专利名称：枣树抗坏血酸过氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的应用。
背景技术：
抗坏血酸过氧化物酶(ascortate peroxidase, APX )，又称维生素C过氧化物酶， 存在于高等植物、真核藻类及某些蓝细菌中，在某些昆虫中也检测出APX活性。在高等植物中，抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)-谷胱甘肽(glutathione，GSH)循环对于清除活性氧具有极其重要的作用。其中抗坏血酸过氧化物酶(APX)是AsA -GSH循环中的关键酶。APX 参与活性氧清除的最大特点在于对底物AsA有极高的专一性，且能够在较低水平的AsA下发挥作用。对抗坏血酸过氧化物酶的功能研究表明，APX对提高植物的抗逆性起到了显著的作用。因此，克隆植物APX基因并通过转基因的方法来增强该基因的表达，对于提高植物抗逆性以及改良植物品种具有重要的现实意义。目前，已有多种植物的APX基因被克隆并应用于提高植物的抗逆性。1976年，Foyer和Hailiwell首先发现了以AsA为电子供体的一种过氧化物酶。 1980年，Nakano和Asada正式确定此酶为APX，存在于叶绿体的基质中。目前，不少研究者已在多种植物上进行了 APX各种同工酶基因的分子克隆，但多集中在草本植物中，如菠菜、豌豆、浮萍、棉花、黄瓜、蓖麻子、向日葵、茶叶、小麦、玉米、烟草、西葫芦等。由于木本植物遗传背景较复杂，至今仅苹果的APX基因和葡萄抗白粉病的APX基因被克隆。然而，对于中国古老的、重要的经济树种-枣树的APX基因的研究还没有相关报道，到目前为止，还未见有从枣树中分离出APX基因并应用于提高植物抗逆性的报道。枣树原产于我国黄河流域，是我国特有的经济林树种之一，枣树耐寒，抗旱，抵御各种外界不良因子的能力强，尤其是对于土壤瘠薄、气候干旱有很强的忍耐力，在晋西北、 太行山、陕北等黄土高原地区，枣树一般生长在土壤相当贫瘠、少雨干旱的丘陵山坡、高崖边等不良环境下，且都能正常生长结果。这种极其耐旱、耐瘠薄的特点显著优于其它农作物，因此枣树的抗逆性基因是非常宝贵的遗传资源，了解具有优良抗性的枣树的抗逆机制以及逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，可为充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的应用。本发明是采用如下技术方案实现的一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。由所述的一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 2 所示。一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的应用。本发明从壶瓶枣树(Zizyphus jujuba Mill. HUPING)的结果枝(即枣吊)，利用 CTAB法提取总RNA，根据mRNA纯化试剂盒的方法从提取到的总RNA中分离纯化mRNA，构建cDNA文库，测序后通过NCBI Blast分析与比对，从中筛选到一个cDNA序列为枣树抗坏血酸过氧化物酶基因的全序列，将其命名为^7 /沈(Zizyphus jujube Mill, ascorbate peroxidase)。生物信息学分析表明基因的cDNA序列全长为75!3bp，编码251个氨基酸，其中包含32个酸性氨基酸，20个碱性氨基酸，蛋白质的相对分子量为62. 5^(D，理论等电点为5. 10。根据枣树抗坏血酸过氧化物酶基因的核苷酸序列，设计合成引物，其上游引物 APXl的序列为5' -TGAATTCAGATGGGGAAGTGCTAC-3',包含^boTP I限制性酶切位点(即下划线部分)，三个保护碱基T和AG，以及枣树抗坏血酸过氧化物酶Z力/沈基因的起始密码子 ATG (即方框所示部分)；下游引物APX2的序列为5' -ATCCCGGGTAGCATCAGCAAATC-3'，包含 Sma I限制性酶切位点(即下划线部分)，三个保护碱基AT和T。通过PCR技术成功亚克隆出心4/沈基因的目的片段，将得到的心4/沈目的基因片段经限制性核酸内切酶feoT I和 Sma I修饰后连接到植物表达载体pES (K)-LNY上，经含卡那霉素的LB平板抗性筛选、PCR 鉴定、酶切鉴定、测序证明携带目的基因的植物表达载体PESi(K)-LNY- ZjAPX构建成功。