专利名称：丙肝测序分型试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种丙肝测序分型试剂盒及其检测方法，属于病毒亚型的检测技术领 域。
背景技术：
HCV基因型有地区差异，不同基因型与病情进展、肝癌发生及干扰素疗效有关，对 散发性丙型肝炎的传播途径和疫苗研制等均有重要意义。HCV基因型分布存在明显的地区差异。5种常见基因型(la、lb、2a、2b、3a)分布广 泛，其中，Ia型在美国、巴西和欧洲西北部占优势，Ib型在远东、欧洲东西部多见，2a和2b型 多分布于亚洲和欧洲，3a型在西方一些国家以及泰国、新加坡多见，并在东印度和孟加拉国 的一些人群中成为HCV感染的唯一基因型。其他较少见基因型的分布则局限于某些地区， 4型在中东和北非占优势，5a型局限于南非，6a型主要见于香港、麦加和越南。诸多资料表 明，中国大陆以Ib和2a为主，且Ib为多。南方Ib型占90%以上，北方2a型占46 70%。 基因型多样性不如我国香港、日本，但混合感染率明显高于其他国家和地区。不同基因型与病情变化有关。众多报道认为Ib型HCV与慢性肝炎重症化、感应化 和肝细胞癌有密切关系。Kobayashi等对140例丙型肝炎患者回顾性研究发现1b型肝组 织学分级、分期的恶化进展速度及血清平均HCV2RNA效价明显高于2型，提示Ib型可引起 较重的肝坏死性炎症、肝纤维化，且病毒具有较强的复制能力。Silini等对593例慢性丙型 肝炎、219例肝硬化和166例肝细胞癌的研究发现，肝细胞癌患者中Ib型阳性率显著高于慢 性丙肝和肝硬化。但也有报道认为Ib型与肝纤维化和肝细胞癌无明显关系。目前HCV基 因型与肝病严重程度的关系尚未获得一致意见，多数学者认为Ib型与肝病进展和肝细胞 癌有密切关系。基因型与干扰素疗效有关。干扰素是目前公认的抗HCV有效药物，广泛应用于临 床。国内国外的资料表明HCV基因型对IFN有明显影响，Ib型疗效明显低于其他常见基因 型，IFN治疗Ib型和2a型的长期缓解率分别为40%和90%左右。因此有人建议，在干扰 素治疗前，除了考虑病人年龄、病期、肝纤维化程度和病毒复制水平外，基因型应作为重要 预测指标。通过基因型的比较和分析，有助于发现散发性丙型肝炎的传播途径并控制传染 源。对妓女、性病患者和男性同性恋者等性行为频繁的人群进行调查表明，他们均有较高的 HCV感染率，分别为6. 9%、9%和6. 9 26%，明显高于当地一般人群或供血员的公认水平。 慢性丙型肝炎患者的配偶也有较高的HCV感染率，为8. 5 28%，而且感染率随着性接触时 间的延长有增高的趋势。Ideo等报告34例抗2HCV阳性病例的88名亲属，有7人抗2HCV 阳性8% ；另8例抗2HCV阴性病人的26名亲属中均未发现抗2HCV阳性者。而当地一般人 群HCV感染率不足1%，据此，认为丙型肝炎存在一定程度的家庭传播。对104例丙肝病人 的307名亲属进行调查，52人抗2HCV阳性，阳性率为17%，超过当地一般人群的感染率。感 染率在家庭成员的分布从高到低依次为双亲(54% )、配偶(28% )、子女(6.9% )及其他成员(6.4%)。而且年龄越大，与病人生活时间越长，感染的危险性也越大。Thalter等对 8例HCV核酸阳性母亲产下的8名婴儿进行2 19个月的随访，其中7名婴儿确认感染了 HCV，提示母亲的感染状态对丙型肝炎垂直传播有影响。目前，上述传播还缺乏足够的依据， 只有从分子生物学角度，通过HCV基因型核苷酸序列的研究，进一步判断和证实。由于没有HCV体外培养系统，许多传统的病毒学分类方法无法应用，HCV的分类将 不可避免的几乎全部依赖于各株之间全基因组序列比较或某一片段的序列比较。(1)核苷酸序列分析法最初的分类是基于全序列比较的基础上，通过对全长 914kb核苷酸序列的分析，了解其同源性程度，后来发展到利用部分基因组序列进行比较分 析，该法准确直观，但操作复杂，难以对较大样本进行观察。(2)型特异性引物扩增法根据核苷酸片段某区域内序列变异的特点，用每型特异 性引物进行扩增，不同的型可扩增出长短不一的片段。据此进行分类，这种方法主要应用于 C区禾口 NC区。(3)型特异性探针杂交法根据各种基因型的HCV基因组特点，合成型特异性探针， 将PCR产物与型特异性探针进行Southern杂交，检测标本中HCV基因型。由于各型间有时 仅有几个核苷酸发生变异，这样对杂交的条件有较严格的要求，所以这种方法精确度不高，
稳定性较差。(4)限制性酶切片段长度多态性(RFLP)用多种限制性内切酶对扩增后的HCV基因 产物进行酶切，由于不同的基因片段有不同的酶切位点，所以经酶切后可出现大小不同的 片段及多态性。这种操作方法临床应用价值较大。但不管运用何种方法，由于HCV基因组的核苷酸及氨基酸变异是其基础，各种分 析方法所获得的结果具有一定可比性。HCV为一具有很高变异率的不均一病毒株，其在复制过程中所依赖的RNA聚合酶 为一容易产生错配倾向(error-prone)的RNA依赖的RNA聚合酶，同许多其他RNA病毒一 样缺乏修补机制，使得不精确复制产物不能得到修补，从而出现较多的错配，表现出较高的 变异率，多次复制和变异的结果将导致多种不同变异株的产生，表现为HCV株间的不均一 性或差异性，因此，HCV分离株表现出不同的基因型，其差异在各基因型3 ‘末端的核苷酸长 度不一。有关HCV的基因分型采用的方法、选择的基因片段和命名各不相同，但在众多的基 因分型方法中，惟一可信而又可用于鉴定新的基因型的方法，就是选择特定的HCV基因区 段特别是El区进行测序分型，而本发明用套式RT-PCR方法扩增特异性HCV基因片段，进行 核苷酸序列焦磷酸测序分析鉴定HCV各亚型。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的不足，提供一种丙肝测序分型
