专利名称：用dna检测技术分析羊绒质量的方法
技术领域：
本发明涉及生物DNA检测技术的应用，特别是一种用DNA检测技术分析羊绒质量 的方法。
背景技术：
世界上的羊绒制品主要有绵羊绒和山羊绒两种。因为山羊绒比绵羊绒细腻、柔软、 保暖性好，所以它的质量和价格都高于绵羊绒。少数不法之徒为牟取暴利人为地将绵羊绒 掺入山羊绒，严重地损害了消费者利益。中国现有的山羊绒和绵羊绒的鉴定办法是用显微 镜观察羊绒纤维的结构，利用其表面结构的不同来区分二者。现有技术的最明显的缺陷在于1.鉴定的主观性鉴定全靠技术人员的经验判 断，没有任何科学数据；2.鉴定方法的不确定性鉴定方法全靠定性描述，他人很难重复； 3.无法鉴定深度处理过的羊毛。深度处理过的羊毛，如深度染色等，因为羊毛结构或光学特 性发生了变化，现有方法无法鉴定。从进化来看，山羊(Capra hircus)和绵羊(Ovis aries)属于不同的属，他们大约 在5至8百万年前就在生殖上相互分离了，他们的DNA有相当大的差异。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术之不足，提供一种用DNA检测技术分析羊绒质量的 方法，本发明的目的按照下述方案实现用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其检测过程为先从待测样品上提取DNA， 再用绵羊或山羊探针进行实时聚合酶链式反应，最后对反应结果进行数值分析得出样品中 山羊绒或绵羊绒的含量；上述实时聚合酶链式反应的过程为，先制备绵羊TaqMan MGB探针和山羊I1aqMan MGB探针，在试管内，分别与待测样品DNA进行实时聚合酶链式反应，反应所加试剂有 IxPCR 缓冲液、MgCl2、dNTP、PCR 正向引物、PCR 反向引物、TaqMan MGB 探针、GoldTaq DNA 聚 合酶、DNA样品，反应温度95 °C，11分钟，40个循环，每个循环，94°C 30秒，65 °C 30秒，反应 过程中实时测定试管内液体的相对荧光量；上述绵羊 TaqMan MGB 探针为FAM-ataattataaaaacaaaa_MGB，山羊 TaqManMGB 探 :FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB, ^ ψ FAM ^^7^^14 6-carboxyfluorescein ^if
写，MBG 是粹光剂 dihydrocyclopyrroloindole tripeptideMinor Groove Binder 的缩写；上述山羊绒含量的分析过程为先制备不同山羊DNA浓度的标准样，与山羊 TaqMan MGB探针进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量，根据结果制出标准曲线或 归纳线性方程式，对待测样品在同等条件下进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量， 对照结果可以得出样品中山羊绒含量；上述绵羊绒含量的分析过程为先制备不同绵羊DNA浓度的标准样，与绵羊 TaqMan MGB探针进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量，根据结果制出标准曲线或
3归纳线性方程式，对待测样品在同等条件下进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量， 对照结果可以得出样品中绵羊绒含量。本发明从根本上克服了现有技术的主观性，不确定性，使得鉴定深度加工的含羊 绒制品成为现实，羊毛、羊绒鉴定从一门艺术变成了现代科技。
图1是山羊和绵羊线粒体DNA基因片段序列比较图；图2是TaqMan MGB反应的图解图；图3是绵羊毛DNA样品与山羊或绵羊的TaqMan MGB探针反应结果图；图4是山羊毛DNA样品与山羊或绵羊的TaqMan MGB探针反应结果图；图5是不同浓度的山羊DNA在山羊TaqMan探针中的反应结果图；图6是山羊DNA量的对数与其Ct作图得到的标准曲线图；图7是绵羊DNA量的对数与其Ct作图得到的标准曲线具体实施例方式通过系统比较山羊和绵羊线粒体DNA，发现其12S rRNA基因是一个能区分山羊和 绵羊的优良检测目标。