通过冻融法将携带目的基因的植物表达载体pES (K)-LNY- ZjAPX转入根癌农杆菌LBA4404 的感受态细胞中，经含卡那霉素的YEB平板抗性筛选、PCR鉴定证明工程菌pES (K)-LNY-ZjAPX- L构建成功。农杆菌介导基因转化拟南芥，经含卡那霉素的1/2 MS培养基筛选获得含有目的基因ZjAPX的转基因拟南芥植株Ttl代，经PCR鉴定目的基因证实ZjAPX 成功转入拟南芥。用含有0. 1 M NaCl的1/2MS培养基处理转基因拟南芥，对转基因植株及其T1代进行耐盐性评价，观察其生长状况，发现转基因拟南芥在盐胁迫处理下长势和根系明显好于野生拟南芥。此外，为了深入研究枣树抗坏血酸过氧化物酶基因Z力/沈及其编码蛋白ZjAPX，本发明构建了重组原核表达载体pGEX-4T-2-ZjAPX，实现其在大肠杆菌BL21 (DE3)中的原核表达，为该基因编码蛋白的结构、功能、调控等方面研究提供一定的实验数据。本发明的有益效果在于首次分离出枣树抗坏血酸过氧化物酶基因^力/沈，该基因可作为目的基因转入植物，以提高植物的抗逆性，特别是耐盐性，对于改良植物品种具有重要的现实意义。对于具有优良抗性的枣树的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。
图1为ZjAPX与已知类基因的氨基酸系统进化树聚类分析； 图2为目的基因ZjAPX的PCR扩增结果图3为重组质粒pES (K)-LNY-ZjAPX的PCR鉴定图谱； 图4为工程菌pEZR(K) -LNY-ZjAPX-L的PCR鉴定图谱； 图5为转Z力/沈基因拟南芥的卡那抗性筛选平板；图6为转心4/沈基因拟南芥植株；
图7为转Z力/沈基因拟南芥植株的PCR检测结果图8为经0. 1 M NaCl处理30天的转基因拟南芥与野生型拟南芥；
图9为经0. 1 M NaCl处理40天的转基因拟南芥与野生型拟南芥；
图10为原核表达载体pGEX-4T-2-ZjAPX的PCR鉴定图谱；
图11为原核表达载体pGEX-4T-2-ZjAPX饱BernH I和Sma I双酶切鉴定图谱；
图12为pGEX-4T-2-ZjAPX-B经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳结果图。其中，图2、3、4、7、10、11 中的 M 为 DL 2000 Marker，条带依次为 2000bp、lOOObp、 750bp、500bp、250bp、IOObp。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步的阐述。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1 枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX的获得
春天采集壶瓶枣树(Ziziphus jujuba Mill. HUPING)长度约2mm的结果枝(即枣吊)， 利用CTAB法提取总RNA，根据mRNA纯化试剂盒(购自美国!Iomega，货号Z5200)方法从提取到的总RNA中分离纯化mRNA，利用cDNA文库构建试剂盒(购自美国Invitrogen，货号1拟48-039)构建cDNA文库。将文库cDNA与克隆载体pSPORTl连接，连接产物转化至 E. coli DH5a感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板于37°C培养过夜，蓝白斑筛选重组质粒，随机挑选部分阳性质粒，将经过酶切鉴定证明有插入片段的质粒，委托上海生工测序。将测序结果利用NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov/)在线分析软件进行Blast比对分析，结果表明其中的一个cDNA序列为枣树的抗坏血酸过氧化物酶同源基因全序列，将其命名为 ZjAPX (lizyphus J_ujube Millascorbate peroxidase)0 生物信息学分析结果表明么力/沈基因的cDNA序列全长为75!3bp，编码251个氨基酸，其中包含有32个酸性氨基酸，20个碱性氨基酸；用ProtParam计算蛋白质的相对分子量为62. 55 KD，理论等电点为 5. 10，不稳定指数为57. 06，属于不稳定蛋白；用TMHM-M-2. 