专利名称：控制水稻谷物产量,开花期及植株高度的多效性基因Ghd8的克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个影响水稻谷物产量，开花期及 植株高度多效性基因GhdS的克隆及应用。本发明对该具有巨大效益的数量性状位点基因 进行了精细定位，利用农杆菌介导的遗传转化，对该基因的功能进行了验证；同时构建了该 基因不同等位基因型的近等基因系，对该基因不同等位基因型的功能进行了验证。
背景技术：
目前，世界人口迫近70亿，其中一半人口以水稻作为主粮。要满足日益增长的人 口对粮食的需求，尤其在当今经济发展可耕地面积不断减少的情况下提高水稻的单位面积
产量具有重大意义。水稻产量是由多种因素共同影响的复杂农艺性状，其构成因子主要包括株高，穗 粒数，抽穗期，结实率，分蘖数，千粒重等。每穗实粒数是每穗颖花数和结实率决定的，而每 穗颖花数指每个稻穗上颖花的数目，直接决定水稻谷物产量。水稻的植株高度是重要的株 型指标，决定着水稻的抗倒伏性与生物学产量，并作用于水稻谷物产量，植株高度的改良亦 是理想株型育种的重要方面。在当前分子育种及转基因育种已经成为突破水稻产量瓶颈的 必然之选的情况下寻找控制每穗实粒数，抽穗期和株高的关键位点及至克隆相应基因并阐 明其遗传基础和分子机理，具有重大理论及实践意义。水稻的穗粒数，抽穗期及株高是一类受多基因控制的复杂性状，在分离后代中呈 现连续正态分布规律的表型变异。这些多基因被称作数量性状基因位点(quantitative trait loci，QTL)。产量等典型数量性状本身受多基因控制，很难在F2即出现单基因分离， 一般还需要构建遗传背景一致的近等基因系使目标性状呈现单基因控制的孟德尔分离。近 等基因系的构建分为高世代回交法(Ashikari et al. 2005 ；Fan et al. 2006)和基于性状 表现直接构建(Zhang et al.，2006)两种方法。本发明中近等基因系即是基于重组自交系 F7代中一个性状发生分离家系而构建。针对遗传基础复杂的数量性状基因的克隆，图位克隆依然是行之有效的方法。图 位克隆(map-basedcloning) 1986 年首先由剑桥大学的 Alan Coulson 提出(Coulson et al.，1986)，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基 因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分 子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。Yano等采用图位克隆法克隆了水稻抽穗期相关基因Hdl以来，尤其是水稻全基因 组序列释放后水稻抽穗期QTL克隆工作也取得了巨大的成绩。先后克隆抽穗期基因Hdl、 Hde^HdSa^Ehdl 等(Yano et al.，2000 ；Takahashi et al.，2001 ；Kojima et al.，2002 ； Kazuyuki Doi et al.，2004)。2005年第一个控制水稻穗粒数基因Gnla被克隆(AshikariM et al. , 2005)，利用包含约13，000个F2单株的分离群体将Gnla限定到6. 3kb的区域 并最终将此基因克隆。基因编码细胞分裂素氧化脱氢酶的基因(cytokinin oxidase/dehydrogenase, 0sCKX2)，该基因和绿色革命基因sdl的聚合育种显示了巨大的增产潜力。 薛为亚等(Xue et al.，2008)利用明恢63和珍汕97衍生的近等基因系克隆了位于水稻第 七染色体的抽穗期相关多效性基因Ghd7，研究证明其编码一个CO-LIKE基因。该基因使得 其近等基因系两种等位基因型在长日照条件下株高相差30cm，单株产量增幅达50% (Xue et al.，2008)，同时却也使得抽穗期延迟了 20天，降低了其生产应用价值。本发明利用基于性状差异的方法从HR5/ZS97衍生的重组自交系F7代的分离家系 RIL39中选取表型差异单株进行背景选择后杂交构建近等基因系。以此近等基因系为基础， 利用图位克隆方法，最终克隆了这个同时控制水稻开花期，株高穗粒数的多效性QTL，Ghd8。 该位点使得近等基因系两等位基因型之间单株产量由15. 1克增加至23. 8克，株高由78厘 米增加至98厘米，而抽穗期仅由77天增加至86天，生产应用潜力巨大。
发明内容
本发明目的在于克隆一个控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd8。 利用这个基因调控水稻的谷粒产量、抽穗期和株高性状，具有较好的应用前景。申请人将克 隆的这个基因命名为Ghd8。基因全长891bp (即SEQ ID NO 2)，编码一个含CCAAT结合结 构域的蛋白，全长296个氨基酸，其蛋白质的序列如SEQ ID NO :3所述。本发明是这样实现的利用水稻品种珍汕97 (ZS97)和HR5构建的重组自交系(以下简称RIL) F7代群体 分离家系(方法见Zhang et al.，2006)，从中挑选得到2种极端表型单株N15 (表现为小 穗，矮株，早花；N15材料见Zhanget al.，2006)，N16 (大穗，高株，晚花；N16材料见Zhang et al.，2006，)进行杂交，构建近等基因系(以下简称NIL)。从NIL-F2分离群体中极端 早花单株，利用分子标记将基因精细定位于一个70Kb的片段中。对该70Kb区段内的候 选基因(L0C_08g07740)进行测序，发现编码区存在差异，从9311BAC文库(购于Arizona Genomics Institute,石if 究中心网站 http //www. genome, arizona. edu/orders/direct, html ？ library = 0SI9Ba)中分离到一个包含该候选基因的长10. 