如附图1所示，“Query”是绵羊的12S rRNA基因片段，“Sbjct”是山 羊的12S rRNA基因片段，他们之间相同的碱基用竖线标出，而不同的碱基则用空格标出。在上述碱基序列第238和240位置处绵羊和山羊DNA产生了变异，分别从T变成 了 C和从A变成了 G。由此，我们订制了绵羊和山羊专一的TaqMan MGB探针，如下绵羊 TaqMan MGB :FAM-ataattataaaaacaaaa-MGBLij^ TaqMan MGB ΜΨ[‘ :FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB在上述探针中，FAM是荧光染料6-carboxyfluorescein的缩写，MBG是猝光剂 dihydrocyclopyrroIoindole tripeptide Minor Groove Binder 的缩写。当FAM禾Π MGB被同时连在TaqMan MGB探针上时，由于FRET效应 (FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer))，FAM 的荧光将被猝光剂 MGB 吸收而 无法发出。但在聚合酶链式反应(PCR)中，探针将被DNA聚合酶水解，使FAM游离出来，发 出荧光。iTaqMan MGB反应的图解见附图2 DNA由两条反向螺旋链组成，且这两条链上的碱基彼此互补，腺嘌呤对胸腺嘧啶 (A对T)，鸟嘌呤对胞嘧啶(G对C)。当DNA双链的碱基不互补时，它们将无法形成稳定的 DNA双螺旋结构。如上所述，我们已经通过DNA测序，发现绵羊和山羊的线粒体上12S rRNA 基因有差别，我们根据这些差别设计出山羊和绵羊特异的TaqMan MGB探针。山羊的TaqMan MGB探针只能和山羊的12SrRNA基因完全互补，形成稳定的DNA双螺旋结构；反之绵羊的 TaqMan MGB探针只能和绵羊的12S rRNA基因完全互补，形成稳定的DNA双螺旋结构。因 为TaqMan MGB PCR反应产生荧光的先决条件是TaqMan MGB探针与其互补链形成稳定的结 构，所以绵羊探针只有和绵羊DNA在一起时才能产生荧光，反之山羊探针只有和山羊DNA在 一起时才能产生荧光。当有一个未知样品时，可以将该未知样品加入两个试管中，并在两个试管中分别 加入绵羊探针和山羊探针，然后启动TaqMan MGB PCR反应。如果加绵羊探针的试管产生荧光，则该未知样品为绵羊毛；如果加山羊探针的试管产生荧光，则该未知样品为山羊毛；如 果两种探针的试管同时产生荧光，则该样品为山绵羊毛混合样品；如果两种探针试管都不 产生荧光，则该未知物不是羊毛制品。具体测试方法如下1、TaqMan MGB PCR 反应条件如下在伯乐公司的96孔板上，加入下述反应试剂IxPCR缓冲液II (ABI，无Mg2+)， 3mM MgCl2, 300mM dNTP，200nM PCR 正向引物，200nM 反向引物，300nM TaqMan MGB 探针，IU GoldTaq DNA聚合酶(ABI)，DNA样品，总反应体积为12. 5微升。TaqMan MGB PCR反应温度控制如下95°C 11分钟，40个循环(每个循环94°C 30 秒，65°C 30 秒)。2、实验结果如下(1)绵羊毛DNA样品与山羊或绵羊的TaqMan MGB探针反应结果如附图3所示。在 这个实验中，绵羊DNA分别与绵羊探针和山羊探针进行TaqMan MGB反应。绵羊DNA是2. Opg 纯化的绵羊12S rRNA基因PCR片段。从这个实验我们可以看出，绵羊毛DNA仅和绵羊探针 发生TaqMan反应并产生荧光，绵羊毛DNA几乎不和山羊探针发生TaqMan反应。(2)山羊毛DNA样品与山羊或绵羊的TaqMan MGB探针反应如附图4所示。在这个实验中，山羊DNA分别与绵羊探针和山羊探针进行TaqMan MGB反应。山羊 DNA是2. Opg纯化的山羊12S rRNA基因PCR片段。从这个实验我们可以看出，山羊毛DNA 仅和山羊探针发生TaqMan反应并产生荧光，山羊毛DNA几乎不和绵羊探针发生TaqMan反 应。山羊绒和绵羊绒含量的测定山羊DNA经过系列稀释，制成不同浓度的标准样，然后加入TaqMan MGB反应试管 中，与山羊探针反应。不同量的山羊DNA需要不同的PCR循环方可产生可测荧光(该PCR 循环数称为Ct或阈值循环数)；起始山羊DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循环方 可产生可测荧光。不同浓度的山羊DNA在山羊TaqMan探针中的反应结果见附图5。将上面 试验中山羊DNA量的对数与其Ct作图，我们可以得到如附图6的对应关系标准曲线。用绵羊毛DNA通过上述方法可以得到类似的对应关系标准曲线，如附图7所示。上两个山羊和绵羊的浓度试验表明，我们不仅可以用TaqMan MGB反应区分山羊毛 和绵羊毛，我们还可以通过TaqMan MGB反应的Ct值来准确地测定其各自的浓度，从而对样 品中山羊绒和绵羊绒的含量进行定量分析。
