专利名称：一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物农药研究领域，特别涉及一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用。
背景技术：
化学农药因其能快速有效地抑制或杀死植物病原菌，所以人们长期以来主要依靠化学农药防治植物病害，也使得病原菌的抗药性显著提高，从而导致化学农药的防治效果降低甚至失效。在实际生产中，应结合不同的手段进行综合防控，减少对化学农药的依赖程度，延缓化学农药的抗药性产生。农用抗生素是一类高效、广谱、无污染的农药。据统计世界上67%的抗生素产品都来自微生物，而其中2/3又来自放线菌。由于海洋放线菌在生理和遗传背景上的特殊性，必定能产生结构新颖的代谢物质，因此海洋放线菌代谢物的研究越来越受到人们的重视。
发明内容
本发明的首要目的旨在探寻生物农药的新来源，提供一种抗生链霉菌。本发明的另一目的在于提供上述抗生链霉菌的活性产物的制备方法。本发明的再一目的在于提供通过上述制备方法得到的抗生链霉菌的活性产物及其应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抗生链霉菌(Sti^ptomyces antibioticu), 名禾尔为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticu subsp. antialbonostocticus)H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(湖北武汉大学内)，保藏编号为CCTCC M 2010364 ；所述的抗生链霉菌H74-18是从近海海泥和红树林分离的2000多种海洋放线菌中筛选出的具有对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、黄瓜疫霉菌(Wiytophthora cucumisativus) > 黄瓜炭 Si 病(Colletorichum cucumisativus)禾口辣椒炭 Iil 病菌 (Colletotrichum capsici)具有较好抑制活性的菌株。所述的抗生链霉菌H74-18具有以下特征①高氏一号培养基上基内菌丝和气生菌丝丰茂，基丝不断裂，孢子丝着生在气生菌丝上，孢子丝柔曲，孢子光滑呈圆柱形，成熟的孢子链孢子个数在8个左右，没有观察到孢囊、孢核等结构；②在天门冬素、马铃薯块、高氏合成一号、淀粉琼脂、克氏等5种固体培养基上均生长良好，形成丰富的气生菌丝和基内菌丝，气丝灰白至暗灰色，基丝黄至棕红色，但在察氏、淀粉铵培养基上只有少量白色气丝生长，色素在高氏合成一号固体培养基、马铃薯块上有部分扩散，在天门冬素、淀粉琼脂上不扩散，在其它培养基不产色素；③生理生化为能使明胶液化，能水解淀粉，在纤维素上不生长，牛奶不胨化，也不液化，不产黑色素，能利用葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、棉子糖和肌醇；④全细胞水解液含L，L-DAP(左旋)、甘氨酸，丙氨酸和天门冬氨酸，含有核糖和葡萄糖，无特征性糖(糖型C)，细胞壁组份属I型；⑤16S rDNA序列结果在GeneBank中进行同源性比较，发现菌株H74-18与Sti^ptomyces antibioticus EF063450处于同一分枝，亲缘关系最近，同源性高达99. 9%，但其在培养特征、生理生化特征上与Sti^ptomyces antibioticus有较大差异，据其采集地点为新会崖门大桥，故鉴定菌株H74-18为抗生链霉菌崖门亚禾中(Streptomyces antibioticus subsp. yamensis)。一种抗霉素A18 (1)，从上述抗生链霉菌H74-18中分离得到，分子式为C28H41N2O9， 分子量为M9. 3，结构式如式I所示
权利要求
1.一种抗生链霉菌(Sti^ptomyces antibioticu)，其特征在于名称为抗生链霉菌H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010364。
2.一种抗霉素AlS(I)，从权利要求1所述的抗生链霉菌H74-18中分离得到，其特征在于分子式为C28H41N2O9，分子量为M9. 3，结构式如式I所示
