一种制备漆酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域。更具体地涉及利用一株虎皮香燕（Lentinus tigrinus)液体深层发酵生产漆酶的方法。
【背景技术】
[0002] 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜 蓝蛋白属铜蓝氧化酶（blue copper oxidases)家族中的同一小族。漆酶按其来源可以分 为漆树漆酶（rhus laccase)和真菌漆酶（fungal laccase)两大类，植物漆酶与木质素的 生物合成密切相关，真菌漆酶具有多种生理生化功能，如形态发生，真菌与植物寄主相互作 用，应激防御以及木质素降解等。据统计漆酶的催化底物多达250多种，主要有酚类、芳胺、 羧酸、金属有机化合物以及一些留类激素和生物色素。由于作用底物广泛，漆酶在食品工 业、废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、有机合成、木材加工、免疫检测等诸多领域有 广泛应用。
[0003] 己经发现了有多种产漆酶的侧耳类真菌，如糙皮侧耳、刺芹侧耳、环柄侧耳等， 但漆酶酶活普遍不高。发明专利申请CN200910083514. 7 "一种漆酶及其制备方法与 专用生产菌株"，其生产菌株为血红密孔菌，漆酶发酵酶活为300U/mL;发明专利申请 CN101942421B"一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法"，漆酶发酵酶活为500U/mL;发明专利申请 CN200810198678.X"一种产漆酶的灵芝菌株"，漆酶发酵酶活为8620U/mL，是目前酶活较高 的菌株。上述发明的菌种不属于食用菌。
[0004] 虎皮香菇，属伞菌目，侧耳科，香菇属，生于阔叶树腐木上，易于进行固体栽培和液 体深层发酵培养，具有生长迅速，产物产量高，是一种食用真菌。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用食用菌制备漆酶的方法。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] -种制备漆酶的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)将接种虎皮香燕（Lentinustigrinus)保藏编号：CGMCCNo.8301的斜面培养 基的固体菌种接种至液体种子培养基，在25~35°C，摇床150~200rpm，培养2~5天，制 备种子液；
[0009] (2)将种子液按体积比为2%~14%的接种量接种至发酵培养基，所述发酵培养基 是在500mL三角瓶中的装液量为100~250mL，在25~35°C、摇床150~350rpm培养7~ 20天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；
[0010] (3)将菌丝体发酵液于lOOOOXg离心lOmin，取上清液即为漆酶粗酶液。
[0011]步骤（1)优选为：将接种虎皮香燕（Lentinustigrinus)保藏编号：CGMCC No. 8301的斜面培养基的固体菌种接种至液体种子培养基，在28~32°C，摇床150~ 200rpm，培养3~4天，制备种子液。
[0012]步骤（2)优选为：将种子液按体积比为6%~14%的接种量接种至发酵培养基，所 述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为150~200mL，在28~32°C，摇床150~ 200rpm，培养9~15天，得到虎皮香燕菌丝体发酵液。
[0013] 斜面培养基优选为：葡萄糖5~40g/L，蛋白胨2. 5~20g/L，酵母粉0? 5~5g/L， 琼脂10~20g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳10~ 200g，水1L，煮沸30~60min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。
[0014] 液体种子培养基为：玉米粉10~50g/L、豆柏粉5~35g/L、a-淀粉酶20~80U/ L、KH2P040. 5 ~6g/L、MgS04 ? 7H200. 2 ~5g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0015] 液体种子培养基较好的是：玉米粉25~35g/L、豆柏粉10~20g/L、a-淀粉酶 30 ~65U/L、KH2P042 ~4g/L、MgS04 *7H201 ~2g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0016] 发酵培养基为：碳源20~100g/L，氮源5~60g/L，KH2P041~5g/L， MgS04 ? 7H200. 25 ~3g/L，CuS04 ? 5H200. 5 ~2mmol/L，其余为水。
[0017] 碳源选自以下一种或几种：葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糊精、麦芽糖或玉米粉。
[0018] 氮源选自以下一种或几种：酵母浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、低温黄豆饼粉、磷酸二氢 铵或硫酸铵。
[0019] 最优的发酵培养基为：果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氢铵lg/ L，KH2P042g/L，MgS04 ? 7H200. 25g/L，CuS04 ? 5H201mmol/L，其余为水。
