Nk细胞的体外制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及一种NK细胞的体外制备方法，具体的说，涉及一 种从胚胎干细胞诱导分化制备成NK细胞的方法。
【背景技术】
[0002] NK细胞（naturalkillercells)又称自然杀伤细胞，是一类CD56+，CD3-的淋巴 细胞，是机体内天然免疫系统的效应细胞，它无需抗原预先致敏即可识别肿瘤及病毒感染 的细胞。它位于机体防御体系的第一道防线，同时它又能通过早期分泌多种细胞因子和趋 化因子来调节获得性免疫应答，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁，在肿瘤免疫、清 除非己细胞等方面发挥重要作用。
[0003] 现阶段临床上获得NK细胞疗法是采用体外培养的方法，把患者自身外周血中的 NK细胞进行扩增，使细胞数目扩大数千倍且细胞毒活性极大增强，再回输患者的体内。取自 患者自身的细胞首先限制了其产业化生产的可能性；另外由于外周血中NK细胞的含量低， 仅占外周血淋巴细胞总数的5%-10%，细胞数量有限，且目前尚缺乏有效的高纯度的体外扩 增体系，所以在很大程度上限制了NK细胞的临床应用，这种传统的NK细胞制备方法并不 是理想的选择。首先，它主要用于一对一的个体化治疗方法，只能在医院床边开展；第二，这 种治疗方法自然杀伤性细胞诱导的时间太长，至少需要6周，对于晚期肿瘤病人，尤其是手 术后放疗、化疗的病人，在细胞制备完成或细胞回输之前可能就已经去世；第三，一对一的 治疗，即每一个人要做一全套细胞诱导扩增培养的过程，在实验室管理方面，室内质量控制 很难，室间质量控制更难；第四，很多病人本身的NK细胞就是缺陷的，回输治疗效果有限。
[0004] 目前虽然有大量的研宄集中在寻找不同来源的CD34+细胞向NK细胞诱导分化的 最佳体系，但是尚未有一种方法能够简便、高效地得到高纯度、高数量、杀伤能力强的NK细 胞。
[0005] 随着科研的发展和进步，利用干细胞诱导分化为NK细胞成为可能，是一个极具吸 引力的选择，具有广阔的应用前景。胚胎干细胞就是其中的佼佼者，胚胎干细胞具有高度的 未分化性以及很强的增殖能力，能够分化为人体组织的各种细胞。目前，人胚胎干细胞已被 成功地分化为成熟和功能的子集的每一个胚层，包括细胞的造血系统。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中存在的问题和不足，提供一种由胚胎干细胞诱导 培养NK细胞的体外制备方法，以解决现有技术中NK细胞来源不足、疗效限制和难以产业化 生产的问题，具有广阔的应用前景。
[0007] 本发明同时提供了NK细胞的体外制备的诱导培养体系，简化纯化和鉴定细胞产 物的程序，避免病毒污染造成的危害。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种NK细胞的体外制备方法，具体 包括以下步骤： (1)胚胎干细胞的体外培养 采用无饲养层的胚胎干细胞培养体系，胚胎干细胞复苏后在明胶预处理过的培养皿中 贴壁培养，培养2-3d后，消化液消化传代。
[0009] (2)诱导胚胎干细胞向造血细胞分化 采用基质细胞共培养与细胞因子诱导相结合的方法，胚胎干细胞用2mL分化培养液重 悬后，接种于已经预先铺有OP9细胞的6孔板中，放入37°C、5%C02、95%饱和湿度的培养箱 培养，并添加细胞因子Flt3配体（FL)，白细胞介素-15 (IL-15)，白细胞介素-6 (IL-6)，白 细胞介素-7 (IL-7)，Kit配体（KL)。培养1天，胚胎干细胞形成悬浮的细胞集落，把这些细 胞集落转移到超低吸附培养皿中，并添加上述细胞因子，2-3天后收集细胞。
[0010] (3)免疫磁珠分离纯化⑶34+细胞 由于造血干细胞主要分布于⑶34+细胞中，因此采用免疫磁珠法纯化⑶34 +造血干细 胞，并用流式细胞仪检测所分离得到的CD34+细胞纯度。
[0011] (4)CD34+细胞的扩大培养 将纯化后的⑶34+细胞以1.0X104cells/mL密度接种无血清培养基中，置于37°C、 5%C02、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液。培养液中均含细胞因子：干细胞 因子（SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、血小板生成素（TPO)、红细胞生成素（EPO)和白细胞介 素-6 (IL-6)。培养2-3周收集细胞。
