专利名称：丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检测领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。
背景技术：
丙型肝炎呈世界性分布，人群普遍易感。丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV) 感染率为0. 10%，平均为3%，全球约1. 7 2亿人感染HCV。我国一般人群HCV感染率为3%，约3800万感染者。HCV感染者70 80%发展成慢性丙型肝炎，慢性丙型肝炎的表现亦轻重不等，约20 30%可逐渐发展至肝硬化，肝硬化患者中，每年约 4%可发展为肝癌。抗HCV酶联免疫试剂是目前诊断丙肝的主要手段，普遍应用于检查血源和血液制品，此类试剂已被广泛应用，但由于HCV病毒的分离尚不成功，目前所制备的抗原均为人工合成，其特异性方面仍然存在不足，主要是在低危人群中发现大量的不确定结果；对于某些免疫球蛋白水平高的患者，也可能出现假阳性。另外，感染后至抗体出现，在第二代试剂间隔为9 10周，第三代为6 8周，因此对于HCV感染的早期检测还需加强。试纸条免疫印迹试验(RIBA)现已有第二代试剂，灵敏度和特异性有所提高，主要用于ELISA检测可疑者，能帮助区别特异性HCV抗体和非特异性反应，是一确证试验。HCV抗体检测方法虽然有了改进，但仍然存在其局限性“窗口期”平均长达70天，不利于早期诊断；而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍长时间存在，有报道说该时间可长达9年，无法准确判别抗-HCV阳性者是否有病毒血症。血清中的HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志。所以检测血清HCV RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”。HCV感染者血清病毒滴度通常很低，常规分子杂交技术难以检出HCV RNA。近年发展的逆转录PCR (RT-PCR)，巢式PCR (nested PCR)技术将HCV-RNA 检测的特异性和灵敏度大大提高，而荧光PCR的出现又将此检测技术推向了另一台阶。通过荧光PCR的方法直接检测HCV RNA,大大提高HCV感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”缩短平均56 60天，对“窗口期”感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一。另检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。治疗过程中，HCV RNA的动态监测同时还可以为临床上的用药剂量、时间等提供依据。目前，常用的RNA类标本的提取和纯化方法比较如下
酚-氯仿提取柱提取原理液相萃取硅胶吸附1、标本加裂解液加去抑制剂等混匀，热裂解钟10分钟。2、高速低温离心10-15分钟2、加入无水乙醇沉淀核酸3、取上清加异丙醇3、整体移入柱，离心甩干或负压抽干4、高速低温离心10-15分钟4、加入洗涤液1，离心甩干或负压抽干5、弃上清，酒精洗涤5、加入洗涤液2，离心甩干或负压抽干6、高速低温离心5-10分钟6、加入洗脱液，高速离心1分钟7、弃上清，晾干7、取洗脱下来液体上机检测8、加水，水浴，取样上机检测优点最经典提取方法核酸得率高，无需高速离心不足操作繁琐，设备和人员操作要求高。低需频繁更换离心管，得到产物为标本中全部核病毒载量标本检出率低。酸，特异性差。国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测HCV-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的HCV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒具有一定的优点，但是，存在很多不足之处1)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；2)无法有效去除复杂样本(如高血脂、乳汁等样本)中的PCR抑制物，体系中一般没有阳性内对照(即内标)，无法预防假阴性；3)检测灵敏度低，约在500IU/ml左右；定量范围窄，一般在 1. 00E+03IU/ml 1. 00E+07IU/ml之间，对于临床高值(大于5. 00E+07IU/ml)和低值(小于1.00E+03IU/ml)的样本无法准确定量；4)没有荧光归一化校正系统。国外，性能优异的同类试剂是 Roche (罗氏)公司的“Roche AmpliPrep-Cobas TaqMan HCV !"est”诊断系统， 使用Iml的样本量，应用磁珠法原理采用全自动化的仪器进行RNA提取，然后自动加样进行 RNA的荧光PCR扩增，实现临床样本中HCV-RNA的定量检测。该诊断系统具有自动化程度高、操作简便、检测灵敏度低(大于30IU/ml)等优点，但是样本需求量(Iml)太大，而且全自动化操作的试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取纯化的核酸质量好、产量高，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，这些优点及特点使其提取核酸的方法有替代所有其它方法的发展趋势。然而目前所用试剂基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。
发明内容
