专利名称：猪脂联素球状结构域蛋白gAd基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及猪脂联素球状结构域蛋白的gAd基因及其编码的gAd蛋白在重组乳酸乳球菌中的表达。
背景技术：
猪是一种脂肪沉积较多的动物，控制猪脂肪沉积、提高瘦肉率，同时又能保障猪肉的食品安全一直是国内外猪育种和营养研究的热点。使用“瘦肉精”提高瘦肉率对消费者健康构成威胁。长时间以来，提高猪只瘦肉率一直是养殖从业人员追求的目标，因为瘦肉率越高养猪的经济效益就越显著。因此为了达到提高瘦肉率的目的，不少养殖户违法使用“瘦肉精”等违禁药物，但“瘦肉精”残留所造成的食品安全问题对消费者健康构成很大的威胁。另一方面，随着生活水平的不断提高，人们对猪肉食品安全，以及肉质如口感、风味等的要求也在提高。几乎无脂的瘦肉已满足不了消费者的需要。研究发现，其实当猪的肌间脂肪含量达到2 % 3 %时，猪的肉质的口感更好，含一定量肌间脂肪的瘦肉具有更好的肉质。因此研究者都希望能找到影响猪脂肪和肌纤维沉积同时对动物及人体无害的重要生理性物质，以调节脂肪代谢和沉积。脂联素(Adiponectin，Ad)是其中的可能替代物。脂联素是动物脂肪细胞分泌的一种激素，是与脂肪沉积呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白。脂联素进入血液循环，通过受体结合发挥作用，在肝脏、脂肪与骨骼肌调控糖代谢和脂肪酸代谢，影响机体组织对糖的利用、胰岛素敏感性、脂质合成和能量平衡等。猪全长脂联素蛋白由243个氨基酸组成，一级序列分析其包含四个功能区信号肽、氨基端非螺旋功能区(N端)、胶原重复序列和羧基端球状区(C端)。C端的球状区是脂联素蛋白生物活性的关键部位。脂联素可被蛋白酶裂解，产生约16. 5kD的含羧基端球形结构域的蛋白片段(globular adiponetin，gAd)。gAd是其活性结构域，有研究报道该球形结构域单独作用具有更强的生物活性。因此，如何寻找合适的表达载体和表达方法，有效、安全表达猪脂联素球状域，获得可直接被动物利用的外源脂联素，达到调节猪只脂肪代谢和脂肪沉积的目的是目前本领域研究的重要课题。
发明内容
本发明的目的之一是克服现有猪脂联素球状域应用技术的不足，提供一种猪脂联素球状域的重组基因及编码蛋白。本发明的另一个目的是提供表达所述猪脂联素球状域的重组基因的表达载体。本发明还提供所述猪脂联素球状结构域蛋白gAd基因及其编码蛋白的表达方法。本发明同时提供一种含有gAd基因的原核表达载体和利用该载体转化的重组微生物。
本发明同时提供含有该重组微生物表达的重组脂联素的产品或纯化的重组脂联
O本发明的目的通过以下技术方案予以实现
本发明提供了一组新的引物序列，是用于扩增猪脂联素球状域的重组基因gAd的引物，具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列 上游引物P3:
5' GTCCTTAGGGCCCCATGGATCATCATCATCATCATCATGCCTATGTCT ACCG3‘；
下游引物P4: 5 ‘ TGGAGCTCGTCATTCAATGTTGTG3‘。本发明提供一种猪脂联素球状域的重组基因gAd，具有如SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO :2所示gAd蛋白。提供一种含gAd基因的乳酸乳球菌原核表达载体，具有SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列。提供含有具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重组原核表达载体转化的乳酸乳球菌。本发明同时提供一种猪脂联素球状结构域蛋白gAd基因及其编码蛋白的表达方法，其特征在于包括以下步骤
