一种区分中国地方猪种和大白猪的分子标记SV193及其应用技术的制作方法

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分中国地方猪种和大白猪的分子标记及其应用技术。

背景技术：

我国拥有丰富的地方猪遗传资源，是世界猪遗传资源的重要组成部分。有证据显示，亚洲和欧洲大陆上野猪到家猪的驯化相对独立，使得两个地区的猪品种在生产性能和体型等方面各具特色。大白猪又称为大约克夏，原产于欧洲，是目前全球分布最广的猪种之一，并成为地方猪品种混杂的原因之一，在猪品种选择和繁育过程中，需要一种能够区分地方猪品种纯度的实用技术。

基因组水平上存在的大于1Kb的DNA片段的插入/缺失、重复、倒位、易位以及DNA拷贝数变异被称为结构变异。目前，在畜禽基因组学研究中，已检测到与表型变异相关的结构变异。例如，鸡的MHC classⅠ基因出现缺失型结构变异会影响鸡对马立克氏病的抵抗力；鸡EDN3基因内130Kb的重复导致黑色素过度沉积。本发明所述的结构变异主要指基因MAPK10的第8内含子中的一段序列发生缺失或不缺失的变异类型。

MAPK10又名JNK3，从属于促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)大家族中的JUN氨基末端激酶(JunN-terminal kinase,JNK)亚群，只表达于脑、心脏和睾丸等组织(汤丽平，2012)。JNK信号通路能够被多种胞外刺激因素激活，如细胞因子(TNF-α、IL-1等)、生长因子、应激(如紫外线照射、高渗透压)等，参与细胞的凋亡、增殖、代谢、运动及DNA损伤修复等多种生理过程；与多种疾病和病理损伤的发生发展密切相关，如肿瘤、神经退行性疾病、糖尿病等。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种区分中国地方猪种和大白猪的分子标记SV193及其应用技术。

本发明的技术方案是：一种区分中国地方猪种和大白猪的结构变异SV193，位于猪参考基因组Sscrofa 10.2的chr8:142093174-142093446，该结构变异有三种基因型，分别命名为AA、DA和DD型，其中AA为正常基因型、DD为纯合的缺失型、DA为杂合缺失型。

本发明还提供用于检测猪品种SV193缺失类型的一组引物，所述的引物分别为：上游引物F1：5’-CGGATTGAAGAAGCCCTGATG-3’，下游引物R1：5’-GAGCCTATCTCACACCCAAACAGT-3’，目的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。

本发明还提供猪群中检测所述结构变异SV193基因型的方法。

所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取大白猪、香猪、可乐猪、荣昌猪和萝卜猪的基因组DNA；

(2)以上述5个猪品种的基因组DNA为模板，分别利用引物F1、R1，进行PCR检测；

(3)1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断SV193的基因型。

步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，即：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L的引物F1、R1各0.3μL，ddH₂O 8.4μL，10ng/μL基因组DNA 1μL。进行PCR采用的反应条件：①预变性：94.0℃5min；②扩增反应：变性：94.0℃30sec，退火：56.0℃30sec，延伸：72.0℃45sec，35个循环；③72.0℃10min；4℃保存。

本发明进一步提供所述结构变异在区分中国地方猪种和大白猪中的应用技术。

前述的应用技术包括以下步骤：

(1)采用PCR技术检测结构变异SV193的基因型分布；

(2)应用SPSS v20.0进行卡方检验，分析大白猪和其它4个猪种在SV193分布频率是否有明显差异。

(3)根据结构变异SV193的基因型和等位基因频率的不同区分中国地方猪种和大白猪。

本发明所述结构变异SV193可作为区分大白猪和中国地方猪种的分子标记。

本发明的有益效果：(1)本发明提供的分子标记可不受猪的年龄、性别和饲养等因素的限制，可用于中国地方猪种和大白猪的个体选择。

(2)本发明所选的检测地方猪种的分子标记SV193方法准确可靠，操作简便。

附图说明

图1为本发明实施例1中SV193基因型分型结果；1、2、10泳道为AA基因型；3、4、5、7、8、9泳道为DA基因型；6泳道为DD基因型；

图2为本发明实施例2中S SV193在5个猪种间的基因频率分布。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1区分猪品种的分子标记SV193的检测技术，步骤如下：

1、基因组DNA的提取

本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

1)处理材料

提取材料为血液时，可直接使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液GA补足。

提取材料为动物组织时(脾组织用量应少于10mg)打碎处理为细胞悬浮液，然后10，000rpm(11，200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

注意：去除RNA，可加入4μL RNaseA溶液，振荡15sec，室温放置5min。

2)提取血液基因组时，加入20μL蛋白酶K，混匀，即可继续进行下一步；提取组织基因组时，加入蛋白酶K并混匀后，于56.0℃水浴2-4h(每小时混匀样品2～3次)直至组织块完全溶解；

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70.0℃水浴10min，可见溶液变清亮；

4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀；

5)将步骤4)所得的溶液和沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

8)重复操作步骤7)一次；

9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附柱中部悬空滴加50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min,12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再重复加入吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm离心2min；

12)基因组DNA放于4.0℃备用或-20.0℃保存。

2、目标序列的扩增

本发明中SV193区间位于chr8:142093174-142093446，参考NCBI Genbank收录的相应序列，使用Primer Premier 5.0软件设计两条特异性引物，上游引物F1：5’-CGGATTGAAGAAGCCCTGATG-3’，下游引物R1：5’-GAGCCTATCTCACACCCAAACAGT-3’，组合进行PCR检测，目的片段长度为996bp或723bp，测序后得出目标序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。

PCR所使用的扩增体系为20μL，计为：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L的上、下游引物取各取0.3μL，ddH₂O取8.4μL，10ng/μL基因组DNA取1μL。

进行PCR采用的反应条件：1)预变性：94.0℃5min；2)扩增反应：变性：94.0℃30sec，退火：56℃30sec，延伸：72.0℃45sec，35个循环；72.0℃10min；4℃保存。

3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断

PCR结束后，取4μL PCR产物经1.0％的琼脂糖电泳检测，0.5μg/mL溴乙锭染色，凝胶成像系统记录条带。

每个基因组，以引物F1、R1组合进行PCR检测。若扩增出单条带且大小为996bp，将基因型定义为AA型；若扩增两条带，一条带大小为996bp而另一条带为723bp，则基因型定义为DA型；若扩增出单条带而且大小为723bp，将基因型定义为DD型(图1)。

实施例2 SV193基因型与猪种类型的相关性与检测应用

按照实施例1所述的方法，以采自贵州从江县和清镇的香猪共415头、铜仁市江口县的萝卜猪46头、毕节市的可乐猪33头和大白猪77头以及重庆市荣昌县的荣昌猪43头为试验材料，以chr8:142093174-142093446为候选SV193缺失区间，利用PCR技术检测该SV193基因型在5个群体中的分布情况，应用SPSS v20.0软件中的卡方检验分析SV193基因型的差异关系。结果显示，(表1，图2)该SV193在大白猪和4个地方猪种中，基因型的分布频率差异极显著(P<0.001)。

表1 SV193的基因型和基因频率

备注：P<0.01表示差异极显著。