本发明的目的提供一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，可检测出HCV所有已知6个基因型，但不能检测出非HCV病原体，解决现有技术中丙型肝炎检测试剂盒特异性差的技术问题。本发明是通过以下技术方案实现一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和 DNA聚合酶，其中用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No. 1序列。优选地，用于扩增靶多核苷酸上游引物具有SEQ No. 2序列，下游引物具有SEQNo. 3序列。该试剂盒进一步包括内标，内标是由具有SEQ No. 4序列的DNA插入到pUC 18T载体而构成的重组体。优选地，用于检测内标的探针具有SEQ No. 5序列。该试剂盒进一步包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物，用于扩增内标的上游引物具有SEQ No. 6序列，用于扩增内标的下游引物具有SEQ No. 7序列。该试剂盒进一步包括RNA提取溶液I 含有十二烷基硫酸钠0. 2 1. 0g/100ml,曲拉通1. 0 4. 0ml/100ml，异硫氰酸胍 0. 2mol/L 1. Omol/L 和磁珠 100 400 μ g/ml ；RNA提取溶液II 含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸0. 1 0. 3mol/L和氯化钠0. 1 0. 3mol/L ；RNA 提取溶液 II 的 pH 值为 6. 5士0. 2 ；RNA提取溶液III 含有曲拉通0. 1 1. 0ml/100ml和氯化钠0. 1 0. 3mmol/L ；
RNA提取溶液IV 矿物油。优选地，DNA聚合酶是Tth DNA聚合酶。该述试剂盒进一步包括ROX参比染料，ROX参比染料的浓度为40 200mmol/L。本发明试剂盒因为采用用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No. 1序列，具有很好的特异性，应用本发明的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出所有HCV的六个基因型。进一步地，因为本发明试剂盒加入内标，可以有效监控假阴性的存在；加入ROX参比染料起到明显的归一化效果。进一步地，本试剂盒对HCV-RNA的提取方法进行优化，选择吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，只需一步洗涤步骤，不需要洗脱核酸，可以直接用于检测，且获得的核酸纯度高，大大提高了检测灵敏度、准确度。
图IA示出了本发明提供的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中定量参考品 A (5. 00E+06IU/ml)、Β(5· 00E+05IU/ml)、C(5. 00E+04IU/ml)禾Π D (5. 00E+03IU/ml)的扩增曲线图；图IB示出了本发明提供的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中定量分析的标准曲线图；图2A示出了特异性实验中6个样本(包括HCV 6个基因型)扩增的结果图；图2B示出了特异性实验中4例HCV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等样本的扩增曲线图；图3A示出了荧光归一化实验中对同样的12份样本，PCR体系中加入参比荧光 (ROX)的扩增结果图；图;3B示出了荧光归一化实验中对同样的12份样本，PCR体系中不加入参比荧光 (ROX)的扩增结果图；图4示出了临床样本的检测中10个临床阴性标本的扩增曲线图；图5示出了临床样本的检测中10个临床阳性标本的扩增曲线图；图6示出了临床样本的检测中浓度为5. OXIO1IUAiI 1. 0X108IU/ml的8个梯度样本的扩增曲线图；图7示出了临床样本的检测中浓度为5. OxiO1iuaii 1. 0x108iu/ml的8个梯度样本的标准曲线图；图8a示出了临床样本的检测中50iu/ml样本各重复8次的扩增曲线图；图8b示出了临床样本的检测中25iu/ml样本各重复8次的扩增曲线图；图8c示出了临床样本的检测中10iu/ml样本各重复8次的扩增曲线图。
具体实施例方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本发明的一种具体实施方式
中，提供了一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括以下组分(1)用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，源于丙肝病毒最保守的5’UTR区，具有SEQ No. 1序列(Invitrogen公司合成)SEQ No. 1 :5，-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3，优选地，SEQ No. 1羧基端用FAM标记，羟基端用BHQl猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用6-FAM、TET、J0E、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、 BHQ2、BHQ3等猝灭基团。(2)用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F和下游引物HCV-R，源于丙肝病毒最保守的5，UTR区，上游引物HCV-F具有SEQ No. 2序列，下游引物HCV-R具有SEQ No. 3序列 (Invitrogen 公司合成)SEQ No. 2:5' -GCGGAACCGGTGAGTACAC-3‘SEQ No. 3:5' -CTTTCGCGACCCAAC ACTACT-3‘(3) DNA聚合酶及附带的PCR反应液；(4)脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dGTP和dTTP (均购自Promega公司)；根据本发明提供的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出HCV的六个基因型。优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括rna提取溶液i 含有十二烷基硫酸钠0. 2 1. 