试齐U盒。本发明还要解决的一个技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种丙肝测序分型试剂盒，它包括(1)特异性扩增丙肝病毒RNA逆转录产物cDNA的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1 至 SEQ ID NO 4 所示，其中 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 为引物对，SEQ IDNO 3 和 SEQID NO 4为引物对；(2)丙肝病毒特异性测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 JPSEQ ID NO 7 所示；其中，SEQ ID NO :4在其5，端标记生物素；
上述引物在一次检测中共同使用。具体的，上述丙肝测序分型试剂盒，包括如下试剂(I)RNA提取试剂Trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理水；(2)逆转录试剂200U/yL M-MLV 逆转录酶，20U/yL RNase 抑制齐[J， 5 X RT-PCRBuffer, IOmM dNTP mix, 100 μ M random hexamer primer, DEPC ^hii/jC ；其中，5XRT-PCRBuffer 具体为250mM pH 8. 3Tris-HCl, 250mM KCl, 20mMMgCl2, 50mM DTT ；(3) PCR 试剂:2XTaq buffer，IOuM 特异引物 SEQ ID NO 1 4，25mM MgCl2, IOmM dNTPmix, 5U/ μ LTaq DNA 聚合酶；其中:2XTaqbuffer 具体为0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (v/v)明胶，0· 06% (g/ ml)BSA，0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8. 9Tricine ；(3)单链纯化试剂链亲和素beads，75 % (v/v)乙醇溶液，0. 2M NaOH, IOmM pH7. 6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；其中，结合缓冲液具体为10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (v/v) Tween20 ；退火缓冲液具体为20mM pH 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸镁；(4)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物 APS，荧光素和 dNTP (dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。利用上述丙肝测序分型试剂盒的检测方法，包括如下步骤(1)丙肝HCV RNA模板的抽提；(2)将步骤(1)所得RNA模板用随机引物逆转录成cDNA，再按所述特异性扩增丙 肝病毒RNA逆转录产物cDNA的引物进行PCR扩增；(3)将步骤⑵得到的PCR扩增产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯 化；(4)将步骤(3)所得单链纯化产物进行测序；(5)结果分析。步骤(1)中，所述的丙肝HCV RNA模板的抽提，具体包括如下步骤(Ia)将标本血清200 μ L与ImL Trizol，混勻，加入200 μ L氯仿，混勻15s，室温 5min，4°C下 12000g 离心 15min ；(Ib)上层水相移入另一离心管，加入与上层水相等体积异丙醇，混勻15s，室温 10min，4°C下 12000g 离心 IOmin ；(Ic)弃步骤(Ib)得到的上清，加冰预冷的75% (v/v)乙醇(用DEPC水配)ImL, 40CT 7500g 离心 5min ；(Id)弃步骤(Ic)得到的上清，空气干燥5min，加入20uL DEPC处理水，获得HCV RNA-70°C 备用。步骤(2)中所述的逆转录，具体方法是将IlyL RNA与1 μ L IOOuM randomhexamerprimer,4y L 5 X RT-PCR BufferU μ L 20U/ μ L RNase 抑制剂、2μ L IOmM dNTP mix 和 1 μ L200U/ μ L M-MLV 逆转录酶，混勻，25 "C 5min, 42 "C 60min, 70 "C 5min,获得 cDNA4°C保存备用。