26kb的序列(即SEQ ID NO :1)，连接至双元载体质粒PCAMBIA1301 (来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒)，采 用农杆菌介导转化方法，互补转化NIL-ZS97基因型植株(即N15单株)。转基因单株表现 与Ghd8NIL-HR5基因型(即N16单株)表现型极为相似。Ghd8被成功克隆。利用198份微核心种质品种进行GhdS主要变异位点(S1-S5)同水稻谷物产量，开 花期以及植株高度的关联分析。同时结合94份品种蛋白质序列单倍性聚类分析，构建不同 等位基因型的近等基因系对蛋白质功能进行了验证，找到了利于增产但不延迟开花的等位 基因型Ghd8-9311等位基因型(编码区序列如SEQID NO :2)及Ghd8_ruf等位基因型(编 码区序列如SEQ ID NO 8)；能增产且仅略微延迟生育期的GhdS-nip等位基因型(编码区 序列如SEQ ID NO 4)；增产的同时几乎不影响生育期的Ghd8-MH63等位基因型(编码区序 列如SEQ ID NO :6)，为育种改良提供了新的途径。本发明的优点在于(1)本发明利用一种基于性状表现的新方法构建了近等基因系，该方法简单，高 效，避免了多世代回交方法耗时的缺点。(2)本发明克隆了一个影响水稻谷粒产量，抽穗期和株高的一因多效基因Ghd8。该基因同时控制水稻开花期，株高及穗粒数，为同时改良水稻株型，产量及地区适应性提供 了新的思路及可能性。(3)利用关联分析方法对性状进行了剖分并以近等基因系材料进行验证，找到了 利用GhdS进行产量及地区适应性改良育种的途径(增产但不延迟开花)。针对不同地区或 季节，合理选用GhdS不同等位基因型，培育高产品种。
序列表SEQ ID NO 1是包含候选基因的序列，用于转化N15单株。序列表SEQ ID NO :2是Ghd8_9311等位基因(来源于水稻品种93-11)编码序列。序列表SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 13是Ghd8_9311等位基因编码氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 4是Ghd8_Nip (来源于水稻品种日本晴)、Ghd8_HR5 (来源于水 稻品种HR5)等位基因编码序列。序列表SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 10 是 Ghd8-Nip、Ghd8_HR5 等位基因编码氨基酸序列。序列表SEQ ID N0:6是Ghd8-MH63等位基因(来源于水稻品种明恢63)编码序 列。序列表SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 11是Ghd8_MH63等位基因编码氨基酸序列。序列表SEQ IDNO 8是Ghd8_ruf等位基因(来源于水稻品种0. rufipogon)编码 序列。序列表SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 12是Ghd8_ruf等位基因编码氨基酸序列。图1 是本发明分离克隆GhdS基因的总体技术路线图。图2 是本发明中近等基因系的性状表现图3:是本发明利用极端隐性单株精细定位GhdS图谱及基于双元载体 PCAMBIA1301的转化载体的构建图示，染色体以加粗黑线标示，黑线上方标示标记名称，对 应的数字表示重组时间，而黑色虚线方框表示已被纯合为HR5背景的染色体区段。图4 是本发明中近等基因系两种亲本(珍汕97、HR5)中候选基因氨基酸序列的 比对。图5 是本发明的近等基因系和转基因单株表现。NIL(ZS97)、NILZS97-分别为近 等基因系隐性亲本和转基因阴性单株，NIL(Hr97)、NILzS97+则是近等基因系显性亲本及转 基因阳性单株。图6 是本发明中用于检测基因型及基因测序的引物。
具体实施例方式以下实施例进一步定义本发明，并描述了 GhdS基因的分离克隆及功能验证。实施例1 :Ghd8基因的精细定位1、近等基因系构建及评价据图1的技术路线种植ZS97和HR5的重组自交系F7群体，发现RIL39号家系内 部出现抽穗期，株高，穗粒数等表型的分离(表1)。挑选其中矮株，早穗，小穗的W5单株与 高株，晚穗，大穗的N16号单株，参照Temnykh等已发表的水稻遗传连锁图谱(Temnykh et
5al.，2000 ；Temnykh et al.，2001)，选取了在N15，N16之间具有多态性的126个SSR标记 对进行背景筛选，同时对N15与N16单株衍生的F2群体进行QTL扫描(表2)，F2表型呈现 3 1分离，株高，穗大小，开花期共分离且低值性状为隐性(见附图2)。该QTL位于第八 染色体着丝粒区域，分子标记RM5432与RM547之间。该位点的近等基因系(称GhdSNIL) 构建完成。表1 N15，N16及其原始亲本HR5，ZS97的性状表现 表2近等基因系群体各种性状QTL效应 2.Ghd8基因的精细定位2006年的生长季节(5月至10月)在武汉种植包含2260个单株的Ghd8NIL_F2的 分离群体，选取其中极端早花的340个单株进行重组单株的筛选，分别以SSR标记RM547， RM310, RM5556, RM4085,冊5432(序列见图 6)及自创多态性标记 SNP3，SEQ3-1，SEQ5-1 (序 列见图6)筛选重组单株并最终将基因定位于一个70Kb的片段中(见图3)，与标记 seIfpro (序列见图6)共分离。3.候选基因的确定70Kb 候选区段包含一个编码 CCAAT-BOX Binding factor (CBF)蛋白的基因(L0C_ 0s08g07740)。