0g/100ml,曲拉通1. 0 4. 0ml/100ml，异硫氰酸胍 0. 2mol/L 1. Omol/L，磁珠 100 400 μ g/ml ；RNA提取溶液II 含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸100 300mmol/L，氯化钠100 30(toimol/L，RNA 提取溶液 II 的 pH 值为 6. 5士0. 2 ；RNA提取溶液III 含有曲拉通0. 1 1. 0ml/100ml，氯化钠100 300mmol/L ；RNA提取溶液IV 矿物油；本试剂盒所采用的核酸提取液，能够有效去除复杂样本中的pcr抑制物，适合于血清、血浆、乳汁等样本的rna提取和pcr检测。优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括内标(阳性内对照)本发明采用的阳性对照品为插入一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的pUC18T载体的重组体，即质粒， 浓度为1. 00E+03copies/ml 1. 00E+06copies/ml，作为PCR扩增体系中的内标，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性，97碱基对的序列SEQ No. 4如下所示 (Invitrogen 公司合成)SEQ No. 4 5 ’ -CTAGCTGGATGTGTCTGCGTTTTTTTATATCTTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCATCTTAGCTCT TCTATGTTG AACTGTTGTCCTCTCCTGAGCC-3’ ；用于内标检测的探针IC-P，具有SEQNo. 5序列(Invitrogen公司合成)SEQ No. 5 5' -TTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCA-3，；优选地，SEQ No. 5羧基端用HEX标记，羟基端用DABCYL猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，SEQNo. 5还可以选用不同于SEQNo. 1的荧光素标记，如ΤΕΤ、J0E、FAM等， 配合选用BHQ1、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。优选地，针对97碱基对序列设计内标的非竞争性上游引物IC-F和下游引物IC-R， 上游引物IC-F具有SEQNo. 6序列，下游引物IC-R具有SEQNo. 7序列(Invitrogen公司合成)SEQ No. 6:5' -CTAGCTGGATGTGTCTGCGTTT-3‘；SEQ No. 7:5' -GGCTCAGGAGAGGACAACAGTT-3‘；优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括参比染料，ROX参比染料(购自Roche公司)或其他适用于荧光定量PCR的参比染料。加入ROX参比染料起到明显的归一化效果， 对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。优选地，DNA聚合酶及PCR缓冲液是Tth DNA聚合酶及其附带的5 XPCR反应缓冲液(购自Roche公司)。优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括RT-PCR增强剂150mmol/L醋酸锰；优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括丙型肝炎病毒定量参考品来源于经HCV RNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的HCV强阳性血清，以HCV阴性血清稀释而来，该丙型肝炎病毒定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为 1. 00 5. 00E+06IU/ml (A)、1. 00 5. 00E+05IU/ml (B)、1. 00 5. 00E+04IU/ml (C)、 1. 00 5. 00E+03IU/ml (D)；优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括丙型肝炎病毒阳性对照来源于经HCV RNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的HCV强阳性血清，以HCV阴性血清稀释而来，其浓度为1. 00 5. 00E+02IU/ml ；以及丙型肝炎病毒阴性对照不含有乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的灭活阴性血清。将本发明丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒用于检测血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度的操作步骤是1.试剂准备DPCR反应液的配制包含5 XPCR反应缓冲液，0. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸， 40mmol/L 200mmol/L ROX参比染料，0. 2 μ mol/L 0. 4 μ mol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0. 2 μ mol/L 0. 4 μ mol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0. 1 μ mol/L 0.2 μ mol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0. 05ymol/L 0. 2ymol/L用于检测内标的探针IC-P，lU/y 1 5U/y 1 Tth DNA聚合酶；2)按比例(提取试剂I 200 μ 1 Iml/人份+HCV内标0. 