步骤(2)中所述的PCR扩增方法具体为(2a)外侧引物扩增50 μ L 体系2 X Taq buffer 25 μ L, IOmM dNTP mix 1 μ L，弓| 物 SEQ ID NO 1 和 SEQID NO :2 各 1 μ L，25mM MgCl24 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，cDNA 2. 5 μ L, ddH2015. 2μ L0PCR 扩增条件94 V 3min 预变性；94 V 30s, 58 °C 30s, 72 °C 40s, 35 个循环； 72 °C 5min ；(2b)内侧引物扩增50口1^体系2父丁&9 buffer 25 μ L, IOmM dNTP mix 1 μ L，引物 SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4 各 lyL，25mM MgCl2 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，外侧 PCR 扩增产 物 2 μ L，ddH20 14. 7 μ L ；PCR 扩增条件94 V 2min 预变性；94 V 20s, 59 °C 20s, 72 °C 30s, 40 个循环； 72 °C 5min。步骤(3)所述的将步骤⑵得到的PCR扩增产物以所述的标记生物素的引物序列 进行单链纯化，具体包括如下步骤将步骤⑵中得到的50uL PCR扩增产物与3uL链亲和素beads及47uL结合缓冲液 在一个离心管中震荡混合lOmin，然后用Vaccuum prep workstation系统中的vaccuumpr印 tool抓取beads，将吸附有beads的vaccum prep tool依次在75% (ν/ν)乙醇溶液， 0. 2MNa0H溶液，IOmM pH 7. 6Tris_Acetate 溶液中清洗 10s，将 vacuum prep tool 放入含有 IuL测序引物和49uL退火缓冲液的PSQ96板中，释放beads，将该PSQ96板放在ThermoPlate 上加热到80°C 2min，再冷却至室温，即得到可进行后续测序反应的单链纯化产物。步骤(5)所述的结果分析，具体为测序结果在HCV数据库(http://hcV. lanl. gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast. html)进行比对，得到所测样本基因 型。有益效果本发明的检测HCV基因型的试剂盒，该方法通过逆转录、PCR和测序方 法可以检测出1-6型中的所有亚型，测序所得的结果具有极高的准确性，比传统的Sanger 测序法更加快速、简便，并且比其他检测方法都更加特异、灵敏、简便、快速、准确、成本低 廉，检测下限至lOOcopy/mL，并且具有很高的通量。
图1是利用本发明的试剂盒和检测方法(特异测序引物SEQ ID NO 5)检测丙肝 的测序结果图。图2是利用本发明的试剂盒和检测方法(特异测序引物SEQ ID NO 6)检测丙肝 的测序结果图。图3是利用本发明的试剂盒和检测方法(特异测序引物SEQ ID NO 7)检测丙肝 的测序结果图。
图4是Sanger测序(测序引物SEQ ID NO 3)检测丙肝的测序结果图，对应本发 明特异测序引物SEQ ID NO :5检测丙肝的测序结果。图5是Sanger测序(测序引物SEQ ID NO 3)检测丙肝的测序结果图，对应本发 明特异测序引物SEQ ID NO :6检测丙肝的测序结果。图6是Sanger测序(测序引物SEQ ID NO 3)检测丙肝的测序结果图，对应本发 明特异测序引物SEQ ID NO :7检测丙肝的测序结果。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 试剂盒的制备。(I)RNA 提取试剂Trizol 购于 invitrogen 公司，氯仿购于杭州高晶精细化工有限公司，异丙醇购于杭州双林化工试剂厂，无水乙醇购于杭州长征化学试剂有限公司，DEPC处理水购于fermentas公司。(2)逆转录试剂200U/ μ L M-MLV 逆转录酶购于 fermentas 公司，20U/ μ L RNase 抑制剂购于 fermentas 公司，5 X RT-PCR Buffer :250mM Tris-HCl (pH 8. 3) , 250mM KCl，20mM MgCl2, 50mMDTT (购于 fermentas 公司)，IOmM dNTP mix 购于上海鼎国生物技术有限公司，100 μ M random hexamer primer 购于 invitrogen 公司,DEPC处理水购于fermentas公司。(3) PCR 试剂2XTaq buffer 0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明胶(购于美国 Sigma 公司)， 0. 06% (g/mL)BSA (购于美国 Sigma 公司)，0. (v/v) Tween_20 (购于美国 Sigma 公司)， 0. 06M pH8. 9Tricine (购于 Merck 公司)，特异引物:SEQID NO :1 4，IOuM,25mM MgCl2 购于美国 Sigma 公司，IOmM dNTP mix 购于上海鼎国生物技术有限公司，5U/ μ LTaq DNA 聚合酶购自美国 Fermentas 公司。(3)单链纯化试剂链亲和素beads (溶于20%乙醇)购于GE公司，75% (ν/ν)乙醇溶液购于杭州长征化学试剂有限公司，0. 2Μ NaOH:购于上海试四赫维化工有限公司，IOmM Tris-Acetate (pH 7.6) :Tris_base 购于美国 Sigma 公司，无水乙酸购于杭 州化学试剂有限公司，
