴细胞分离液ficoll-hypaque(密度为1.077g/ml)平衡到室温。把20mlficoll缓慢加入到50ml体积的无菌离心管中，倾斜离心管45度，在离ficoll液面上1cm处把等体积的细胞悬液缓慢加到ficoll上面。把离心管放入水平离心机，用500g的速度离心20分钟。
从离心管中吸取中间白膜层，加入到新的50ml离心管中。吹打均匀，用生理盐水定容至45ml，600g离心10分钟。离心后弃上清，补加40～45ml生理盐水吹打细胞至混匀，再次以500g离心10分钟，弃上清得到外周血单个核细胞。用20～30ml培养基重悬细胞，同时细胞计数。
二、nk细胞的扩大培养过程：
从培养瓶中吸走cd16单抗液体。用含有700u/mlil-2、100ng/mlil-15、0.01ke/ml的ok432和10％灭活的自体血清的optmizercstt-cellexpansion培养基培养把pbmc的浓度调整为1.5×106个/ml，把25mlpbmc细胞悬液加入到被cd16单抗包被过的t175的培养瓶中培养。
细胞在37℃的培养箱中培养5天后，把所有的细胞用25～30ml新鲜的培养基重悬，全部转移到另外一个新的没有被cd16单抗包被过的t175的培养瓶中(培养基中含有700u/mlil-2、100ng/mlil-15和10％灭活的自体血清)。
在第八天的时候，把细胞转移到培养袋中培养，细胞的接种密度是1.5～2.0×106个/ml，此时使用的培养基仍然是用含有700u/mlil-2、100ng/mlil-15和10％灭火的自体血清的optmizercstt-cellexpansion培养基。细胞每2到3天换液或者传代一次；在第18天的时候，培养基中添加500u/mlil-4，总共培养21天以后就能够得到大量高纯度的nk细胞。三、扩大培养后细胞的表型分析：
从培养瓶中取出细胞，每个5ml流式细胞仪检测管中加入1×106个细胞，用800rpm的转速离心5分钟，丢掉上清；用pbs洗细胞一次，用800rpm的转速离心5分钟，丢掉上清。
用10μghumanigg封闭每管细胞，室温下封闭15分钟。然后根据抗体说明书上指定的抗体使用量把抗体直接加到细胞里面，4℃孵育30分钟。
用4ml的pbs洗细胞2次，用300μl的pbs重悬细胞。
使用流式细胞仪之前加入pi或者7-aad燃料。
流式细胞仪数据显示：用本发明所得cd3-cd56+nk细胞的纯度能高达98.7％；而用常规方法所得nk细胞的纯度仅仅是40.5％。所以用本发明所得的nk细胞的纯度明显高于常规培养方法所得的细胞纯度。
本发明所得nk细胞表达高水平的的ifn-γ和其他nk细胞标志物nkp30，nkp44，nkp46和nkg2d。21天以后，本发明所得nk细胞的扩增倍数是290±20，而用常规方法所得nk细胞的扩增倍数是145±26，所以本发明的nk细胞扩增效率几乎是常规培养方法的两倍。
四、扩大培养和免疫细胞的活力(viability)分析
用细胞凋亡检测试剂盒(556547，bdbiosciences)检测免疫细胞的活力。收集免疫细胞，离心去除上清，用预冷的pbs(phosphatebuffersaline)缓冲液洗两遍。
用1×bindingbuffer把细胞稀释成1×106个/ml的细胞悬液；把100μl的细胞悬液加到一个5ml的圆底离心管中；加入5μlpi和5μlannexinv试剂，轻轻混匀细胞，室温下避光放置15分钟，然后加入400μl1×bindingbuffer，用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。
在细胞活力方面，用本发明和常规方法没有明显的区别；两种培养制备方法所得的细胞活力都能在95％以上。
五、扩大培养后免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤实验：
白血病细胞株k562培养在含有10％胎牛血清的1640培养基中，取处于对数生长期的k562细胞计数并用于实验。
整个杀伤实验中用到的培养基是含有1％灭活的胎牛血清的1640培养基。用到的试剂盒是非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega,g1780)。
用新鲜的培养基把k562细胞制成1×105个/ml的细胞悬液，加入到圆底的96孔板中，每孔100μl。用同样的培养基调整一系列nk细胞的浓度，把80μlnk细胞按照效应细胞：靶细胞为1:1、10:1、30:1、50:1的比例加入到k562细胞中；同时设置nk细胞对照和k562细胞对照组，培养基对照组和k562细胞最大释放组，每孔的最终体积矫正为200μl，均设三个复孔，250g离心4分钟，把细胞放在37度的培养箱中培养6个小时。
在反应结束前45分钟，把20μl裂解液加入到靶细胞最大释放组。反应结束后从每个孔吸走50μl细胞上清至另一个新的96孔板，再加入50μlldh酶反应液，混匀30秒，室温下避光放置30分钟，再加入50μl终止液，用酶标仪测量每个孔的od值。
计算nk细胞杀伤活力的公式：自然杀伤活性％＝(实验组od值-nk细胞对照组od值-k562细胞对照组od值)/(k562细胞最大释放组od值-k562细胞对照组od值)×100％
在不同的效靶比条件下，本发明所得nk细胞的杀伤效率均明显的高于常规方法所得nk细胞的杀伤效率，见表1。效靶比越高，nk细胞的杀伤效率越高；在效靶比是30:1的时候，本发明制备的nk细胞的杀伤效率是90±8.3％，50:1的时候达到最大，93.2±5.2％。
表1杀伤效率的具体数值
注：对于每个组别，常规组和实验组的杀伤率存在显著的差异，p<0.01。