焦磷酸测序法检测abcc10基因试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及焦憐酸测序法检测ABCC10基因多态性的试 剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 替诺福韦是一种核巧酸类逆转录酶抑制剂，临床应用于治疗艾滋病、乙肝等的抗 病毒药物。替诺福韦醋是替诺福韦的前药，口服药物替诺福韦醋具有水溶性，可被迅速吸收 并降解成活性物质替诺福韦，替诺福韦然后被转变为活性代谢产物替诺福韦双憐酸盐。活 性成分替诺福韦双憐酸盐可通过直接竞争性地与天然脱氧核糖底物相结合而抑制病毒聚 合酶，及通过插入DNA中终止DNA链。该药通过干扰病毒DNA聚合酶的功能，抑制病毒复制，降 低血清及组织内的病毒载量从而具有潜在的抗病毒的活性。替诺福韦几乎不经胃肠道吸 收，通过肾小球过滤和主动小管转运系统排泄，约70%~80% W原形经尿液排出体外。近端 肾小管上皮细胞是替诺福韦醋的主要作用祀点。因为近端小管的上皮细胞有复杂的药物转 运机制，主要包括ΟΑΤ1和0ΑΤ3转入蛋白及MRP-2、MRP-4和MRP-7转出蛋白等转运蛋白。其编 码基因的SNP突变可能影响其蛋白活性从而导致替诺福韦的蓄积，毒副反应增加，疗效降 低。MRP-7的编码基因为ABCC10,其nearGene-5区存在526G〉A(rs9349256)突变，可能影响 ABCC10的活性，从而影响MRP-7对替诺福韦的转出过程。rs9349256与尿无机憐消耗及的小 球蛋白显著相关，P值分别为0.02与0.04，等位基因 A携带者发生慢性肾脏疾病的风险是等 位基因 G携带者的2.3倍(J Infect Dis.2011化1 1:204(1):145-53.)。我们进一步研究发 现，携带rs9349256突变纯合子AA和突变杂合子GA的在治疗48周后的CD4免疫应答分别为携 带GG野生型纯合子的31.2%和40.8%，携带64+44型患者〔04免疫应答效应为携带66型患者 的 38.6%，P = 0.002。
[0003] 综上所述，对ABCC10基因 nearGene-5区rs9349256单核巧酸多态性进行分析检测 可作为替诺福韦不良反应及疗效预测的有效指标，为临床制定替诺福韦抗病毒治疗方案提 供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测ABCC10基因多态性的试剂盒将为替诺福韦 的临床个体化治疗起到积极的推动作用。
[0004] 焦憐酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行 电泳，DNA片段也无须巧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本 低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
【发明内容】
[0005] ABCC10基因多态性是替诺福韦不良反应预测的有效指标。本发明提供一种检测影 响ABCC10 rs9349256(G〉A)单核巧酸多态性的试剂盒，W实现快速、简便、准确、高效、实用、 经济的检测替诺福韦个体化用药相关基因 SNP。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：
[0007] 所述焦憐酸测序法检测ABCC10基因多态性试剂盒，包括如下引物：
[000引 （1)扩增引物；
[0009] ABCC10(rs9349256)上游引物：5'-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3'(SEQID N0.1)；
[0010] ABCC10(rs9：M9256)下游引物：5'-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3'(沈Q ID N0.2);
[0011] 其中，下游引物的5/进行生物素标记；
[0012] (2)测序引物：
[0013] ABCC10(rs9：M9256)测序引物：5'-TTCACTCTCTCCTGACC-3'(沈Q ID N0.3);
[0014] 其中，48〔(：10'39349256(6〉4)目标序列：野生型〇：1'刊6了〇：44(569 10^.4)、突 变型CCTTTATCCAA(SEQ ID N0.5)。
[001引利用上述试剂盒检测ABCCIO基因多态性的方法，不包括如下步骤：
[0016] (l)DNA 提取；
[0017] (2)聚合酶链反应
[001 引配制50μ1 PCR扩增体系，包含：10XPCR buffer 5.0μ1，(1ΝΤΡ 1.化1，ABCC10-上游 引物0.化1，ABCCIO下游引物0.扣1，rTaqO.扣1，水40μ1，模板化1;按照下面的循环参数设置 扩增仪:95°C 5min预变性;然后依次在95°C 30S，55°C 30S，72°C 30S，进行36个循环;再在 72°C保持3min，最终保持在4°C，得扩增产物；
[0019] (3)焦憐酸测序单链样本纯化；
[0020] (4)焦憐酸测序；
[0021] (5)焦憐酸测序结果分析。
[0022] 本发明适用于对ABCC10基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上替诺福韦 个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦憐酸测序技术可W快速、准确 地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程;具有高通量、低成本等特点；PCR产物即 可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明ABCC10 rs9349256(GG)焦憐酸测序结果图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[00 巧]ABCC10(rs9349256)上游引物：5'-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3'(SEQID N0.1)；
[0026] ABCC10(rs9：M9256)下游引物：5'-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3'(沈Q ID N0.2);
[0027] 其中，下游引物的5/进行生物素标记；
[002引 ABCC10(rs9：M9256)测序引物5'-TTCACTCTCTCCTGACC-3'(沈Q ID N0.3);
[0029] 1.DNA 提取
[0030] 1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
[0031] (1)检查试剂盒保质期W及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应 标识处打勾^Γ;(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；（3)高压灭菌有效期内的 1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
[0032] 1.2从4°C冰箱中取出装有全血的邸ΤΑ抗凝管，上下颠倒数次混匀；
[0033] 1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
[0034] 1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的 1.5mL Eppendorf管；
[0035] 1.5小屯、移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
[0036] 1.6盖上化pendorf管盖，室溫解育lOmin;
[0037] 1.7 13,000巧 m 室溫离屯、20 秒；
[003引 1.8取出化pendorf管，观察白色沉淀；
[0039] 1.9开化pendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上 清吸尽；
[0040] 1.10盖上化pendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；
[0041 ] 1.11 移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠 倒数次混匀；
[0042] 1.12打开Eppendorf管，移取lOOuL Protein Precipitation Solution入上述 Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，00化pm室溫离屯、3min;
[0043] 1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL E卵endorf管；
[0044] 1.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状曲NA 析出；
[0045] 1.15 13,000巧 m 室溫离屯、Imin;
[0046] 1.16打开化pendorf管，手捏管