[0012] (5)CD34+细胞诱导分化NK细胞 CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子组合①：干细胞 因子（SCF)，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)和Flt3配体（FL)，37°C、5%CO# 95%湿度的培养箱培养，24小时后，将细胞转移至新的细胞培养瓶继续培养，添加细胞因子 组合②：白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-12 (IL-12)、白细胞介素-15 (IL-15)、单克隆 抗体anti-CD3(anti-CD3)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-7(IL-7)，放置于37°C， 5%C02、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞，每三天换液一次，并补充细胞因子组合②， 诱导4周后流式检测CD3TD56+NK细胞。
[0013] (6)NK细胞杀伤活性的测定。
[0014] 进一步的，所述的步骤（1)胚胎干细胞的体外培养过程中采用无饲养层的DMEM培 养体系，所述的胚胎干细胞的培养液组成是：DMEM培养基，加入20%Knock0ut血清替代物、 0.ImM2-巯基乙醇、100yg/mLL-谷氨酰胺，1%的非必需氨基酸，1000U/mL的白细胞因子 LIF，0.ImMMEM〇
[0015] 进一步的，所述的步骤（2)诱导胚胎干细胞向造血细胞分化中采用基质细胞共培 养与细胞因子诱导相结合的方法，所用的胚胎干细胞分化培养液组成是：a-MEM培养基， 体积分数10%Knock0ut血清替代品，100ymol/L硫代甘油（MTG);所用的诱导因子组合为： 5ng/mLFL+ 20ng/mLIL-15 + 20ng/mLIL-6 + 10ng/mLIL-7 +lOng/mLKL。本发明 采用无血清造血干细胞的培养基，避免异源基因的污染。
[0016] 进一步的，所述的步骤（4)为获得足够多的纯净的⑶34+细胞，采用先免疫磁珠分 离纯化⑶34+细胞，后扩大培养⑶34+细胞的方法，并且培养过程中采用无血清培养基：MDM 培养基，5X1O_5M0 -巯基乙醇、1%BSA、0. 01mg/mL胰岛素、0? 7mg/mL转铁蛋白、2X10_6M胆 固醇、20mmol/100mLL-谷氨酰胺；扩增培养中所用的因子组合为50ng/mLSCF+ 20ng/mL IL-3 + 4U/mLTPO+ 3U/mLEPO+ 20ng/mLIL-6。
[0017] 进一步的，所述的步骤（5) CD34+细胞诱导分化NK细胞中采用细胞因子多次诱导 的方法来获取足够的NK细胞，所用的细胞因子组合①为：30ng/mL SCF+30ng/mL GM-CSF +5ng/mL FL;所用的细胞因子组合②为：10ng/mL IL-2+20ng/mL IL-12+20ng/mL IL-15 + lOng/mL anti_CD3 + 20ng IL-4 + lOng/mL IL_7〇
[0018] 本发明的制备方法具备以下优点： (1)解决NK细胞来源不足的问题，为NK细胞治疗提供了新的思路。
[0019] (2)采用无血清培养简化了纯化和鉴定细胞产物的程序，避免了病毒污染造成的 危害。
[0020] (3)在胚胎干细胞定向造血细胞分化阶段，首创添加了诱导因子5ng/mLFL、20ng/ mLIL_15、20ng/mLIL_6、10ng/mLIL_7、10ng/mLKL，显著缩短了诱导培养时间，提高了造 血细胞的活率。
[0021] (4)在造血细胞定向分化为NK细胞阶段创造性地进行了二次诱导，在接种阶段 添加了诱导因子组合①：30ng/mLSCF、30ng/mLGM-CSF、5ng/mLFL，培养两天以后，添加诱 导因子组合②：10ng/mLIL-2、20ng/mLIL-12、20ng/mLIL-15、10ng/mLanti-CD3、20ng IL-4、lOng/mLIL-7。经过该方法所获得的NK细胞活性高，能达到97%以上，且NK细胞的 肿瘤杀伤效果显著。
【附图说明】
[0022] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1是NK细胞的体外制备方法的技术方案实施流程图。
[0023] 具体实施方法 下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。参照图1 :NK细胞的体外制备方法 的技术方案实施流程图所示，本发明【具体实施方式】如下： 实施例1胚胎干细胞的体外培养： 1.将液氮中保存的胚胎干细胞与37 °C水浴，快速溶化，细胞悬液由固态变为液态。
[0024]2.将上述细胞悬液接种于明胶预处理过的培养皿中，放置于37°C，5%C02、95%饱和 湿度的培养箱培养，培养2-3d，细胞融合度达到85%-90%后，用消化液消化传代。
[0025] 3.按照1:3-1:5传代到新的培养皿中，补足培养液继续培养。
[0026] 4.每2-3d用消化液消化传代。
[0027] 实施例2诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化 1.使用前1天将冻存的0P9细胞，以1. 5X105cells/mL细胞浓度接种到预铺有明胶 的6孔培养板中。
[0028] 2.第2天将胚胎干细胞离心，