[0020] 本发明利用一种食用菌虎皮香燕（Lentinustigrinus)保藏编号：CGMCC No. 8301，通过液体深层发酵高产食品级的漆酶。本发明虎皮香菇发酵液中漆酶的酶活高， 发酵液中漆酶酶活最高可达462. 59U/mL。且漆酶反应的适应条件较广，在温度40~60°C 范围内活性稳定，在40°C时酶活最高，最适pH为4. 4~4. 8,酶活均在90%以上，最适pH为 4. 6。
【附图说明】
[0021] 图1为虎皮香菇平板培养照片。
[0022] 图2为虎皮香菇菌丝体照片。
[0023] 图3为纯化后的漆酶电泳图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0025] 试验中所用的主要试剂和仪器如下：玉米粉--梅河口市兴达米业有限责任公 司；低温黄豆饼粉--山东万得福实业集团有限公司；淀粉酶--北京索莱宝科技有 限公司；果糖--河北华旭制药有限责任公司；胰蛋白胨--北京双旋微生物培养基制 品厂；2, 2'-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸钠）（ABTS)--SIGMA公司；紫外 可见分光光度计--TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；低温恒温循环器-- ILB-008-01型，施都凯仪器设备(上海）有限公司。
[0026] 本发明所用食用菌虎皮香菇（Lentinustigrinus)于2013年10月9日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，并已存活，建议的分类命名为虎皮香燕（Lentinustigrinus), 保藏编号CGMCCNo. 8301，虎皮香菇平板培养照片见图1，虎皮香菇菌丝体照片见图2。
[0027] 实施例1
[0028] 斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，琼脂15g/L，其余为花生壳 浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳l〇〇g，水1L，煮沸45min，过滤，滤液即 是花生壳浸出液。
[0029] 实施例2
[0030] 斜面培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉3g/L，琼脂15g/L，其余为花生壳 浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳l〇g，水1L，煮沸60min，过滤，滤液即是 花生壳浸出液。
[0031] 实施例3
[0032] 斜面培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨2. 5g/L，酵母粉5g/L，琼脂15g/L，其余为花生 壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳l〇〇g，水1L，煮沸50min，过滤，滤液 即是花生壳浸出液。
[0033] 实施例4
[0034] 斜面培养基：葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉0. 5g/L，琼脂20g/L，其余为花生 壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳150g，水1L，煮沸40min，过滤，滤液 即是花生壳浸出液。
[0035] 实施例5
[0036] 斜面培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉2g/L，琼脂10g/L，其余为花生壳 浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳200g，水1L，煮沸30min，过滤，滤液即 是花生壳浸出液。
[0037] 实施例6
[0038] 液体种子培养基：玉米粉30g/L、豆柏粉15g/L、a-淀粉酶45U/L、KH2P043g/L、 MgS04 ? 7H201. 5g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0039] 实施例7
[0040] 液体种子培养基：玉米粉25g/L、豆柏粉20g/L、a-淀粉酶30U/L、KH2P044g/L、MgS04 ? 7H201g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0041] 实施例8
[0042] 液体种子培养基：玉米粉35g/L、豆柏粉10g/L、a-淀粉酶65U/L、KH2P042g/L、 MgS04 ? 7H202g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0043] 实施例9
[0044] 液体种子培养基：玉米粉10g/L、豆柏粉35g/L、a-淀粉酶20U/L、KH2P046g/L、 MgS04 ? 7H200. 2g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0045] 实施例10
[0046] 液体种子培养基：玉米粉50g/L、豆柏粉5g/L、a-淀粉酶80U/L、KH2P040. 5g/L、 MgS04 ? 7H205g/L，其余为水，pH自然，0?IMPa灭菌 25min。
[0047] 实施例11
[0048] 发酵培养基：果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氢铵lg/L， KH2P042g/L，MgS04 ? 7H200. 25g/L，CuS04 ? 5H201mmol/L，其余为水。
[0049] 实施例12
[0050] 发酵培养基为：葡萄糖60g/L，蛋白胨8g/