0进行蛋白质序列的跨膜区分析表明此蛋白不是跨膜蛋白，属于膜外蛋白，连接至http //www. expasy. org/prosite进行编码序列的保守分析，表明该序列编码的蛋白质属于典型的植物亚铁血红素过氧化物酶家族蛋白，序列中包含一个过氧化物酶的活性部位“APimLRLaWHSA”和一个过氧化物酶亚铁血红素配体信号“DIVALSGGHTL” ；通过在NCBI数据库Blast X搜索进行序列同源性分析表明，该编码蛋白与目前已知的其它植物的抗坏血酸过氧化物酶APX具有极高的同源性， 与可可树APX、陆地棉APX的同源性为93%，与玉米APX的同源性为92%，与拟南芥APX的同源性为86% ；用DNAMar对其氨基酸序列与其它属种的抗坏血酸过氧化物酶APX构建进化树，如图1所示，11个来源相同物种的APX被聚为7个类群，枣(Ziziphus jujube)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)单独聚为一类，柑橘(Citrus maxima)、番薯(Ipomoea batatas) 聚为一jfl^L(Nicotiana tabacum)>5nM (Solanum lycopersicum) M^J一HPfI^ (Hevea brasiliensis)、云杉(Picea sitchensis)聚为一类，菠菜(Spinacia oleracea)、 玉米(Zea mays)聚为一类，同时又与陆地棉(Gossypium hirsutum)聚为一大类，该聚类分析结果还表明枣抗坏血酸过氧化物酶APX和其他物种的亲缘关系都较远，但其蛋白相似性极高。上述生物信息学分析包括核苷酸序列分析、氨基酸序列分析、序列相似性分析、进化树聚类分析均为本领域技术人员熟知的常规技术手段，通过多重比对分析证实本发明克隆得到的核苷酸序列即为枣树抗坏血酸过氧化物酶基因的序列，其编码的氨基酸序列即为其编码蛋白枣树抗坏血酸过氧化物酶的序列，而且该蛋白质功能被唯一确定。根据上述获得的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因的精确核苷酸序列设计引物并委托上海生工合成，用于APX基因的亚克隆。上游引物APXl的序列为 5' -TGAATTCAGATGGGGAAGTGCTAC-3'，包含feoT I限制性酶切位点(即下划线部分)，三个保护碱基T和AG，以及枣树抗坏血酸过氧化物酶Z力/沈基因的起始密码子ATG (即方框所示部分);下游引物APX2的序列为5' -ATCCCGGGTAGCATCAGCAAATC-3'，包含I限制性酶切位点(即下划线部分)，三个保护碱基AT和T。以克隆载体pSPORTl-ZjAPX携带的为模板，以APXl和APX2为引物，扩增获得含完整开放阅读框的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因。PCR反应体系为10XPCR buffer (含 Mg2+) 5μ1，dNTP 0. 5μ1，上下游引物(20pmol/L)各 2. 5μ1，rTaq 聚合酶 0. 8μ1，模板 DNA (5. 2μδ/μ1) 2μ1，灭菌超纯水36. 7μ1，总体积50μ1。Ρα 扩增条件为:95°C预变性5min，94°C 变性lmin、M°C退火lmin、72°C延伸2min共40个循环，最后72°C延伸5min。取5ml PCR 产物，1%琼脂糖凝胶电泳分析确认目的片段大小。按照DNA纯化试剂盒操作，纯化PCR产物。实施例2么力/沈基因植物表达载体的构建 1.实验材料
1. 1载体和菌株
植物表达载体pES (K)-LNY、大肠杆菌cWi)DH5a、携带基因的重组质粒 pSPORTl- ZjAPX均由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞与胚胎学研究室保存。1.2试剂和培养基
限制性内切酶I , Sma I , Hind 111、BamH I、DNA Ligation Kit、DL2000 DNA Marker、琼脂糖凝胶DNA Fragment Purification试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。卡那霉素(100mg/ml)
酚氯仿异戊醇(V V V= 25 24 1)
葡萄糖溶液(IM)
EDTA (0. 5M, ρΗ8· 0)
10%SDS(pH7. 2)
NaOH(2M)
Tris-HCl(1M, ρΗ8· 0) 醋酸钠(3Μ, ρΗ5· 2)
TE 溶液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ8· 0) 10ΧΤΒΕ电泳缓冲液 硼酸55. 2g/L
Tris108g/LEDTA (0. 5 M, LB培养基( 蛋白胨
，ρΗ8· 0) 40ml/L (固体培养基加琼脂15g/L)
10g/L 5g/L 10g/L
酵母提取物 NaCl
实验方法
2.1大肠杆菌(五cWi) DH5 α感受态细胞的制作
