本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种mirna-6729-5p作为肺癌诊断标志物的应用。
背景技术：
通过基因芯片、高通量测序法和实时定量聚合酶链反应(qrt-pcr)等方法发现血液循环中的mirna对nsclc的诊断有较高价值。其中roth等发现血液中的mir-361-3p和mir-625有助于从良性肺部病变中识别恶性肺癌。而血液中mir-21的上调是诊断肺鳞状细胞癌的可靠生物学标志，肺腺癌患者血液中mir-200b-5p、mir-502-5p、mir-629、mir-17和mir-100较肺部肉芽肿患者和健康吸烟者明显增高。此外，rodriguez等发现肺部肿瘤患者血液中外泌体含有的mir-122-5p等mirna含量明显高于支气管肺泡灌洗液。munagala等发现肺癌外泌体中mir-21和mir-155升高对于肺癌复发诊断是潜在的生物学标志。
微小rna(microrna，mirna)作为一种在某些肿瘤中异常表达的非编码的小rna，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。然而，由于依靠组织活检来取得肿瘤组织再分析其mirna的方法具有创伤性，因此限制了其进一步的应用。外泌体(exosomes)是一种直径在50-90nm的亚细胞双层膜颗粒，其中含有mirna，且肿瘤在生长过程中还会不断地将外泌体释放到周围环境中去，因此检测体液外泌体及外泌体rna有助于肿瘤诊断和预后判断。taylor等首先提出通过检测血液外泌体mirna来诊断卵巢癌，并进一步用于判断预后。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供检测待测样本外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质的用途。
本发明提供了检测待测样本外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。
本发明还提供了检测待测样本外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。
上述应用中，所述待测样本为离体血清。
所述表达量为相对表达量，为相对于内参基因的表达量，内参基因为rnu6b。
上述应用中，所述检测待测样本外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质包括用于扩增mirna-6729-5p的引物对。
若mirna-6729-5p在待测样本外泌体中的表达显著高于在非肺癌样本中的表达，则待测样本为或候选为肺癌样本，反之，则不为或候选不为。
本发明还提供了检测待测人血清外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测人是否肺癌患者的产品中的应用。
本发明还提供了检测待测人血清外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测人是否肺癌患者的产品中的应用。
上述应用中，所述检测待测人血清外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质包括用于扩增mirna-6729-5p的引物对。
上述应用中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链dna分子和序列表中序列2所示的单链dna分子组成。
所述血清为离体血清。
本发明的另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，为上述检测待测样本外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质或所述检测待测人血清外泌体中mirna-6729-5p表达量的物质。
上述产品为如下1)-4)中任意一种：
1)诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品；
2)筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品；
3)诊断或辅助诊断所述待测人是否肺癌患者的产品；
4)筛查或辅助筛查所述待测人是否肺癌患者的产品。
mirna-6729-5p作为肺癌诊断标记物中的应用也是本发明保护的范围。
本发明为了建立利用外泌体进行肺癌诊断和预后判断生物标志物的方法，采用永生化的人支气管上皮细胞bep2d及α粒子辐射诱发该细胞发生癌变的细胞系berp35t44-1，分离外泌体，并利用mirna芯片技术获得了在癌变细胞系berp35t44-1细胞外泌体中表达明显增高的mirna，通过在肺癌细胞系a549致癌小鼠血液外泌体的验证，确定了mirna-6729-5p有望成为临床肺癌诊断的生物标志物。进一步在31例临床肺癌病人的血清中进行了检测，与正常人群相比，mirna-6729-5p表达均显著增高。mirna-6729-5p为临床肺癌诊断奠定基础，可用于制备诊断试剂盒。
附图说明
图1为mir-6729-5p在人肺癌血清中高表达。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与肺癌细胞相关的mirna的发现
永生化的人支气管上皮细胞bep2d记载在如下文献中：楼铁柱、项晓琼、吴德昌.238puα粒子诱发人支气管上皮细胞bep2d转化的初步研究.中国肺癌杂志，2000，3(6)：428-431.2；
肿瘤细胞berp35t44-1具有较高的血清抗性，较强的锚着独立生长能力，较快的增殖速度，且具有一定的迁移能力，记载在如下文献中：α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究；胡迎春；军事医学科学院，2003年中国人民解放军军事医学科学院的硕士论文。
1.细胞培养：bep2d细胞和berp35t44-1细胞培养于lhc-8无血清培养基中，置37c、5％co培养箱中传代培养。