据Orna Ben-Naim等的报道，CBF类基因参与了拟南芥开花调控，对候选基 因的进一步的比较测序发现，HR5与日本晴该区段基因具有相同的核苷酸序列，而GhdSNIL 两种等位基因型Ghd8-ZS97、Ghd8-HR5等位基因除了在启动子区域存在多处差异外，在编 码区离ATG第322碱基处存在一个移码突变使得Ghd8-ZS97等位基因编码氨基酸提前终止 (图4)，L0C_0s08g07740被认为是Ghd8的候选基因。实施例2 :Ghd8基因的分离与克隆根据预测的候选基因序列，扩增PCR片段筛选931IBAC文库，挑选出含有候选基因L0C_0s08g07740的克隆5(M15，利用限制性核酸内切酶SacI酶切阳性克隆，进行亚克隆，获 得一个10. 26K b的片断，该片段包含转录起始点上游3. 5kb和终止位点下游5. 7Kb的序列， 该片段内仅含有候选基因一个完整基因。将这个片段连接到双元载体PCAMBIA1301上(图3)，测序确定转化载体正确后，采 用农杆菌介导的遗传转化方法，得到转基因的水稻。本发明的转基因具体步骤如下正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到隐性基因型 (Ghd8-ZS97)植株愈伤中，经过愈伤诱导，继代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性 的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化 体系主要应用Hiei等人报道的方法(Hiei Y etal. , 1996)基础上进行优化。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧节青霉素)； KT (Kinet in, Mij] Μ) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS (Acetosringone, Zi lit T # Sll ) ；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate, /K I S S )； HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(IOX)配制)硝酸钾(KNO3)28. 3 克磷酸二氢钾(KH2PO4)4. 0 克硫酸铵((NH4)2SO4)4. 63 克硫酸镁(MgSO4· 7H20)1. 85 克氯化钙(CaCl2· 2H20)1. 66 克将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制碘化钾(KI)0. 08 克硼酸(H3BO3)0.16 克硫酸锰(MnSO4· 4H20)0. 44 克硫酸锌(ZnSO4· 7Η20)0. 15 克将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)将3. 73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20)和2. 78克FeSO4 · 7H20分别溶解， 混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70°C温浴2小时，4°C保存备用。4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)烟酸(Nicotinicacid)0. 1 克维生素Bl (Thiamine HCl)0. 1 克
7
维生素 B6 (Pyridoxine HCl) 0. 1 克
甘氨酸(Glycine)0. 2克
肌醇(Inositol)10克
加蒸馏水定容至1000毫升，4°C保存备用。
5) MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照IOX浓缩液配制)
硝酸铵(NH4NO3)16. 5 克
硝酸钾19.0 克
磷酸二氢钾1.7克
硫酸镁3. 7克
氯化钙4. 4克
将上述试剂在室温下溶角厍，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6) MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)
硫酸锰(MnSO4 · 4H20)2. 23 克
硫酸锌(ZnSO4 · 7H20)0. 86 克
硼酸(H3BO3)0. 62 克
碘化钾(KI)0. 083 克
钼酸钠(Na2MoO4 · 2H20)0. 025 克
硫酸铜(CuSO4 · 5H20)0. 0025 克
氯化钴(CoCl2 · 6H20)0. 0025 克
将上述试剂在室温下溶角厍，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制
秤取2，4-D 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10 3■升蒸馏水溶
解完全后定容至100毫升，于室温下保存。8) 6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶 解完全后定容至100毫升，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制称取NAA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解 完全后定容至100毫升，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解 完全后定容至100毫升，4°C保存备用。11)葡萄糖贮存液(0. 5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1. 5毫升离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液秤取氢氧化钾5. 6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121°C下灭菌25分钟， 下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