权利要求
1.用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其特征在于其检测过程为先从待测样品上 提取DNA，再用绵羊或山羊探针进行实时聚合酶链式反应，最后对反应结果进行数值分析得 出样品中山羊绒或绵羊绒的含量。
2.如权利要求1所述的用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其特征在于上述实时聚 合酶链式反应的过程为，先制备绵羊iTaqMan MGB探针和山羊TaqManMGB探针，在试管内，分 别与待测样品DNA进行聚合酶链式反应，反应所加试剂有lx PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、PCR 正向引物、PCR反向引物、TaqMan MGB探针、GoIdTaq DNA聚合酶、DNA样品，反应温度95°C， 11分钟，40个循环，每个循环94°C 30秒，65°C 30秒，反应过程中实时测定试管内液体的相 对荧光量。
3.如权利要求1所述的用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其特征在于上 述绵羊 TaqMan MGB 探针为FAM-ataattataaaaacaaaa_MGB，山羊 TaqMan MGB 探针 FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB，其中，FAM 是荧光染料 6-carboxyfluorescein 的缩写，MGB 是粹光剂 dihydrocyclopyrroloindoletripeptide Minor Groove Binder 的缩写。
4.如权利要求1所述的用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其特征在于山羊绒含量 的分析过程为先制备不同山羊DNA浓度的标准样，进行实时聚合酶链式反应，测定其相对 荧光量，根据结果制出标准曲线或归纳线性方程式，对待测样品在同等条件下进行实时聚 合酶链式反应，测定其相对荧光量，对照结果可以得出样品中山羊绒含量。
5.如权利要求1所述的用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其特征在于绵羊绒含量 的分析过程为先制备不同绵羊DNA浓度的标准样，进行实时聚合酶链式反应，测定其相对 荧光量，根据结果制出标准曲线或归纳线性方程式，对待测样品在同等条件下进行实时聚 合酶链式反应，测定其相对荧光量，对照结果可以得出样品中绵羊绒含量。
全文摘要
本发明是一种用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其检测过程为先从待测样品上提取DNA，再用绵羊或山羊探针进行实时聚合酶链式反应，最后对反应结果进行数值分析得出样品中山羊绒或绵羊绒的含量。聚合酶链式反应的过程为，先制备绵羊TaqMan MGB探针和山羊TaqMan MGB探针，在试管内，分别与待测样品DNA进行聚合酶链式反应，反应所加试剂有1xPCR缓冲液、MgCl2、dNTP、PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan MGB探针、GoldTaq DNA聚合酶、DNA样品，反应温度95℃，11分钟，40个循环，每个循环94℃ 30秒，65℃ 30秒，反应过程中实时测定试管内液体的相对荧光量。
文档编号C12Q1/68GK102146431SQ20101010143
公开日2011年8月10日 申请日期2010年1月27日 优先权日2010年1月27日
发明者计皖 申请人:宁夏鼎实生物鉴定中心(有限公司)