2.外泌体的提取：收取107生长状态良好的bep2d及berp35t44-1细胞培养上清，采用多步差速离心法分离外泌体：4℃，300g离心10分钟去除细胞；4℃，2000g离心20分钟和4℃，10000g离心30分钟去除细胞碎片；最后，4℃，100000g超速离心60分钟所获得的沉淀即为外泌体。
3.外泌体的电镜分析：向外泌体沉淀中加入1mlpbs，吹打溶解后取20μl滴加于载样铜网上，室温静置1分钟，用滤纸从侧面吸干液体，再滴加2％磷钨酸溶液(ph6.8)30μl于铜网上，室温负染1分钟。滤纸吸干负染液，白炽灯下烤2分钟，透射电镜下观察照相。
4.外泌体rna的提取：向外泌体沉淀中加入500μltrizol试剂(美国invitrogen公司)提取总rna，得到bep2d细胞外泌体rna和berp35t44-1细胞外泌体rna。
用超微量分光光度计测定总rna浓度。以a260nm/a280nm比值评估纯度。为了确定提取出的总rna中有mirna存在，选用rnu6b为内参，利用实时荧光定量pcr的方法对总rna中的mirna进行检测。
5.mirna芯片实验：bep2d、berp35t44-1两种细胞的外泌体，共2个总rna样品进行mirna芯片实验。mirna芯片实验由lcsciences公司采用人的lcsciencesmicrornamicroarray-single基因表达谱芯片完成。
用人的lcsciencesmicrornamicroarray-single基因表达谱芯片(由杭州联川生物信息技术有限公司提供)检测bep2d细胞外泌体rna和berp35t44-1细胞外泌体rna，经检测后发现rna质量完好，进行标记杂交试验。杂交芯片经扫描仪扫描，数据信号提取，lowess过滤进行归一化处理以及差异表达分析等。得到人支气管上皮细胞bep2d外泌体基因表达谱和肿瘤细胞berp35t44-1外泌体基因表达谱。
比较两个基因表达谱，结果，与人支气管上皮细胞bep2d基因表达谱相比，肿瘤细胞berp35t44-1基因表达谱表达上调的mirna有140个，表达下调的mirna有169个。
从上调mirna中选择mirna-6729-5p：
mirna-6729-5p的核苷酸序列(5’端到3’端)：cgggcgugguggugggggug；进行qpcr验证，具体如下：
分别将bep2d细胞外泌体rna和berp35t44-1细胞外泌体rna反转录得到cdna作为模板，用引物(表1所示的序列)进行qpcr，结果如表2所示，可以看出，与bep2d细胞相比，mirna-6729-5p在berp35t44-1细胞外泌体中表达增高(表2)。
表1实时荧光定量pcr引物序列
qpcr具体条件：
反转录体系为：①在3μl的反应体系中加入总rna200ng、特异性引物(2μm)0.5μl，65℃孵育10min，冰浴3min；②再加入5×反转录缓冲液1μl、反转录混合液(invitrogen公司)0.4μl、无rna酶水0.6μl至总体积为5μl。反转录条件为：42℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。
实时荧光定量pcr反应体系包括：①cdna，0.5μl；②2×sybrgreenmix，10μl；③引物混合物(10μm)，0.8μl；④无rna酶水8.7μl至总体积为20μl。反应条件：50℃，2min；95℃，2min；95℃，15sec；60℃，30sec；共40个循环。用rnu6b做为内参照基因，实验数据以2-△△ct表示。
表2实时荧光定量pcr验证结果
实施例2、mirna-6729-5p在a549成瘤裸鼠血清中高表达
1.动物模型：肺癌细胞a549(
2.血清收集：采用眼眶取血的方法收集成瘤小鼠及对照裸鼠的全血并分离血清。
3.qpcr检测mirna-6729-5p的表达
分别提取成瘤小鼠血清和对照裸鼠血清外泌体的rna反转录得到cdna作为模板，qpcr检测方法与实施例1相同，结果如表3所示，可以看出，与对照裸鼠相比，mirna-6729-5p均在成瘤裸鼠血清中表达上调。
表3为mirna在成瘤裸鼠血清中表达情况
因此，mirna-6729-5p的表达情况可以作为肺癌诊断的辅助标准，若mirna-6729-5p在待测样本外泌体中的表达显著高于(变化倍数大于为2即为显著升高，本实验中变化倍数为13.2)非肺癌样本，则待测样本为或候选为肺癌样本，反之，则不为或候选不为。
实施例3、mirna-6729-5p的表达量在诊断肺癌患者中的应用
一、提取rna
肺癌患者血清来源：肺癌患者血清全部由解放军总医院提供，均为首诊肺癌，患者尚未接受过任何包括手术及放化疗等治疗。诊断明确，病理清楚。
正常对照血清来源：正常对照血清全部由解放军总医院体检中心提供，均为健康人群常规查体获得。
分别提取肺癌患者血清外泌体rna和正常对照血清外泌体的rna。
二、qpcr检测
将上述肺癌患者血清外泌体rna和正常对照血清外泌体rna作为模板，用实施例1的qpcr检测方法检测mirna-6729-5p在不同样本的表达。
结果如表4所示，可以看出，与正常对照血清相比，31例肺癌患者血清中的mirna-6729-5p表达量均上调，且显著提高。
表4为各样本中目的基因的表达量(相对于rnu6b的相对表达量)
用grampad软件表3的数据进行统计学处理，结果如图1所示。用sas软件对表3的数据进行统计学处理，结果如下表5-6所示：
表5为31例肺癌病人组mirna-6729-5p结果
表6为5例正常对照组mirna-6729-5p结果
不满足正态性，本例采用成组设计定量资料的秩和检验：z＝-3.4307，p＝0.0006，两组差别有统计学意义。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
<120>mirna-6729-5p作为肺癌诊断标志物的应用
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
aagcaatgggcgagggc17
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cagtgcagggtccgaggtat20