0104](3)用于水稻遗传转化的培养基配方0105]1)诱导培养基0106]N6max母液(取已经制备好的IOX浓缩液，下同)100毫升0107]N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升0108]Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升0109]维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升0110]2,4-D贮存液(取上述制备好的)2. 5毫升0111]脯氨酸(Proline)0. 3克0112]CH0.6克0113]蔗糖30克0114]Phytagel3克0115]加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
2)继代培养基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2，4-D贮存液 脯氨酸 CH 蔗糖
Phytagel
100毫升 10毫升 10毫升 10毫升 2.0毫升 0. 5克 0.6克 30克 3克
加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分
装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌c
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
3)预培养基
N6max 母液(IOX)
N6mix 母液(100X)
Fe2+EDTA 贮存液(100X)
维生素贮存液(100X)
2，4-D贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉
12. 5毫升
1.25毫升 2. 5毫升
2.5毫升 0. 75毫升
0.15 克 5克
1.75 克
加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口，按上述方法灭菌。 使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒 入培养皿中(25毫升/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X)12．5毫升[O140] N6mix母液(100X)1．25毫升
Fe“EDTA贮存液(100X)2．5毫升[O142] 维生素贮存液(100X)2．5毫升
2，4-D贮存液0．75毫升
CH0．2克
蔗糖5克
琼脂粉1．75克
加蒸馏水至250毫升，lN氢氧化钾调节pH值到5．6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升／每皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X)5毫升
N6mix母液(100X)0．5毫升[O152] Fe“EDTA贮存液(100X)0．5毫升[O153] 维生素贮存液(100X)l毫升
2，4-D贮存液0．2毫升[O155] CH0．08克[O156] 蔗糖2克[O157] 加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5．4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入l毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6)选择培养基[O159] N6max母液(10X)25毫升
N6mix母液(100X)2．5毫升
Fe“EDTA贮存液(100X)2．5毫升[O162] 维生素贮存液(100X)2．5毫升
2，4-D贮存液0．625毫升[O164] CH0．15克[O165] 蔗糖7．5克[O166] 琼脂粉1．75克[O167] 加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6．0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克／毫升)和400微升CN(250毫克／毫升)分装倒入培养皿中(25毫升／皿)。(注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克／升，潮霉素浓度为50毫克／升)第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克／升，潮霉素浓度为50毫克／升)。[O169] 7)预分化培养基[O170] N6max母液(10X)25毫升
N6mix母液(100X)2．5毫升[O172] Fe“EDTA贮存液(100X)2．5毫升0173]维生素贮存液(100X)2. 5毫升0174]6-BA贮存液0.5毫升0175]KT贮存液0.5毫升0176]NAA贮存液50微升0177]IAA贮存液50微升0178]CH0. 15 克0179]蔗糖7. 5克0180]琼脂粉1. 75 克0181]加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口，按上述方法灭菌。0182]使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫
分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。 8)分化培养基
N6max 母液(IOX)100 毫升
N6mix 母液(100X)10 毫升
Fe2+EDTA C存液(100X)10 毫升
维生素贮存液(100X)10毫升
6-BA贮存液2毫升
KT贮存液2毫升
NAA贮存液0. 2毫升
IAA贮存液0. 2毫升
CH1克
蔗糖30克 Phytagel
0183]
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
0191]
0192]
0193]
0194]
0195]
0196]
3克
加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到6. 0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按 上述方法灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(IOX)50毫升
MSmix母液(100X)5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)5毫升
维生素贮存液(100X)5毫升
蔗糖20克
Phytagel
0197]
0198]
0199]
0200] 0201] 0202]
0203]
0204]
0205]
3克
加蒸馏水至900毫升，用IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述
方法灭菌。
0206](4)农杆菌介导的遗传转化步骤
0207]3. 1愈伤诱导
0208]1)成熟的合江19，牡丹江8号，水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分
11钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；2)用灭菌水洗种子4-5次；3)将种子放在诱导培养基上；4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25士 1°C。3. 2愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温 度 25 士 1°C。3. 3预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度 25 士 1°C。3. 4农杆菌培养1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基配制方法参照J.萨姆布鲁克等， 分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002,北京)上预培养携带SEQ ID N0:1序列片段的农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天， 温度28 °C ；2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。3. 5农杆菌侵染1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；2)调节农杆菌的悬浮液至OD6tltl 0. 8-1. 0 ；3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20 "C。3. 6愈伤洗涤和选择培养1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；2)浸泡在含400毫克/升羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。3. 7 分化1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26°C。3. 8 生根1)剪掉分化时产生的根；2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田隔离环境，田间管理同 普通大田。经过互补转化至Ghd8_ZS97基因型材料后，转基因阳性单株出现开花期延迟，株 高增加及穗粒数增大的表现型(图5)。四个独立转化家系的结果皆证实转基因单株表型与 基因型共分离。种植Tl代，显示其中一个家系表现型出现1 3分离(26 76)，以基因内
12标记Z9M-1 (序列见图6)及gus染色均证实表型与基因型共分离，考种结果显示Ghd8-9311 等位基因转入Ghd8-ZS97基因型(隐性等位基因)植株后，表型得到了回复(表3)。由此， GhdS被成功克隆，本发明同时证实，通过转基因手段可以利用GhdS服务于产量育种。表3 GhdS近等基因系及互补转化转基因单株考种表 表3 注NIL(zs97)、NIL(Hr5)分别代表 Ghd8NIL 中 Ghd8_ZS97、Ghd8_HR5 等位基 因型植株，NILzs97-,NILzs97+分别代表转基因阴性、阳性植株实施例3 寻找区分产生的不同效应的GhdS等位基因型以 PCR 产物直接测序方法以引物 Ghd8-Sl，Ghd8_S2 Ghd8_S3，Ghd8_S4，Ghd8_S5 Ghd8-S16Ghd8-S7，Ghd8-S8共8对引物(引物序列参见图6)扩增Ghd8基因各区段，PCR产 物经SAP及EXOI于37°C消化1小时候后(消化反应体系8微升)，80°C变性，取2. 