3.权利要求2所述的抗霉素AlS(I)的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)抗生链霉菌H74-18的活化；(2)抗生链霉菌H74-18的发酵，具体为①种子液的制备将步骤(1)活化的抗生链霉菌H74-18接种到培养基中下 160 180rpm摇瓶培养48h，得到种子液；②发酵液的制备将种子液以体积百分比10%的接种量接至30L发酵罐中培养，初始 pH值7. 0 7. 2，发酵温度为，搅拌速度为300r/min，培养72h ；所述的发酵培养基组成为酵母粉25g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaC032g, KNO3 2g， .3H20 0. 66g, FeSO4 · 7H20 0. 02g, MgSO4 · 7H20 1. 03g,水定容至 1000ml, pH 值为 7. 4，于 115 121°C灭菌 30min ； (3)抗霉素AlS(I)的提取①发酵液8000r/min离心30min，收集菌体；菌丝体在pH值为3.0、体积百分比70%的乙醇中振荡Mh，然后用乙酸乙酯萃取；萃取液减压浓缩得到粗提物；②利用规格200-300目的硅胶柱对粗提物进行层析，采用干法装柱，石油醚乙酸乙酯梯度洗脱，梯度比例为体积比5 1、3 1、1 1和1 3，每个梯度为IOOOmL,洗脱速度为lOmL/min，每IOOmL收集一个样品，分部收集洗脱液，得到40个组份，将第16 36组分合并，得到洗脱液A ；③将洗脱液A用按体积比3 1混合的石油醚/甲醇混合液萃取，得到去除大部分油脂后的物质，再过规格为50 100目的葡聚糖柱，甲醇氯仿梯度洗脱，梯度依次为体积比 9 1、7 1、5 1、3 1、1 1、2 1和4 1，每浓度梯度为500mL，洗脱的总体积是 3500mL，流速5mL/min，每IOOmL为一个组分；将第10至15组分合并，再用规格为200-300 目的硅胶柱层析分离，洗脱剂为体积比5 1混合的石油醚/丙酮溶液，总体积为200mL， IOmL收集一份，总共收集20个组分，将第10 11组分合并为组分E ；④将步骤③得到的组分E继续用规格为200-300目的硅胶柱分离，洗脱条件为按体积比5 1混合的石油醚/丙酮溶液，洗脱总体积为200mL，每20mL收集一份，得到10个组份；⑤将步骤④得到的活性组份4减压浓缩，得白色晶体S，将S溶解于按体积比1 1混合得到的石油醚/丙酮溶液中，置4°C冰箱重结晶。⑦采用高效液相色谱对组份S进行分离纯化，收集峰面积大的馏份，得到抗霉素 AlS(I)；色谱条件色谱柱为C18反相硅胶柱，甲醇/水=50 50 ；流速1. OmL/min ；吸收波长320nm。
4.根据权利要求3所述的抗霉素AlS(I)的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的活化的方式为使用斜面培养基于培养菌株H74-18，直至菌丝和孢子生长成熟。
5.根据权利要求4所述的抗霉素AlS(I)的制备方法，其特征在于所述的培养基为改良的高氏一号培养基，组成如下可溶性淀粉20g, KNO3 lg，海水精3g，K2HPO4 · 3H20 0. 66g， FeSO4 · 7H20 0. 02g, MgSO4 · 7H20 1. 03g,琼脂 16g，水定容至 1000ml，pH 值为 7. 2 7. 4，于 115 121°C 灭菌 30min。
6.一种生物制剂，包含权利要求2所述的抗霉素AlS(I)。
7.根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于所述的生物制剂为抗霉素AlS(I)粉末、乳化剂和甲醇按质量比2 5 43混合均勻得到。
8.根据权利要求7所述的生物制剂，其特征在于所述的乳化剂为土温-80。
9.权利要求6 8任一项所述的生物制剂应用于防治辣椒疫病、黄瓜疫病、黄瓜炭疽病或辣椒炭疽病中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用。该抗生链霉菌是从2000多种海洋放线菌中筛选出的均对辣椒疫霉病菌、黄瓜疫霉菌、黄瓜炭疽病和辣椒炭疽病菌具有较好抑制活性的菌株，名称为抗生链霉菌H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2010364。从该菌株中分离得到具有抑菌活性的抗霉素A18(1)，分子式为C28H41N2O9，分子量为549.3。将该抗霉素A18(1)和乳化剂、甲醇混合得到稳定性较好的生物制剂。该生物制剂喷施后12天，施用倍数500×防治辣椒疫病的效果为90.00％，防治黄瓜疫病的效果为86.67％，防治辣椒炭疽的效果为86.67％，防治黄瓜炭疽的效果为90.00％。
文档编号C07D321/00GK102174440SQ201110030190
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者李培谦, 林壁润, 沈会芳, 潘群英, 蒲小明 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所