(1)根据猪脂肪组织总RNA克隆得到Ad基因；
(2)采用引物P3和P4，通过PCR扩增方法从步骤(1)所述Ad基因中克隆出gAd基因， 并在gAd基因的上游引入Afc0 I酶切位点和6个组氨酸，下游引入fee I酶切位点，制备得到gAd基因片段；
(3)将步骤(2)所述gAd基因片段克隆至克隆宿主大肠杆菌MC1061中得到重组质粒，经重组质粒鉴定和扩增后，用该质粒电击转化表达宿主-乳酸乳球菌(Lactococcm lactis) NZ9000 ；(4)通过Nisin诱导，筛选可高效表达gAd蛋白的修饰型乳酸乳球菌株。步骤(2)所述PCR 扩增反应条件为94°C 5min，94°C 40s,54°C 30s, 72°C 30s，共 30个循环，最后72 °C 7min。所述6 个 Hi S 是 CATCATCATCATCATCAT。本发明以猪脂联素球状结构域(globular Adiponectin，gAd)序列为基础，通过PCR在gAd基因的5’端加上六个His标签，并将该基因片段克隆到克隆宿主大肠杆菌MC1061中，经重组质粒鉴定和扩增后，用该质粒电击转化表达宿主-乳酸乳球菌 Uactococcus hciidNZgOOO。通过Nisin诱导，筛选可高效表达gAd蛋白的修饰型乳酸乳球菌株，制备特异性抗gAd的抗血清，再通过Western blotting检测脂联素蛋白，确定体外表达的gAd蛋白具有相同免疫原性。为制备一种富含猪脂联素球状结构域的乳酸菌微生态制剂，通过重组乳酸乳球菌NZ9000表达脂联素调节猪只脂肪代谢和脂肪沉积打下了基石出。总结来看，本发明具有以下有益效果
本发明采用乳酸乳球菌作为表达宿主，成功利用乳酸乳球菌的安全、益生菌功能，表达的蛋白无需纯化，可直接喂食动物，一方面可发挥乳酸菌的微生态制剂的作用，调节和稳定胃肠道微生态环境功能，抑制或杀灭胃肠道中常见的致病菌，减少腹泻，可以调节动物胃肠道的非特异性免疫功能和动物肠道微生态平衡；另一方面本发明提供的乳酸乳球菌携有 gAd基因，能编码gAd蛋白，具有安全提高瘦肉率，减少脂肪沉积的特点，且具无需分离纯化蛋白的优点，可制备为调节猪脂肪代谢的微生态制剂。具体来说，本发明具有三个方面的显著进步性
(1)本发明提供的重组乳酸菌微生态制剂能够改善猪的肠道微生态平衡，作为猪的饲料添加剂可直接被动物采食；
(2)不同品种的猪，其脂肪沉积能力差异很大，特别是我国的地方优良品系，如蓝塘猪， 其肉质和口感好，但脂肪沉积比瘦肉型猪高很多，本发明可应用于相关研发产品，其含有的猪脂联素球状结构域，从动物营养和动物生理角度调节猪脂肪代谢，提高所述品种猪的瘦肉率，减少脂肪沉积，从而提高我国地方优良猪种的养殖经济效益；
(3)通过本发明的应用，调节猪只脂肪代谢，提高瘦肉率，安全可靠，且使用方便，降低生产成本，可达到“瘦肉精”等违禁药物的使用效果，但克服了 “瘦肉精”等违禁药物的危害性，为从根本上杜绝“瘦肉精”提供替代产品和技术支持，改善肉类食品的安全性。
图1重组表达载体pNZ8048_gAd经Afco I.Sac I双酶切鉴定图； 图2在GenBank的Blast比对图3本发明gAd基因的诱导表达及纯化含gAd蛋白的SDS - PAGE分析； 图4本发明gAd蛋白的Western Blotting分析图； 图5重组表达载体pNZ8048-gAd的酶切和构建流程图； 图6 gAd蛋白对小鼠血清葡萄糖(PGL)的影响； 图7 gAd蛋白对蓝塘猪血清葡萄糖(PGL)的影响； 图8 gAd蛋白对蓝塘猪血清游离脂肪酸(FFA)的影响； 图9 gAd蛋白对蓝塘猪血清甘油三酯(PTG)的影响； 图10重组乳酸乳球菌NZ9000-gAd菌株的镜检图片。