结合缓冲液由IOmM Tris-HCl (Tris_base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化 学试剂有限公司)，2M NaCl (购于上海试四赫维化工有限公司)，ImM EDTA(购于杭州化学 试剂有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (购于美国Sigma公司)组成，退火缓冲液由20mM Tris-Acetate (pH 7. 6) (Tris-base 购于美国 Sigma 公司， 无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组 成。(4)测序试剂DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶购于QIAGEN公司，底物APS和荧光素购于QIAGEN公司，四种 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)购于 QIAGEN 公司。实施例2 检测方法。(1)丙肝HCV RNA模板的抽提，具体包括如下步骤(Ia)将标本血清200 μ L与lmLTrizol，混勻，加入200 μ L氯仿，混勻15s，室温 5min，4°C下 12000g 离心 15min (离心机为 Microfuge 22R Centrinofuge，BECKMAN 公司，以 下同)；(Ib)上层水相移入另一离心管，加入与上层水相等体积异丙醇，混勻15s，室温 10min，4°C下 12000g 离心 IOmin ；(Ic)弃步骤(Ib)得到的上清，加冰预冷的75% (ν/ν)乙醇(用DEPC水配)ImL, 40CT 7500g 离心 5min ；(Id)弃步骤(Ic)得到的上清，空气干燥5min，加入20uLDEPC处理水，获得HCV RNA-70°C 备用。(2)将步骤(1)所得RNA模板用随机引物逆转录成cDNA，再按所述特异性扩增丙 肝病毒RNA逆转录产物cDNA的引物进行PCR扩增(SlOOOThermal Cycler，BIO-RAD公司)；其中，逆转录具体方法是将11 μ L RNA 与 1 μ L IOOuM random hexamer primer、 4 μ L5 X RT-PCR BufferU μ L 20U/μ L RNase 抑制剂、2 μ L IOmM dNTP mix 禾口 1 μ L 200U/ μ LM-MLV 逆转录酶，混勻，25°C 5min,42°C 60min,70°C 5min，获得 cDNA4°C保存备用。其中，PCR扩增方法具体为(2a)外侧引物扩增50yL 体系2XTaq buffer 25 μ L，IOmM dNTP mix lyL，弓| 物 SEQ ID NO 1 和 SEQID NO :2 各 1 μ L，25mM MgCl24 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，cDNA 2. 5 μ L, ddH2015. 2μ L0PCR 扩增条件94 "C 3min 预变性；94 V 30s, 58 °C 30s, 72 °C 40s, 35 个循环； 72 °C 5min ；(2b)内侧引物扩增50 μ L 体系2 X Taq buffer 25 μ L, IOmM dNTP mix 1 μ L，引物 SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4 各 1 μ L, 25mM MgCl25 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L,外侧 PCR 扩增产物 2 μ L，ddH20 14. 7 μ L ；PCR 扩增条件94 "C 2min 预变性；94 V 20s, 59 °C 20s, 72 °C 30s, 40 个循环； 72 °C 5min。