用CaCl2法制备大肠杆菌(五C07i)DH5a感受态细胞，具体方法见精编分子生物学实验指南。2. 2植物表达载体pE^ (K) -LNY和重组质粒pSP0RTl_Z jAPX的小量制备 PSPORTl-ZjAPX质粒的五coli DH5 α菌液用2ml的LB液体培养基加1 μ 1氨苄青霉素
(100mg/ml)接菌后37°C过夜培养所得。pES (K)-LNY质粒的五cWi DH5 α菌液用2ml的 LB液体培养基加1 μ 1卡那霉素(100mg/ml)接菌后37°C过夜培养所得。碱裂解法快速提取质粒pE^(K) -LNY和pSPORTl-ZjAPX，具体步骤见精编分子生物学实验指南。将干燥的质粒溶于20 μ 1 TE中，_20°C保存备用。2. 3目的基因ZjAPX序列的扩增
以克隆载体pSPORTl-ZjAPX为模板，用设计的特异性引物APXl与APX2进行PCR扩增以获得含完整开放阅读框的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因。首先利用梯度PCR技术设置不同的退火温度，找出最佳退火温度为M°C，然后按照下述条件作PCR扩增。PCR 扩增 ZjM/沈基因，反应体系为=IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+)，dNTP 0. 5μ1，上下游引物(20pmol/L)各2. 5μ1，rTaq聚合酶0. 8μ1，模板DNA (5. 2μβ/μ1) 2μ1，灭菌超纯水 36. 7μ1，总体积50μ1 ；扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性lmin、54°C退火Imin,72°C 延伸2min共40个循环，最后72°C延伸5min。2. 4目的基因ZjAPX片段和载体pEZR⑷-LNY片段的制备
PCR扩增获得的目的基因片段两端及载体pES (K)-LNY的多克隆位点都具有 EcoR I和I限制性酶切位点，利用I和I分别双酶切目的基因的PCR 产物及载体PES (K) -LNY,使其具有相同的粘性末端，为连接做好准备。目的基因ZjAPX的PCR产物的酶切反应体系 10XT buffer5μ1
0. 1% BSA5μ1
EcoR I μ
Sma I μ
PCR 产物10μ1
S. D. W28μ1
总体积50μ1
PCR产物的体积依据其浓度而定，最少酶切1 2 Pg的目的基因片段，加超纯水至总体积为50 μ 。载体pE^ (K) -LNY的酶切反应体系IOXT buffer5μ1
0. 1% BSA5μ1
EcoR I μ
Sma I μ
载体5μ1
S. D. W33μ1
总体积50μ1
酶切后分别取5ml双酶切产物，1. 0%琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认片段大小与预期相吻合。按照琼脂糖凝胶DNA Fragment Purification试剂盒说明进行操作，纯化经双酶切后的目的基因片段和载体片段。2. 5酶切产物的连接
用T4 DNA连接酶将纯化后的pES (K)-LNY载体与基因片段进行连接。将载体 pEZR(K) -LNY的DNA片段与目的基因ZjAPX的DNA片段混合制备成体积为5 μ 1左右的DNA 溶液(载体DNA和目的基因DNA的摩尔数比一般为1 :5)，向上述DNA溶液中加入等体积的 DNA Ligation Kit中的Solution I，充分混勻。连接反应体系总体积为10 μ 1左右，16°C 反应过夜。2. 6连接产物的转化
将连接产物加入到ΙΟΟμΙ的大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，轻轻混勻，冰上放置30min。 放入预加温到42°C的循环水浴中热休克90s，快速将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却3 5min。加400 μ 1的LB培养基，将EP管转移到37°C的摇床上，温浴40min使细菌复苏，复苏期应温和地摇动细胞(转速低于225r/min)。取适当体积的转化菌液转移到含卡那霉素的 LB平板，涂勻。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C静置培养过夜。2. 7转化产物的鉴定 (I)PCR鉴定