4 μ 1/人份)取相应量的提取试剂I及HCV内标，充分混勻成提取试剂I-mix，瞬时离心后备用。3)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A D的量，按比例(PCR反应液49 μ 1/人份+增强剂1 μ 1/人份)取相应量的HCV PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混勻成PCR-mix，瞬时离心后备用。2. RNA提取操作1)裂解病毒每管加入200μ 1 Iml RNA提取溶液I_mix，然后加入100 μ 1 Iml待测样本(血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混勻10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；2)磁珠吸附核酸每管加入50 μ 1 400 μ 1 RNA提取溶液II，震荡混勻10秒钟后，室温静置10 30分钟；3)去除杂质瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2 5分钟后缓慢将溶液吸出；4)洗涤每管加入400 μ 1 Iml RNA提取溶液III和100 μ 1 500 μ 1 RNA提取溶液IV，震荡混勻3 7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；幻2 5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1 3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。6)每管加入50 μ 1 PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至PCR反应管中， 羔卜替羔
mi I .目 rm. ο3.荧光PCR反应1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。2)荧光检测通道选择选择FAM通道(Iteportere FAM, Quencher None)检测 HCV ；选择 HEX 或 VIC 通道(Reporter:VIC, QuencherNone)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为 R0X。3)荧光定量PCR反应条件为
步骤温度时间循环数1预变性和酶激活95 0C1-5分钟12逆转录60 0C10-30分钟13cDNA预变性95 0C1-5分钟14变性95 0C5-15 秒45-50退火、延伸，荧光采集55~60°C30-40 秒5仪器冷却25 0C10-30 秒14.结果分析反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct (即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈S 型，有Ct值且定值结果彡25IU/ml，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示 (Undet)或无定值结果显示，可以判为阴性。特异性试验采用本发明提供的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒对HCV六个基因型(1 6) 标准品、四例HCV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)已知样本进行检测，考查本试剂盒的特异性。各试剂配方以及操作过程如下所示本发明的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分(I)RNA提取溶液I 含有十二烷基硫酸钠0. 2g/100ml,曲拉通1. 0ml/100ml，异硫氰酸胍 0. 2mol/L,磁珠 100 μ g/ml ；(2)RNA提取溶液II 含有4_羟乙基哌嗪乙磺酸lOOmmol/L，氯化钠lOOmmol/L， RNA提取溶液II的pH值为6. 3 ；
(3) RNA 提取溶液 III 含有曲拉通 0. lml/100ml，氯化钠 100mmol/L ；(4) RNA提取溶液IV 矿物油；(5)内标(阳性内对照)本发明提供的内标，浓度为1. 00E+03copies/ml ；(6) Tth DNA聚合酶及其附带的5 X PCR反应缓冲液；(7) ROX 参比染料；(8)本发明提供的用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，羧基端用FAM标记，羟基端用BHQl猝灭基团修饰；；(9)本发明提供的用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F和下游引物HCV-R ；(10)本发明提供的用于内标检测的探针IC-P，羧基端用HEX标记，羟基端用 DABCYL猝灭基团修饰；(11)本发明提供的针对97碱基对序列设计内标的非竞争性上游引物IC-F和下游引物IC-R ；(12) RT-PCR 增强剂150mmol/L 醋酸锰；(13)本发明提供的丙型肝炎病毒定量参考品，浓度分别为1.00E+06IU/ml(A)、 1. 00E+05IU/ml(B)、1. 00E+04IU/ml(C)、1. 00E+03IU/ml(D)；(14)脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dGTP和dTTP ；(15)本发明提供的丙型肝炎病毒阳性对照，其浓度为1. 00E+02IU/ml。(16)本发明提供的丙型肝炎病毒阴性对照。操作步骤1.试剂准备1)PCR反应液的配置包含5 X PCR反应缓冲液10μ 1，0. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/L 200mmol/L ROX溶液，0. 2 μ mol/L 0. 