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所采用的材料，五coli MC1061购自浙江大学，(M. coli MC1061相关描述也可参见《食品级乳酸乳球菌高效表达苯丙氨酸脱氨酶及动物疗效实验研究》，陈星，首都医科大学，2006。)；限制性内切酶Afco I ,Sac I、T4 DNA连接酶均购自宝生物(大连)公司，乳酸乳球菌载体ρΝΖ8048及乳酸乳球菌 Laciococc^s lactis NZ9000 (Z. LaciisNZgOOO)购买自荷兰 OTZO 研究所；GM17 培养基是在购自海博公司的M17培养基中加入质量体积比为2. 5%葡萄糖的溶液；测定血清葡萄糖、血清甘油三酯试剂盒购自普利莱公司，血清游离脂肪酸试剂盒购自南京建成公司， 其他材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1 对gAd基因的修饰
本实施例采用TAKARA总RNA提取试剂盒提取蓝塘猪脂肪组织总RNA，以GenBank发布的脂联素基因(基因登录号AY135647)为基础，通过PCR法克隆得到脂联素Ad基因，设计引物序列为
上游引物 P1 5 ‘ GGCTCTGATTCCACACCTG3 ‘； 下游引物 P2 5 ‘ CTCCTAATGACACTGAAGACCTC3 ‘。反应条件为94°C3min，94°C 40s，49°C 30s, 72°C 40s，30 个循环，最后 72°C 7min。测序正确后以该序列设计引物扩增gAd，选取猪脂联素球状结构域部分的基因，截取球状结构域的414个碱基，并在上游引入Afc0 I酶切位点和6个组氨酸，下游引入fee I 酶切位点。引物设计序列如下
上游引物P3:
5' GTCCTTAGGGCCCCATGGATCATCATCATCATCATCATGCCTATGTCT ACCG3‘； 下游引物P4:
5 ‘ TGGAGCTCGTCATTCAATGTTGTG3‘；
反应条件为94°C 5min，94°C 40s, 54 °C 30s, 72 °C 30s，共 30 个循环，最后 72 °C 7min。其中所述的6个组氨酸是上游引物中的CATCATCATCATCATCAT。将gAd基因连接至pMD18-T (购买自TAKARA公司)，连接方法参照TAKARA公司产品说明书，转化至大肠杆菌ToplO (市购)，转化方法参照Tiangen公司产品说明书，得到 pMD18-T-gAcL实施例2 pNZ8048_gAd原核表达质粒的构建
将gAd基因通过限制性内切酶和连接酶插入至乳酸乳球菌表达载体中。具体操作是
Nco I和Sac I分别双酶切pMD18-T-gAd和pNZ8048原核表达质粒，凝胶回收。16°C连接过夜，再以常规化学转化法转化至克隆宿主大肠杆菌五coli MC1061，氯霉素抗性筛选， 挑10个阳性菌落，分别进行PCR扩增，使用引物P3、P4及前述反应程序和条件。再进行重组质粒的Afco I.Sac I双酶切鉴定，参阅附图1，附图1中，M代表DNA marker，1和2代表 pNZ8048-gAd Nco I和Sac I酶切产物，3代表没有经过酶切的pNZ8048_gAd质粒。附图1中所示的约443bp位置的条带即是pNZ8048_gAd经Afco I和Sac I双酶切的产物。符合预期结果的菌株编号为MC1061-gAd，送往上海英骏生物技术有限公司进行测序，结果在GenBank的Blast比对，与报道的完全一致，比对图见附图2所示。实施例3含有gAd基因的原核表达载体的重组微生物的制备