(3)将步骤⑵得到的PCR扩增产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯 化，具体包括如下步骤将步骤⑵中得到的50uL PCR扩增产物与3uL链亲和素beads及47uL结合缓 冲液在一个离心管中震荡混合lOmin，然后用Vaccuum prep workstation系统(PyroMark ID, QIAGEN 公司)中的 vaccuum prep tool 抓取 beads,将吸附有 beads 的 vaccum prep tool 依次在 75% (v/v)乙醇溶液，0. 2Μ NaOH溶液，IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate 溶液中清洗 10s，将vacuum prep tool放入含有IuL测序引物和49uL退火缓冲液的PSQ96板(购于 QIAGEN公司)中，释放beads，将该PSQ96板放在ThermoPlate (购于QIAGEN公司)上加热 到80°C 2min，再冷却至室温，即得到可进行后续测序反应的单链纯化产物。(4)将步骤(3)所得单链纯化产物进行测序，按照仪器(PyroMark ID, QIAGEN公 司)说明书操作。(5)结果分析，具体为测序结果在HCV数据库(http://hcv. lanl. gov/content/ sequence/BASIC_BLAST/basic_blast. html)进行比对，得到所测样本基因型。图1为第1例丙肝标本特异测序引物SEQ ID NO 5测序结果图，测序结果为TGC CAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCG,图2为第1例丙肝标本特异测序引物SEQ ID NO :6测序结果图，测序结果为 TCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCG图3为第1例丙肝标本特异测序引物SEQ ID NO :7测序结果图，测序结果为 GAGACTGCTAGCCGAGT测序结果分别在HCV 数据库(http://hcv. lanl. gov/content/sequence/BASIC_ BLASiybasic_blast.html)进行比对，结合3部分测序比对结果，得分最高即为所测样本基 因型Ib型。为验证结果可靠性，将同一标本用步骤(2)所得的PCR产物用普通测序仪 (ABI3100，美国Invitrogen公司)进行经典Sanger测序，测序引物使用内侧PCR引物SEQ IDNO :3。图4 6为对应本试剂盒中的3部分测序的Sanger测序结果，图 4 测序结果为TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCG ；图 5 测序结果为 TCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCG ；图 6 测序结果为GAGACTGCTAGCCGAGT。与本试剂盒 3 特异测序引物(SEQ ID NO :5 SEQ ID NO 7)测序结果完全吻合。
权利要求
一种丙肝测序分型试剂盒，其特征在于它包括(1)特异性扩增丙肝病毒RNA逆转录产物cDNA的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO1至SEQ ID NO4所示，其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，SEQ IDNO3和SEQ ID NO4为引物对；(2)丙肝病毒特异性测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、和SEQ ID NO7所示；其中，SEQ ID NO4在其5’端标记生物素；上述引物在一次检测中共同使用。
2.根据权利要求1所述的丙肝测序分型试剂盒，其特征在于它包括如下试剂(1)RNA提取试剂Trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理水；(2)逆转录试剂200U/uLM-MLV 逆转录酶，20U/uL RNase 抑制剂，5 X RT-PCRBuffer， IOmM dNTP mix, IOOuM random hexamer primer, DEPC ^hii/jC ；(3)PCR试剂2XTaq buffer，IOuM 特异引物 SEQ ID N0:1 4，25mM MgCl2, IOmM dNTPmix，5U/uLTaq DNA 聚合酶；(3)单链纯化试剂链亲和素beads，75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM pH7. 6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；(4)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧 光素和dNTP。
3.一种丙肝测序分型试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)丙肝HCVRNA模板的抽提；(2)将步骤(1)所得RNA模板用随机引物逆转录成cDNA，再按所述特异性扩增丙肝病 毒RNA逆转录产物cDNA的引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；(4)将步骤(3)所得单链纯化产物进行测序；(5)结果分析。
