专利名称：一种双加氧酶基因及其克隆表达和对芘和苯并[a]芘的转化的制作方法
技术领域：
本发明属于环境有机污染物微生物修复技术领域，具体涉及为一种双加氧酶基因及其克隆表达和对芘和苯并[a]芘的转化。
背景技术：
多环芳烃是一类在环境中广泛存在的有机污染物，其中许多种类都具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。而高环多环芳烃因其具有更低的水溶性和更强的吸附性，使之在环境中生物有效性不高，从而导致持久性残留。在自然环境中，多环芳烃的主要消除方式是微生物降解，包括真菌和细菌的作用。真菌对多环芳烃的降解并不彻底，往往只是将其转化成一水溶性更高的产物。相对真菌而言，细菌则具有可以将多环芳烃彻底矿化成二氧化碳的能力，因此更具修复潜能。细菌矿化多环芳烃是一个由多种酶类共同参与的生物化学代谢过程。其中涉及到双加氧、脱氢、开环双加氧等多种生化反应。在这个矿化途径中，由双加氧酶所催化的双加氧步骤是多环芳烃矿化过程中的第一步，也是多环芳烃矿化中的限速步骤。因此多环芳烃双加氧效率控制着整个多环芳烃的矿化过程。因此，获取对高环多环芳烃进行双加氧作用的双加氧酶具有重要的理论研究和实际应用的意义。
发明内容
本发明的技术目的在于克隆可转化高环多环芳烃的双加氧酶基因，将该酶进行表达并利用工程菌验证其对芘和苯并k]芘的转化作用。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案在于
一、一种双加氧酶基因，其特征在于该酶基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；其对应的氨基酸序列由SEQ ID NO :2所示的小亚基序列和SEQ ID NO :3所示的大亚基序列组成。二、本发明所述双加氧酶基因的克隆与表达，具体包括以下步骤
(1)以芘降解菌分支杆菌Ico如Cteri sp. NJS-P基因组为模板，根据现有技术的双加氧酶保守序列，设计简并引物，通过PCR技术扩增出包含双加氧酶基因完整阅读框的基因片段，进行TA克隆，进行测序；再设计引物，从包含双加氧酶基因完整阅读框的TA载体中扩增出双加氧酶基因完整阅读框，得到如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其对应的氨基酸序列由SEQ ID NO 2所示的小亚基序列和SEQ ID NO 3所示的大亚基序列组成；
(2)将含有双加氧酶基因完整阅读框的TA载体进行酶切，与同样酶切的pETMb表达载体进行连接，构建得双加氧酶表达载体；然后再将质粒/7^5-1 和提供电子载体蛋白的PBRCD共转化于大肠杆菌BL21 (DE3)，构建基因工程菌，在培养基中诱导表达出 PdoAB可溶性蛋白，即为本发明所述的双加氧酶。三、本发明所述的工程菌对芘和苯并[a]芘的转化。
具体方法为
1)离心收集经过蛋白诱导的工程菌，用约1/10体积的M9培养基清洗并重新悬浮菌
体；
2)按10%的量将重悬菌体接入硅油-水双相体系中，其转化体系组分包括25mL M9培养基(含有氨苄青霉素和庆大霉素)和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；
3)培养2天。本发明的有益效果在于
本发明所涉及的转化方法为全细胞转化体系，免除了酶的提取步骤；而且本发明获取的双加氧酶不仅能够转化四环多环芳烃-芘，而且还能转化五环的苯并[a]芘，在高环多环芳烃的基因工程菌修复研究方面具有一定研究价值。
图1为本发明所述的的双加氧酶对芘的转化质谱检测图。图2为本发明所述的双加氧酶对苯并[a]芘的转化质谱检测图。
具体实施例方式实施例中所涉及基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社)
实施例1
本实施例说明本发明的双加氧酶基因序列的获得方法。以芘降解菌分支杆菌Ico如Cteri^B sp. NJS-P (该菌株于2011年1月10日保存于中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，编号为CCTCC NO =M 2011011)基因组为模板， 根据已报道的双加氧酶(NCBI数据库http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)保守序列，设计简并引物，通过PCR技术扩增出包含双加氧酶基因完整阅读框的基因片段，进行TA克隆，进行测序；再设计引物，从包含双加氧酶基因完整阅读框的TA载体中扩增出双加氧酶基因完整阅读框，具体操作如下
1)提取分支杆菌NJS-P基因组DNA。2)设计简并引物召-F和召-R，用高保真酶I^rimerSTAR HS (Takara)通过 PCR技术扩增出《/ ^基因完整阅读框。引物序列为