将鉴定正确的携有gAd表达质粒电击，参数设为2. 5kV，25aF, 400 Ω，转化至L. Lactis ΝΖ9000中。挑取单菌落接种到含氯霉素(5 μ g/ml)的GM17液体培养基中，30 °C下静置培养过夜。次日，该培养基中长出的单菌落中挑10个阳性菌落，分别进行PCR扩增，使用引物P3、 P4及前述反应程序和条件。再进行重组质粒的Afc0 l,Sac I双酶切鉴定，得到的DNA片段大小和实施例2 —致时即得到重组乳酸乳球菌NZ9000-gAd。所述菌株的镜检图片请见附图 10。实施例4 gAd基因的诱导表达及表达产物的纯化
将实施例3中得到的重组NZ9000-gAd阳性菌落，接种到含氯霉素(5 μ g/ml)的GM17液体培养基中，1 后按2% (体积百分比)的接种量接种到含氯霉素(5yg/ml)的GM17液体培养基中，30°C培养2. 后加入Nisin (乳酸链球菌素)溶液至其终浓度为10ng/ml，3(TC 下诱导证后收集菌体，13% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，证实有gAd 蛋白的表达，同时采用Ni2+-NTA柱亲和层析(购买自invitrogen公司)的方法纯化蛋白， 收集洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果参阅附图3，M代表蛋白marker，1代表未诱导菌体， 2代表lOng/mL Nisin诱导后菌体，3代表纯化后的gAd蛋白，附图3中所示经诱导后的 NZ9000-gAd在约17kD处有清晰的条带，同时可见该蛋白纯化效果较好。实施例5 gAd蛋白的抗血清的制备
选9周龄雄性BALB/c小鼠4只。将已作纯化处理的gAd蛋白作为抗原与等体积弗氏佐剂混合均勻后制成疫苗，采取腹腔多点注射的方式进行免疫。免疫后得到的抗血清用于 Western blotting 分析。实施例 6 gAd 蛋白的 Western blotting 分析
采用本发明方法表达的蛋白经SDS-PAGE分离后，转印至硝酸纤维素膜上，Western blotting测定目的蛋白免疫反应，第一抗体是鼠源Anti-His抗体和实施例5制备的鼠源抗gAd抗体，第二抗体是辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，实验结果参阅附图4，M代表蛋白marker，1代表第一抗体是鼠源Anti-His抗体的gAd蛋白的Wfestern blotting，2代表第一抗体是实施例5制备的鼠源抗gAd抗体的gAd蛋白的Wfestern blotting ；附图4中所示经诱导后的NZ9000-gAd在约17kD处有清晰的条带。实施例7 gAd蛋白对小鼠血清葡萄糖的影响
选9周龄雌性ICR小鼠8只，实验组和对照组各4只。已纯化的gAd蛋白再经0. 9%的生理盐水透析处理。小鼠实验前禁食3h，之后灌胃高糖高脂饲料(按体重1%给予)。高糖高脂饲料配方50%葡萄糖溶液和花生油体积比为1 :1。灌胃后开始计时，
0min，4只对照组小鼠尾静脉注射生理盐水溶液(剂量为2 mL/kg),
4只实验组小鼠尾静脉注射含gAd蛋白的生理盐水溶液(剂量为50 mg/kg,以蛋白含量计算)；
45min，重复注射步骤。105min，重复注射步骤。灌胃前各小鼠均取血，从灌胃后开始，每Ih取血一次，共4次，测定血清葡萄糖 (PGL)含量，具体操作参照试剂盒说明。结果见附图6，附图6中横坐标为时间，单位为小时(Time，h)，纵坐标为血清葡萄糖含量(PGL)，单位为mmol/L。与对照组比较，实验组小鼠PGL在池开始明显降低，在池后降低更明显，池和池的差异具有显著意义(P<0. 05)，这显示gAd蛋白具有加快糖代谢、降低PGL的活性。实施例8 gAd蛋白对蓝塘猪血清葡萄糖、血清游离脂肪酸、血清甘油三酯的影响选取50日龄，体重约15kg的蓝塘猪6头，实验组和对照组各3头。已纯化的gAd蛋白