4.根据权利要求3所述的丙肝测序分型试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(1)中所 述的丙肝HCV RNA模板的抽提，具体包括如下步骤(Ia)将标本血清200 μ L与ImL Trizol，混勻，加入200 μ L氯仿，混勻15s，室温5min， 4°CT 12000g 离心 15min ；(lb)上层水相移入另一离心管，加入与上层水相等体积异丙醇，混勻15s，室温lOmin， 4°CT 12000g 离心 IOmin ；(Ic)弃步骤(Ib)得到的上清，加冰预冷的75% (ν/ν)乙醇1!1^，41下750(^离心 5min ；(Id)弃步骤(Ic)得到的上清，空气干燥5min，加入20uL DEPC处理水，获得HCV RNA-70°C 备用。
5.根据权利要求3所述的丙肝测序分型试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2) 中所述的逆转录，具体方法是将11 μ L RNA与IyL IOOuM random hexamer primer、 4 μ L5 X RT-PCR BufferU μ L 20U/μ L RNase 抑制剂、2μ L IOmM dNTP mix 禾口 1 μ L 200U/ μ LM-MLV 逆转录酶，混勻，25°C 5min,42°C 60min,70°C 5min，获得 cDNA4°C保存备用。
6.根据权利要求3所述的丙肝测序分型试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所 述的PCR扩增方法具体为(2a)外侧引物扩增50yL 体系2XTaq buffer 25 μ L，IOmM dNTP mix 1 μ L,弓 | 物 SEQ ID NO :1 和 SEQID NO :2 各 1 μ L，25mM MgCl2 4 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L，cDNA 2. 5 μ L, ddH2015. 2μ L0PCR 扩增条件94 "C 3min 预变性；94 V 30s, 58 °C 30s, 72 °C 40s, 35 个循环； 72 °C 5min ；(2b)内侧引物扩增50 μ L体系:2XTaq buffer 25 μ L，IOmM dNTP mix 1 μ L，引物 SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4 各 1 μ L，25mM MgCl2 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，外侧 PCR 扩增产物 2 μ L， ddH20 14. 7 μ L ；PCR 扩增条件94 "C 2min 预变性；94 V 20s, 59 °C 20s, 72 °C 30s, 40 个循环； 72 °C 5min。
7.根据权利要求3所述的丙肝测序分型试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(3)所述 的将步骤⑵得到的PCR扩增产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化，具体包 括如下步骤将步骤(2)中得到的50uL PCR扩增产物与3uL链亲和素beads及47uL结合缓冲液在 一个离心管中震荡混合IOmin,然后用Vaccuum prep workstation系统中的vaccuumpr印 tool抓取beads,将吸附有beads的vaccum prep tool依次在75 % (ν/ν)乙醇溶液， 0. 2MNa0H溶液，IOmM pH 7. 6Tris_Acetate 溶液中清洗 10s，将 vacuum prep tool 放入含有 IuL测序引物和49uL退火缓冲液的PSQ96板中，释放beads，将该PSQ96板放在ThermoPlate 上加热到80°C 2min，再冷却至室温，即得到可进行后续测序反应的单链纯化产物。
8.根据权利要求3所述的丙肝测序分型试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(5)所述 的结果分析，具体为测序结果在HCV数据库进行比对，得到所测样本基因型。
全文摘要
本发明公开了一种丙肝测序分型试剂盒，它包括(1)特异性扩增丙肝病毒RNA逆转录产物cDNA的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO1至SEQ ID NO4所示，其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4为引物对；(2)丙肝病毒特异性测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、和SEQ ID NO7所示；其中，SEQ ID NO4在其5’端标记生物素；上述引物在一次检测中共同使用。本发明还公开了上述丙肝测序分型试剂盒的检测方法。应用此试剂盒能对丙肝测序分型，为临床诊疗提供了更全面的参考信息。
文档编号C12Q1/70GK101921871SQ20101010150
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月27日 优先权日2010年1月27日
发明者任绪义, 吕江峰, 王栋梁, 虞闰六 申请人:南京迪安医学检测中心有限公司