待转化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取转化单菌落至50μ1超纯水中，沸水浴5min使菌裂解。取 μ 裂解产物作为模板进行PCR阳性鉴定， 其反应体系为10XPCR buffer 1. 5μ1 (含 Mg2+)，dNTP 0. 2μ1，上下游引物(20pmol/L)各 0. 5Pl，rTaq聚合酶0. μ ，模板DNA(2. 6μβ/μ1) μ1，加灭菌超纯水11. 2μ1至总体积为 μ ； 扩增条件同前。将PCR鉴定为阳性的转化菌划线培养。(2)酶切鉴定
将PCR鉴定为阳性的转化菌用碱裂减法提取质粒DNA后，用历·/^ III称BamH I对重组质粒pE^ (K) -LNY-ZjAPX进行双酶切鉴定。重组质粒pEZR(K) -LNY-ZjAPX的Hind III和BamH I双酶切反应体系 10XK buffer μ
Hind III0. 5μ1
BamH I0. 5μ1
重组质粒 μ
S. D. W7μ1总体积ιομ
琼脂糖凝胶电泳酶切反应液，验证酶切片段的大小，保存携带目的片段的阳性菌落，并将阳性菌株送往上海生工测序鉴定。3. 1 ZjAPX cDNA 的扩增
利用设计的特异性上下游引物APXl和APX2进行PCR扩增，产物在1. 0%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后在紫外灯下观测到一条约750bp的条带，如图2所示，与所设计的扩增目的片段大小吻合。图中M :DL2000 DNA Marker ；1 :PCR产物。目的基因片段和载体片段的制备
将目的基因枣树PCR产物和pES (K)-LNY质粒分别用I和5 I进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，纯化目的基因片段与载体片段，用于连接。重组质粒的鉴定
从含有卡那霉素的LB平板上挑取阳性单菌落进行PCR鉴定，如图3所示，图中M DL2000 DNA Marker ；1、2、3、4 阳性克隆PCR产物，大小为750bp左右，与预期结果相符，初步推断重组质粒构建成功，琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒的大小约为12.41Λ。测序结果表明阳性转化菌的质粒确实含有目的片段，且读码框正确，重组质粒PESi(K)-LNY-ZjAPX构建成功。实施例3 农杆菌介导Z力/沈基因转化拟南芥
1.实验材料 1.1植物材料
野生型拟南芥种子由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞与胚胎学研究室提供，培养基质购自山西省农业科学院园艺作物研究所。1.2载体和菌株
植物表达载体pES (K)-LNY-ZjAPX、根癌农杆菌LBA4404均由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞与胚胎学研究室保存。1. 3试剂和培养基
卡那霉素购自上海生工，YEB、1/2MS培养基中所用试剂均购自天津天大化工。YEB 培养基
蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏lg/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0. 5g/L。注固体培养基需加终浓度为1. 0%的琼脂粉。1/2 MS 培养基
按照配制MS培养基的方法来配制1/2 MS培养基，大量元素、微量元素、有机元素、铁盐的量各减半，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L。2.实验方法
2.1拟南芥的培养
将拟南芥种子先在95%乙醇浸泡30 60s ；再转入2. 65%次氯酸钠灭菌5min，其间上下颠倒洗，5000rpm离心^iin ；灭菌水洗三次；然后将种子悬浮于0. 1%的琼脂粉溶胶中；用枪头吸取悬浮液将种子点播于1/2 MS固体培养基上，封口 ；4°C黑暗春化2d后，将拟南芥种子在22°C，1 / 光周期条件下进行培养；当拟南芥长出2片真叶时，移栽到营养基质中继
续培养。
2. 2根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制作
制备根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的具体步骤见精编分子生物学实验指南。2. 3 工程菌 pEZR (K) -LNY-ZjAPX-L 的构建及筛选
通过冻融法将构建成功的重组质粒载体pESUK) -LNY-ZjAPX转入农杆菌LBA4404，然后提取阳性克隆的质粒DNA，并通过PCR鉴定重组质粒载体是否转入农杆菌。从培养的转化有重组质粒pESUK)-LNY-ZjAPX的筛选平板上随机挑选生长良好的若干单菌落，各取二分之一菌落至50μ1超纯水中，沸水浴5min使菌裂解，取 μ 作为模板进行PCR鉴定。将鉴定正确的阳性工程菌重新划线培养保存以备用。工程菌pEZR (K) -LNY-ZjAPX-L 的培养