4 μ mol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0. 2 μ mol/L 0. 4 μ mol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0. 1 μ mol/L 0.2 μ mol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R， 0.05 μ mol/L 0.2 μ mol/L用于检测内标的探针IC-P，IU/μ 1 Tth DNA聚合酶；2)按比例(提取试剂I 200 μ 1/人份+HCV内标0. 4 μ 1/人份)取相应量的提取试剂I及HCV内标，充分混勻成提取试剂I-mix，瞬时离心后备用。3)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A D的量，按比例(PCR反应液49 μ 1/人份+增强剂1 μ 1/人份)取相应量的HCV PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混勻成PCR-mix，瞬时离心后备用。2. RNA提取操作1)裂解病毒每管加入200 μ 1 RNA提取溶液Ι-mix，然后加入100 μ 1待测样本 (血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混勻10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；2)磁珠吸附核酸每管加入50 μ 1 RNA提取溶液II，震荡混勻10秒钟后，室温静置10分钟；3)去除杂质瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2分钟后缓慢将溶液吸出；4)洗涤每管加入400 μ 1 RNA提取溶液III和100 μ 1 RNA提取溶液IV，震荡混勻3秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；5)2分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。6)每管加入50μ1 PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至PCR反应管中，
盖上管盖。3.荧光PCR反应1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。2)荧光检测通道选择选择FAM通道(Reportere FAM, Quencher None)检测 HCV ；选择 HEX 或 VIC 通道(Reporter:VIC, QuencherNone)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为 R0X。3)荧光定量PCR反应条件为
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，所述用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No. 1序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增靶多核苷酸上游引物具有SEQNo. 2序列，下游引物具有SEQ No. 3序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括内标，所述内标是由具有SEQ No. 4序列的DNA插入到pUC18T载体而构成的重组体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于检测内标的探针，所述用于检测内标的探针具有SEQ No. 5序列。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物，所述用于扩增内标的上游引物具有SEQ No. 6序列，所述用于扩增的内标下游引物具有SEQ No. 7序列。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括RNA提取溶液I 含有十二烷基硫酸钠0. 2 1. 0g/100ml,曲拉通1. O 4. 0ml/100ml, 异硫氰酸胍0. 2mol/L 1. Omol/L和磁珠100 400tg/ml ；RNA提取溶液II 含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸0. 1 0. 3mol/L和氯化钠0. 1 0. 3mol/ L ；所述RNA提取溶液II的pH值为6. 5士0.2;RNA提取溶液III 含有曲拉通0. 1 1. Oml/lOOml和氯化钠0. 1 0. 3mmol/L ；RNA提取溶液IV 矿物油。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶是TthDNA聚合酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括 ROX参比染料，所述ROX参比染料的浓度为40 200mmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中，用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。本发明试剂盒因为采用用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列，具有很好的特异性，应用本发明的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度进行快速、准确测定，能够检测出所有HCV的六个基因型。
文档编号C12R1/93GK102154510SQ20111004692
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者戴立忠 申请人:湖南圣湘生物科技有限公司