pdoAB-Y.. 5’ -TAGGATCCAGAGGAGTTCGRTKTGATGAAC-3’ pdoAB-R\ 5’ -TAGAATTCCAGAAKCKTCATCRAGCAC-3’。3)对 PCR 扩增产物进行加 A 处理，用Simple Cloning Kit (Transgen) 进行TA克隆，测序。4)再设计简并引物位召-F和位召-R，上下游引物两端分别引入AfcoI和汉3 HI酶切位点，用高保真酶I^rimerSTAR HS (Takara)从步骤3中所获取的TA克隆中扩增出双加氧酶基因完整阅读框，得到如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，可知该双加氧酶基因具有分别如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的大小亚基的氨基酸序列。其中，引物序列为
Ex-pdoAB-Y·. 5’ - GTATCm^GCAACGCGGTCGCGGTGGAC-3 ‘Ex-pdoAB-R\ 5’ - ACGGATCCYCATCGAGCACCGCCGCGGAACTG-3，。实施例2
本实施例说明在实施例1的基础上对双加氧酶进行表达的方法。将含有双加氧酶基因完整阅读框的TA载体进行酶切，与同样酶切的pETMb表达载体(Novagen)进行连接，构建得双加氧酶表达载体然后再将质粒/7^5-1 和提供电子载体蛋白的PBRCD (由Dr. Jouanneau惠赠)共转化于大肠杆菌BL21 (DE3)(购自北京全式金公司)，构建基因工程菌，在培养基中诱导表达出PdoAB可溶性蛋白，具体操作如下
1)提取实施例1中第4步获取的TA克隆质粒和表达载体质粒pETMb。2)用AfcoI和汉3 HI (Fermentas)对两质粒进行酶切，回收所需DNA片段。3)按DNA:载体=1:3的比例，用DNA连接酶(Takara)将酶切片段过夜连接，构建得细菌漆酶表达载体/ WS-15b。4)将质粒/7^3-1 与和pBRCD共转化至表达宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)，得到
基因工程菌。5)用含氨苄青霉素和庆大霉素的双抗Luria-Bertani (LB)平板过夜活化工程菌， 挑取单菌落于100 mL LB液体培养基(含抗生素)中，37 °C培养至OD6tltl= 0.6 0.8，加入 100 mg/L IPTG，于25 过夜诱导PdoAB酶蛋白表达。实施例3
本实施例说明所述的工程菌对芘和苯并[a]芘的转化方法。4)离心收集经过蛋白诱导的工程菌，用约1/10体积的M9培养基清洗并重新悬浮菌体；
5)按10%的量将重悬菌体接入硅油-水双相体系中，其转化体系组分包括25mL M9培养基(含有氨苄青霉素和庆大霉素)和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；
6)培养2天。在产物经过硅烷衍生化之后，采用GC/MS进行产物分析，具体操作如下 1)转化完毕，转化液用等体积乙酸乙酯，分两次进行萃取。2)合并萃取液，用旋转蒸发法(30°C)将有机溶剂蒸干，加入1 mL正己烷溶解。溶解液过0.22 μ m滤膜，再用氮气吹干，最终用100 yL正己烷溶解。3)加入100 yL TMS硅烷化试剂(supelco)，于60°C 1小时进行硅烷衍生化。4)硅烷化产物用气相-质谱联用进行产物分析，用离子选择方式进行检测(见附图1和2)。芘的转化产物选择离子为四0 (单羟基产物)和380 (二氢二醇产物);苯并[a] 芘的转化产物选择离子为340 (单羟基产物)。
权利要求
1.一种双加氧酶基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；其对应的氨基酸序列由SEQ ID NO :2所示的小亚基序列和SEQ ID NO :3所示的大亚基序列组成。
2.根据权利要求1所述的双加氧酶基因的克隆与表达，其特征在于具体包括以下步骤(1)以芘降解菌分支杆菌Ico如cteri sp. NJS-P基因组为模板，根据现有技术的双加氧酶保守序列，设计简并引物，通过PCR技术扩增出包含双加氧酶基因完整阅读框的基因片段，进行TA克隆，进行测序；再设计引物，从包含双加氧酶基因完整阅读框的TA载体中扩增出双加氧酶基因完整阅读框；(2)将含有双加氧酶基因完整阅读框的TA载体进行酶切，与同样酶切的pETMb表达载体进行连接，构建得双加氧酶表达载体；然后再将质粒/7^5-1 和提供电子载体蛋白的PBRCD共转化于大肠杆菌BL21 (DE3)，构建基因工程菌，在培养基中诱导表达出 PdoAB可溶性蛋白，即为双加氧酶蛋白。
3.根据权利要求2所述的表达双加氧酶的工程菌对芘和苯并[a]芘的转化，其特征在于所述的具体方法为(1)离心收集经过蛋白诱导的工程菌，用1/10体积的M9培养基清洗并重新悬浮菌体；(2)按10%的量将重悬菌体接入硅油-水双相体系中，其转化体系组分包括25mL含有氨苄青霉素和庆大霉素的M9培养基和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；(3)培养2天。
全文摘要
本发明涉及一种双加氧酶基因及其克隆表达和工程菌对芘和苯并[a]芘的转化。该酶不仅能够转化四环多环芳烃-芘，而且还能转化五环的苯并[a]芘，在高环多环芳烃的基因工程菌修复研究方面具有一定研究价值。
文档编号C12N15/70GK102174543SQ20111004702
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者张晶, 曾军, 朱弘, 李烜桢, 林先贵 申请人:中国科学院南京土壤研究所