挑选鉴定正确的阳性克隆于IOml YEB液体培养基(含终浓度为50 μ g/ml的卡那霉素)过夜培养，6000rpm离心5min收集菌体，用培养基悬浮菌体至OD6tltl值为0. 8左右，用于转化拟南芥植株。2. 5农杆菌侵染拟南芥
当拟南芥植株形成花蕾时，即可用于农杆菌转化。将含有农杆菌的转化介质倒入离心管，将拟南芥植株的花蕾部分浸入转化介质3 5 s后，把浸染过的植株放到塑料盘中，暗处放置过夜。在正常条件下，继续培养转化后的拟南芥植株。当拟南芥的角果枯黄、欲开裂时，收获种子，此为Ttl代种子。
2. 6转Z力基因拟南芥的筛选
将消毒的转基因拟南芥植株的Ttl代种子播种于1/2 MS筛选培养基(含终浓度为 50 μ g/ml的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后置于22°C，l^i/ai光周期条件下培养。转化成功的拟南芥种子长出来的幼苗生长正常，未转化成功的幼苗叶子发黄，生长缓慢。当生长正常的拟南芥长出2片真叶时，移栽到培养基质中继续培养至角果枯黄、欲开裂，收取T1代种子。2.7转Z力/沈基因拟南芥的胁迫处理
将T1代种子的拟南芥播种，移栽到基质中，在16h/ !光周期下培养，并适时浇水，培养至角果枯黄、欲开裂，收取T2代种子；并采取T1叶片提取DNA，用PCR方法进行检测。将野生型和T2代种子同时播种在含有0. 1 M NaCl的1/2 MS培养基上，观察其生长情况。3.实验结果
3. 1农杆菌的转化结果
将构建好的植物表达载体PE^ (K) -LNY-ZjAPX转入农杆菌LBA4404，在YEB固体培养基 (含终浓度为50 μ g/ml的卡那霉素)上筛选转化子，从筛选平板上随机挑选生长良好的若干单菌落，进行PCR检测，如图4所示，与预期结果相同，表明重组植物表达载体已成功转入农杆菌LBA4404。转Z力/沈基因拟南芥植株的获得及抗性鉴定
按上述方法侵染拟南芥后，将消毒的转基因拟南芥的Ttl代种子播种于1/2 MS筛选培养基(含终浓度为50 μ g/ml的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，l^i/ai光周期下培养。观察发现，转化成功的拟南芥幼苗具有抗卡那霉素的特性，生长正常，且有真叶形成；而未转化成功的拟南芥幼苗不具有抗卡那霉素，植株矮小，叶子发黄，也没有真叶形成，如图5 所示。
将具有抗性的转基因拟南芥植株移入培养基质，在16h / 8h光周期下培养，其生长状况良好，如图6所示，培养至植株角果枯黄、欲开裂时，收获其种子。PCR检测结果如图7所示，证明2、3、4、6、8号均为转ZjM/沈株系。3.3转Z力/沈基因拟南芥植株的耐盐性实验
选取转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子作为对照进行NaCl胁迫处理，处理条件为=NaCl处理为1/2MS培养基中加入0. IM NaCl，对照处理为1/2MS培养基，观察其生长状况。实验结果表明，盐胁迫处理30天的转基因拟南芥均比野生型拟南芥长势好，表现出明显的耐盐性，如图8所示；处理40天后，转基因拟南芥的植株明显比野生型植株生长健壮， 根系发达，如图9所示。实施例4 ,ZjAPX的原核表达 1.实验材料
1. 1载体和菌株
枣树抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA序列从本课题组构建的壶瓶枣(Z/ziMM jujuba Mill. HUPING)结果枝cDNA文库中筛选获得，克隆在pSPORTl载体上；克隆载体pSPORTl、 原核表达载体PGEX-4T-2、大肠杆菌BL21 (DE3)均由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞与胚胎学研究室保存。1. 2试剂和仪器
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒QIAquick 购自QIAGEN公司；限制性内切酶·// I、 Sma I、T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；卡那霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司；IPTG、丙烯酰胺等化学试剂购自上海生物技术工程有限公司；电泳仪、恒温金属浴、恒温培养箱、照相机等试验设备均由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞与胚胎学研究室提供。2.实验方法