再经0. 9%的生理盐水透析处理。各蓝塘猪灌胃50%葡萄糖溶液40mL。灌胃后开始计时，
Omin，对照组静脉注射生理盐水溶液(剂量为2 mL/头)，实验组静脉注射含gAd蛋白的生理盐水溶液(剂量为500 mg/头，以蛋白含量计算)； 45min，重复注射步骤。105min，重复注射步骤。灌胃前各蓝塘猪均取血，从灌胃后开始，每Ih取血一次，共4次，测定血清葡萄糖 (PGL)、血清游离脂肪酸(FFA)、血清甘油三酯(PTG)含量，具体操作参照试剂盒说明。实验结果见附图7、附图8和附图9。如附图7所示，与对照组比较，实验组蓝塘猪PGL在池开始明显降低，在池时两组差异具有极显著意义(p<0. 01)，在3h时两组差异具有显著意义(P<0. 05)，这表明gAd蛋白具有加快蓝塘猪血糖代谢、降低PGL的活性。如附图8所示，与对照组比较，实验组蓝塘猪FFA在池开始明显降低，在池和池时两组差异具有显著意义(P<0. 05)，这显示gAd蛋白具有降低蓝塘猪FFA的活性。如附图9所示，与对照组比较，实验组蓝塘猪PTG在池开始降低，在池时两组差异具有显著意义(P<0. 05)，这显示gAd蛋白具有降低蓝塘猪PTG的活性。
权利要求
1.一组用于扩增猪脂联素球状域的重组基因gAd的引物，其特征在于包括上游引物P3 和下游引物P4，分别具有SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。
2.应用权利要求1所述引物扩增得到的猪脂联素球状域的重组基因gAd，具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3.权利要求2所述猪脂联素球状域的重组基因gAd编码的蛋白，具有SEQID NO :2所示氨基酸序列。
4.一种权利要求2所述猪脂联素球状域的重组基因gAd的乳酸乳球菌原核表达载体， 具有SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列。
5.一种猪脂联素球状结构域蛋白gAd基因及其编码蛋白的表达方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据猪脂肪组织总RNA克隆得到Ad基因；(2)采用引物P3和P4，通过PCR扩增方法从步骤(1)所述Ad基因中克隆出gAd基因， 并在gAd基因的上游引入Afc0 I酶切位点和6个组氨酸，下游引入fee I酶切位点，制备得到gAd基因片段；(3)将步骤(2)所述gAd基因片段克隆至克隆宿主大肠杆菌MC1061中得到重组质粒，经重组质粒鉴定和扩增后，用该质粒电击转化表达宿主-乳酸乳球菌(Lactococcm lactis) NZ9000 ；(4)通过Nisin诱导，筛选可高效表达gAd蛋白的修饰型乳酸乳球菌株。
6.权利要求4所述乳酸乳球菌原核表达载体转化的乳酸乳球菌菌株。
全文摘要
本发明公开了猪脂联素球状结构域蛋白gAd基因及其编码的蛋白和应用。本发明以猪脂联素球状结构域(gAd)序列为基础，设计引物P3和P4，在gAd基因的5′端加上六个His标签，并将该基因片段克隆到克隆宿主大肠杆菌中，经重组质粒鉴定和扩增后，用该质粒电击转化表达宿主-乳酸乳球菌，并进一步筛选得到可高效表达gAd蛋白的修饰型乳酸乳球菌株，制备特异性抗gAd的抗血清，确定体外表达的gAd蛋白具有反应原性。本发明为制备一种富含猪脂联素球状结构域的乳酸菌微，通过重组乳酸乳球菌NZ9000表达脂联素调节猪脂肪代谢和脂肪沉积打下了重要基础。
文档编号C12N15/11GK102181437SQ20111004733
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者刘霭莎, 吴同山, 李岩, 王敬军, 胡文锋 申请人:东莞市畜牧科学研究所, 胡文锋