5微升消 化产物以ABI公司测序试剂盒进行测序扩增反应(第一步96°C2分钟变性，第二步96°C 10 秒变性，50°C复性，60°C延伸4分钟，此步重复33个循环，第三步4°C 10分钟)，扩增产物 以95%乙醇3M醋酸钠(pH4. 8) = 25 1进行沉淀，26微升每孔反应，沉淀15分钟后以 3000g转数离心收集沉淀，取上清后加入75微升70%乙醇洗涤，3000g离心10分钟后去上 清，晾干，加入7微升甲酰胺，96度3分钟变性后以ABI3730测序仪进行序列测定。序列经 过sequencherf. 1. 2进行序列的拼接。结合所有材料的表现型数据及序列以TASSEL软件 (Bradbury et al, . 2007)中的MLM进行关联分析，结果表明主要有5个位点(Si、S2、S3、 S4、S5)与抽穗期、产量相关性状紧密相关，其中S2和S5在2005、2006和2007三年实验中对 抽穗期都有显著的相关，位于Ghd8-MH63(编码氨基酸序列如SEQ ID NO :7)、Ghd8_9311 (编 码氨基酸序列如SEQ ID NO 3)、Ghd8-ruf (编码氨基酸序列如SEQ ID NO 9)编码第86位 氨基酸由GhdS-nip等位基因(编码氨基酸序列SEQ ID NO 5)的丝氨酸(Ser)替换为丙氨 酸(Ala)的变异，及174位甘氨酸重复次数的变异同时对抽穗期和产量在三年实验中都存 在显著相关(表4)。实施例4 :Ghd8不同等位基因的效应评价通过以水稻品种93-11、明恢63、日本晴和0. rufipogon为供体亲本，ZS97为轮回 亲本，回交3-6次，同时利用基因标记Ghd8-S4确定目的基因Ghd8的存在，再经过1_2次自 交，最终获得遗传背景基本一致(为ZS97)，GhdS纯合导入的一系列近等基因系(ZS979311， ZS97, ZS97nip，ZS97’。进行长短日处理比较发现Ghd8_9311等位基因型(编码区序列 如SEQ ID NO 2)及Ghd8-ruf等位基因型(SEQ ID NO 8)为强功能位点，延迟抽穗期并同 时大幅度提高穗粒数；而以Ghd8-nip等位基因型(编码区序列如SEQ IDNO 4)为代表为中 等功能位点，能提高产量同时在长日照条件下仅延迟生育期1. 5天，短日照条件下提前3. 4 天；而以Ghd8-MH63等位基因型(编码区序列如SEQ ID NO 6)为代表的一类等位基因型为
13弱功能位点，其在增产的同时对生育期影响极小，(表5)，该结果说明Ghd8-nip、Ghd8-MH63 等位基因型中在进化过程中演化出对育种改良有应用价值的有利等位变异。表4核苷酸位点差异与性状关联性分析 表5 GhdS不同等位基因型近等基因系在不同日照条件下表型
Ghd8-MH63、Ghd8-9311、Ghd8_ruf等位基因构建的近等基因系。“*”代表差异显著，“**”代 表差异极显著。)参考文献1. Ashikari M, sakakibara H,Lin S,et al. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science,2005,309(5735) :741_7452. Ben-Naim 0, Eshed R, Parnis A, et al.The CCAAT binding factor can mediate interactions betweenCONSTANS-like proteins and DNA. Plant J,2006,46(3) 462-4763.Bradbury PJ, Zhang Z, Kroon DE, et al. TASSEL software for association mapping of complex traits indiverse samples. Bioinformatics,2007,23 (19) 2633-26354. Coulson A, Sulston J, Brenner S, et al. Toward a physical map of the genome of the nematode Caenorhabditiselegans. Proc Natl Acad Sci USA,1986, 83(20) 7821-78255. Doi K,Izawa T,Fuse T,et al. Ehdl,a B~type response regulator in rice,confers short-day promotion offlowering and controls FT—like gene expression independently of Hdl. Genes Dev，2004，18(8) :926_9366.Fan C C，Xing Y Z,Mao H L，et al. GS3,a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grainwidth and thickness in rice， encodes a putative transmembrane protein. Theor Appl Genet，2006，112(6) : 1164-11717. Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal，1994，6(2) 271-2828. Kojima S，Takahashi Y，Kobayashi Y，et al. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene， promotestransition to flowering downstream of Hdl under short-day conditions. Plant Cell Physiol，2002，43 (10) :1096_11059. Takahashi Y，Shomura A，Sasaki T，et al. Hd6, a rice quantitative trait locus involved in photoperiodsensitivity, encodes the alpha subunit of protein kinase CK2. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98 (14) :7922_7927.10. Temnykh s，Park W D,Ayres N,et al. Mapping and genome ortanization of microsatellite sequences in rice(Oryza sativa L). Theor Appl Genet，2000，100 : 697-71211. Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，et al. Computational and experimental analysis of microsatellites inrice (Oryza sativa L) :frequency， length variation, transposon associations, and genetic marker potential. Genome Res，2001，ll(8) :1441_145212. Xue W，Xing Y,Weng X,et al. Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yieldpotentialin rice. Nat Genet，2008，40 (6) 761-76713.Yano M， Katayose Y， Ashikari M， et al.Hdl, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice， isclosely related to the Arabidopsis flowering time gene C0NSTANS. Plant Cell，2000，12 (12) :2473_248414. Zhang Y，Luo L，Xu C，et al. Quantitative trait loci for panicle size, heading date and plant heightco-segregating in trait-performance derived near-isogenic lines of rice (Oryza sativa). Theor Appl Genet，2006，113(2) 361-368
权利要求
Ghd8基因在控制水稻谷物产量，开花期以及植株高度中的应用，其特征在于，所述的Ghd8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述基因的等位基因GhdS-ruf在增加水稻谷物产量，开花期以及植株高 度中的应用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:8所示。
3.权利要求1所述基因的等位基因GhdS-ruf在增加水稻谷物产量，开花期以及植株高 度中的应用，其特征在于它的蛋白质序列如SEQ ID N0:9所示。
4.权利要求1所述基因的等位基因Ghd8-9311在增加水稻谷物产量，开花期以及植株 高度中的应用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
5.权利要求1所述基因的等位基因Ghd8-9311在增加水稻谷物产量，开花期以及植株 高度中的应用，其特征在于它的蛋白质序列如SEQ ID N0:3所示。
6.权利要求1所述基因的等位基因Ghd8-MH63在增加水稻谷物产量，不延长水稻开花 期及植株高度中的应用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:6所示。
7.权利要求1所述基因的等位基因Ghd8-MH63在增加水稻谷物产量，不延长水稻开花 期及植株高度中的应用，其特征在于它的蛋白质序列如SEQ ID N0:7所示。
8.权利要求1所述基因的等位基因GhdS-Nip在增加水稻谷物产量，双向改良水稻开花 期及植株高度中的应用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
9.权利要求1所述基因的等位基因GhdS-Nip增加水稻谷物产量，双向改良水稻开花期 及植株高度中的应用，其特征在于它的蛋白质序列如SEQ ID N0:5所示。
10.权利要求2-9任一等位基因在不同光照条件下作为提高水稻产量中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域。克隆得到一个影响水稻谷物产量，开花期及植株高度多效性基因Ghd8。通过构建目的基因的近等基因系，初步定位，比较测序和遗传转化互补等实验分离克隆到Ghd8基因(序列如SEQ ID NO2)。显性等位基因型单株比隐性等位基因型单株产量增加58％，株高增加25.6％，而抽穗期仅增加9天。利用Ghd8主要变异位点与性状关联分析及不同品种蛋白质序列单倍性聚类分析的结果，构建不同等位基因型的近等基因系，获得4种有利的Ghd8等位基因型。其中Ghd8-9311及Ghd8-ruf等位基因型，增产但不延迟开花，该基因适应于光温条件良好地区育种；Ghd8-MH63及Ghd8-Nip等位基因型不感光，适用于短日照条件地区增产育种。
文档编号C12N15/29GK101892246SQ20101022304
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者余四斌, 王鹏, 邢永忠, 鄢文豪 申请人:华中农业大学