2.1 PCR引物的设计与合成
_根据枣树抗坏血酸过氧化物酶cDNA序列，选择其中编码216个氨基酸的681bp核苷酸序列，设计特异性引物，上游引物^添加/^ ^ I酶切位点，下游引物K2添加5 I酶切位点，引物序列如下
Kl 5' -ATGGATCCATGCTACGCCTTGCATG-3'； K2 5'-ATCCCGGGTTAAGCATCAGCAAATC-3'； 以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2.2目的基因序列的扩增
以克隆载体PSPORTl (携带目的片段)为模板，用设计的特异性引物Kl与K2进行PCR 扩增。首先利用梯度PCR技术设置不同的温度，找出最佳退火温度为58°C。PCR反应体系 % =IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+)，dNTP μ ，上下游引物 Kl 与 Κ2 (20 pmol/L)各 μ ， rTaq聚合酶0. 3μ1，模板DNA (5. 2 μδ/μ1) μ1，灭菌超纯水40. 7μ1，总体积50μ1 ；扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s、58°C退火30s、72°C延伸Imin共30个循环，最后72°C 延伸lOmin。2. 3重组原核表达载体的构建
获得PCR产物后，经琼脂糖电泳验证片段大小，然后用I和5 I双酶切目的基因片段及PGEX-4T-2载体，再用QIAquick 凝胶回收盒对双酶切产物进行纯化。在T4 DNA连接酶的作用下，将目的基因定向克隆到pGEX-4T-2载体的及 /7 I和5 I酶切位点， 然后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中。2. 4重组原核表达载体的鉴定
根据pGEX-4T-2载体携带有氨苄青霉素抗性基因的特征，将转化有重组质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞涂在含有氨苄青霉素的平板上，挑取抗性单菌落进行PCR扩增鉴定，反应条件和反应程序同前。琼脂糖凝胶电泳选择阳性菌落，提取质粒。用限制性内切酶 BeimH LSmei I对重组质粒进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性菌株送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，验证重组质粒中目的基因的插入方向及读码框的正确性。2. 5原核表达
2. 5. 1大肠杆菌BL21 (DE3)感受态的制备
用CaCl2法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体方法见精编分子生物学实验指南。分装成100μ 1或200μ 1小份，液氮中冰冻，-70°C贮存备用。2. 5. 2质粒提取
碱裂减法提取连接成功的原核表达质粒。2. 5. 3 转化
将上述原核表达质粒转入其表达载体的大肠杆菌BL21(DE!3)感受态中，具体步骤为 (1)取-70°C冻存或者新鲜制备的100μ 1的感受态细胞转移到无菌的微量离心管中， 每管加原核表达质粒DNA (体积< 10 μ 1，DNA ( 50ng)，轻轻旋转以混勻内容物，在冰中放置 30 min。(2)将离心管放到预加温到42°C的循环水浴中的试管架上，放置90 s，不要摇动试管。(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 anin。(4)每离心管加400 μ 1 LB液体培养基，用水浴将培养基加温到37°C，然后将离心管转移到37°C摇床上，温育45min使细菌复苏。(5)取部分已转化的感受态细胞涂布在含终浓度为50μ g/ml的氨苄青霉素的LB 平板培养基上。(6)倒置平皿，于37°C培养，12 16h后可出现菌落。2. 5. 4诱导表达
(1)取一定容量的锥形瓶，分别加入5ml LB液体培养基和2. 5 μ 1氨苄青霉素(终浓度为50μ g /ml)，分别从前一天摇好的菌液中取50μ 1接入锥形瓶中，并以空质粒作为对照， 37°C摇床振摇至0D_值为0. 5。(2)取与上述锥形瓶等量的试管，分别加入菌液anl，每个试管中加20 μ 1 IPTG (IPTG终浓度为ImM)诱导，37°C摇床振摇4h。(3)将菌液倒入2. 0的管中，12000 rpm离心3min。(4)去上清液，加上样buffer 200 μ 1，加β -巯基乙醇20 μ 1，重悬沉淀后煮沸 IOmin0(5 )放入冰盒冷却，40C保存，SDS-PAGE凝胶电泳备用。
2.6 SDS-PAGE 凝胶电泳
(1)配置30%丙烯酰胺分离胶，向装配好的两块玻璃板之间灌制分离胶，至距离玻璃板上端3cm左右处，用ddH20封胶以使胶面水平。(2) 20min左右待分离胶凝固后倒去上层ddH20，用滤纸将残留水分吸干。(3)配制5%的浓缩胶，灌注至距离玻璃板上端2mm左右处。(4)插入梳子，待浓缩胶凝固后拔出梳子。(5)各取20 μ 1样品点样，蛋白Marker上样5-8 μ L·(6)低压70V电泳至样品到达分离胶内。(7)高压150V电泳至距离底端Icm处。(8)固定液固定1. ^！。(9)染色液染色池。( 10)置于摇床脱色过夜。3.实验结果
3. 1 ZjAPX cDNA 的扩增
利用设计的特异性上下游引物Kl与K2进行PCR扩增后，产物在1. 0%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后在紫外灯下观测到一条在750bp和500bp之间，靠近750bp的条带，与所设计的扩增目的片段大小吻合。3. 2重组原核表达载体的构建
利用特异性引物Kl和K2进行PCR扩增，将产物和PGEX-4T-2质粒用及^/7 I和5 I 双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物约为750bp，pGEX-4T-2片段约为4. 9kb,与预期结果相符。分别纯化目的基因片段与载体片段，进行连接。3. 3重组原核表达质粒鉴定
将连接产物涂于含有氨苄青霉素的平板培养基上，37 °C过夜培养后挑取阳性单菌落进行PCR鉴定，结果如图10所示；对证明有目的片段阳性菌落提取质粒，进行限制性内切酶 BamH I和I双酶切鉴定，结果如图11所示，双酶切片段约750bp，与预期结果相符，初步推断重组质粒构建成功，且重组质粒的大小约为5. 6kb左右。测序结果表明该转化菌的质粒中确实含有目的片段，且读码框正确，重组原核表达质粒构建成功。3. 4诱导原核表达
工程菌pGEX-4T-2-ZjAPX-B，在37°C条件下，经IPTG诱导4h后取样，SDS-PAGE电泳结果如图12所示，观察到含有质粒pGEX-4T-2-ZjAPX的大肠杆菌BL21 (DE3)在IPTG诱导的条件下，与对照空菌体PGEX-4T-2-B相比在大约50KD处产生一条特异性蛋白条带，GST大小约为^KD,目的蛋白ZjAPX大小为23. 76KD，故融合蛋白大小约为49. 76KD，表明诱导枣树抗坏血酸过氧化物酶表达成功。
权利要求
1.一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因，其特征在于具有如序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
2.由权利要求1所述的一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因编码的蛋白，其特征在于 具有如序列表SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树抗坏血酸过氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的应用。枣树抗坏血酸过氧化物酶基因，其核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本发明获得枣树抗坏血酸过氧化物酶基因，构建植物表达载体，成功转入拟南芥植株，对其进行耐盐性评价，证实其可用于提高植物的耐盐性。此外，本发明构建的原核表达载体，实现其在大肠杆菌的诱导表达。本发明首次分离出枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX，该基因可作为目的基因转入植物，以提高植物的抗逆性，特别是耐盐性，对于改良植物品种具有指导意义，为充分利用枣树的优良抗性基因以提高植物的抗逆性提供实验数据和奠定理论基础。
文档编号C12N15/53GK102161996SQ201110047249
公开日2011年8月24日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者孟玉平, 曹秋芬, 王振华, 郝子琪 申请人:山西省农业科学院生物技术研究中心, 洪洞县维民生生物科技有限公司